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摘要
[目的]提高茶黄素生产的经济效益，降低生产成本。[方法]采用单因素试验探索了茶多酚与丰水梨质量比从1∶1～1∶50的反应比例条件，10～25 ℃的温度条件，3.5～6.5的pH条件，以及20～60 min的反应时间对多酚氧化酶氧化茶多酚的影响。采用正交试验，研究了酶与底物质量比、温度、时间、pH 4个因素对丰水梨多酚氧化酶（PPO）氧化茶多酚形成茶黄素的影响。[结果]单因素试验结果显示，经组内比较，反应比例1∶40、反应温度20 ℃、pH 5.5、反应时间40 min下所得产物，用高精度测色仪检测，a值最大，红色最深。正交试验结果表明，4 个因素对茶多酚的氧化均有显著影响。其中，对茶多酚氧化的影响程度依次为质量比>时间>pH>温度，最佳组合为茶多酚与酶源质量比1∶40，温度20 ℃，pH 5.5，氧化时间40 min，茶多酚的转化率为45.70%。[结论]该研究可为寻求低成本的茶黄素生成途径提供依据。
关键词 丰水梨；多酚氧化酶；茶多酚 ；茶黄素
中图分类号 S661.2；Q946.81+1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03395-04
Abstract [Objective] To improve the economic benefit of theaflavins production and reduce production cost. [Method] By using single factor experiment， effects of tea polyphenols and HSBC pear ratio from 1∶1 to 1∶50， temperature from 10 to 25 ℃， pH from 3.5 to 6.5， and the reaction time from 20 min to 60 min on oxizizing polyphenols with polyphenol oxidase were explored. [Result] The results of single factor experiment showed： in the within group comparisons， the products of the reaction ratio of 1∶40， reaction temperature 20 ℃， pH 5.5， reaction time 40 min has the largest a value and the deepest red wich was defined by the high accuracy of color measurement instrument. The design of multifactor orthogonal experiment was applied to investigate the effects of temperature，pH value and time on the tea polyphenols being oxidized into Theaflavins by the PPO of HSBC pear.The 4 factors and 3 levels orthogonal test results showed that： 4 factors all have influence on oxidation of tea polyphenols. Among them， the order of influence degree of the oxidation of tea polyphenols are：quality ratio >time > pH> temperature. The optimal combination ： tea polyphenols to enzyme source 1∶40 in quality ， temperature 20 ℃， pH value 5.5， reaction time 40 min.The rate of conversion of tea polyphenols is 45.70%. [Conclusion] The study can provide reference for seek low cost production way of theaflavins.
Key words HSBC pear； Polyphenol oxidase； Polyphenols； Theaflavins
多酚氧化酶（polyphenol oxidase， PPO）又称儿茶酚氧化酶[1]，丰水梨含有较高活性的PPO，天然状态下与内囊体膜结合在一起无活性，但将组织匀浆或损伤后酶活被活化，从而表现出活性[2]。茶多酚（tea polyphenols，TP）中的主要成分儿茶素类主要包括表没食子儿茶素（Epigallocatechin， EGC）、表儿茶素（Epicatechin，EC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（Epicatechin gallate， ECG）[3]。这4种儿茶素在多酚氧化酶（PPO）的作用下氧化缩合形成对应种类的茶黄素TF、TF2a、TF2b、TF3，颜色从淡黄色变成红色[4]。
茶黄素（theaflavins，TFs）具有多种药理功能与保健功效，如降血脂、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗突变、抗癌防癌等[5-8]，某些功能方面甚至优于儿茶素[9]，所以其在食品、医药保健等领域的作用也越来越突出[10]。目前对茶黄素的制备主要分为酶促氧化和化学氧化系统[11-12]。笔者采用L9（43）正交试验研究酶源与底物比例、温度、pH、时间对茶多酚氧化程度的影响，筛选出4个因素的最优组合，从而提高茶黄素生产的经济效益，降低生产成本。 1 材料与方法
1.1 材料
原料：
丰水梨，山东烟台。
主要试剂：茶多酚，四川富正源生物科技有限公司，批号TPH30523C1；乙酸乙酯、柠檬酸、柠檬酸钠等，均为分析纯。
主要设备仪器：UV2100型紫外可见分光光度计，上海尤尼克柯仪器有限公司；Datacolor 400 高精度台式分光光度测色仪；安捷伦1260高效液相色谱仪；RE52CS 旋转蒸发仪；发酵罐；MJBL25C3搅拌机，广东美的精品电器制造有限公司等。
1.2 方法
1.2.1
单因素试验。
取TPH30523C1批号的茶多酚10.00 g作为反应底物。分别取梨10、50、100、150、200、250、300、350、400 g，用搅拌机匀浆（1 min）。分别将底物与酶的混合物置于发酵罐中，25 ℃（实验室温度）、pH 4.8[13]（柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调制，丰水梨浆液pH）、通空气量0.6 L/min、搅拌速度300 r/min的条件下反应40 min[11]。产物经100 ℃沸水迅速灭酶（保证反应时间的一致性）。将混合液经2层纱布过滤，滤液经等体积乙酸乙酯萃取3次，取上层红色液体，经低压旋转蒸发仪浓缩后转入真空干燥箱干燥（40 ℃，1 h）得到红色固体粉末。将红色固体粉碾压均匀得到均匀的固体粉末。以上试验均重复3次。
选取以上试验获得的最佳反应比例分别在温度10、15、20、25 ℃；pH 3.5、4.5、5.5、6.5（柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液）、通空气量0.6 L/min、搅拌速度300 r/min的条件下反应20、30、40、50、60 min。反应后产物的处理与反应比例筛选试验保持一致。 按上述条件反应后，所得产物的处理与单因素试验操作保持一致。
1.3 测定内容及方法
1.3.1
单因素试验。
单因素试验所得产物以反应前茶多酚作为对照，采用高精度测色仪测定产物的色度值，以a（a值表示红绿，+表示偏红，-表示偏绿，a值越大，产物红色越深）值作为判定依据；采用比色法测定产物的吸光值（A），从而得知总酚的含量。
1.3.2
正交试验。
以反应前茶多酚作为对照，采用高精度测色仪测定产物的色度值，以a值作为判定依据；采用比色法测定产物的吸光值（A）；采用高效液相色谱法，测定4种儿茶素的浓度变化。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1
产物色度值。由图1可见，茶多酚与酶源质量比为1∶40时，所得产物a值最大；茶多酚与酶源质量比从1∶1到1∶40的反应比例条件下制备的产物a值呈现不同程度的递增趋势，而从1∶40到1∶50则呈现递减趋势。由图2可见，pH为5.5时产物a值最大，pH较低时对产物a值的影响小于pH较大时。由图3可见，反应时间为40 min时所得产物a值最大，且反应时间不足对a值影响大于反应时间过度对a值的影响。
利用天然来源的PPO制备茶黄素既经济又高效，这对寻求低成本的茶黄素生产途径具有重要意义。
参考文献
[1]
邬显章.酶的工业生产技术[M].长春：吉林科学技术出版社，1988.
[2] TOLBERT N E.Activation of polyphenol oxidase of chloroplasts[J].Plant Physiol，1973，51：575-580.
[3] 宛晓春.茶叶生物化学[M].3版.北京：中国农业出版社，2003：9210，30231，225-227，250-251.
[4] 李大祥，宛晓春，杨昌军，等.茶儿茶素氧化机理[J].天然产物研究与开发，2006，18（1）：171-181.
[5] 杜棋珍，江和源.茶色素的药理及应用阴[J].中国茶叶，1997，19（5）：36-37.
[6] STEELE V E，KELLOFF G J，BALETITINE D，et al.Comparativechemopreventivemechanism of green tea，black tea and sekected polyphenol[J].Carcinogenesis，2000，21（1）：63-67.
[7] 金恩慧，吴媛媛，屠幼英，等.茶黄素抑菌作用的研究[J].中国食品学报，2011，11（6）：108-117.
[8] 刘伟，周洁，龚正礼.茶黄素的功能活性研究进展[J].食品科学，2013（11）：394-399.
[9] 谢笔均.绿茶、乌龙茶、红茶中主要成分和酚类化合物抑制脂肪氧合酶活性和抗油脂自动氧化特性的研究[J].天然产物研究与开发，1994（4）：20-23.
[10] 潼野庆则，今川.茶叶儿茶酚氧化机制的研究[J].日本农艺学会志，1963（37）：417
[11] 萧伟祥.茶红色素形成机理和制取[J].茶叶科学，1997，17（1）：1-8.
[12] 姚立虎，NURSTEN H E.表儿素没食子酸及表没食子儿茶素没食子酸酯单体化学氧化研究[J].食品与发酵工业，1997，23（5）：21-25.
[13] 谷记平，刘仲华，黄建安，等.单双液相下不同多酚氧化酶对酶性合成茶黄素的影响[J].茶叶科学，2007（1）：176-182.
[目的]提高茶黄素生产的经济效益，降低生产成本。[方法]采用单因素试验探索了茶多酚与丰水梨质量比从1∶1～1∶50的反应比例条件，10～25 ℃的温度条件，3.5～6.5的pH条件，以及20～60 min的反应时间对多酚氧化酶氧化茶多酚的影响。采用正交试验，研究了酶与底物质量比、温度、时间、pH 4个因素对丰水梨多酚氧化酶（PPO）氧化茶多酚形成茶黄素的影响。[结果]单因素试验结果显示，经组内比较，反应比例1∶40、反应温度20 ℃、pH 5.5、反应时间40 min下所得产物，用高精度测色仪检测，a值最大，红色最深。正交试验结果表明，4 个因素对茶多酚的氧化均有显著影响。其中，对茶多酚氧化的影响程度依次为质量比>时间>pH>温度，最佳组合为茶多酚与酶源质量比1∶40，温度20 ℃，pH 5.5，氧化时间40 min，茶多酚的转化率为45.70%。[结论]该研究可为寻求低成本的茶黄素生成途径提供依据。
关键词 丰水梨；多酚氧化酶；茶多酚 ；茶黄素
中图分类号 S661.2；Q946.81+1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03395-04
Abstract [Objective] To improve the economic benefit of theaflavins production and reduce production cost. [Method] By using single factor experiment， effects of tea polyphenols and HSBC pear ratio from 1∶1 to 1∶50， temperature from 10 to 25 ℃， pH from 3.5 to 6.5， and the reaction time from 20 min to 60 min on oxizizing polyphenols with polyphenol oxidase were explored. [Result] The results of single factor experiment showed： in the within group comparisons， the products of the reaction ratio of 1∶40， reaction temperature 20 ℃， pH 5.5， reaction time 40 min has the largest a value and the deepest red wich was defined by the high accuracy of color measurement instrument. The design of multifactor orthogonal experiment was applied to investigate the effects of temperature，pH value and time on the tea polyphenols being oxidized into Theaflavins by the PPO of HSBC pear.The 4 factors and 3 levels orthogonal test results showed that： 4 factors all have influence on oxidation of tea polyphenols. Among them， the order of influence degree of the oxidation of tea polyphenols are：quality ratio >time > pH> temperature. The optimal combination ： tea polyphenols to enzyme source 1∶40 in quality ， temperature 20 ℃， pH value 5.5， reaction time 40 min.The rate of conversion of tea polyphenols is 45.70%. [Conclusion] The study can provide reference for seek low cost production way of theaflavins.
Key words HSBC pear； Polyphenol oxidase； Polyphenols； Theaflavins
多酚氧化酶（polyphenol oxidase， PPO）又称儿茶酚氧化酶[1]，丰水梨含有较高活性的PPO，天然状态下与内囊体膜结合在一起无活性，但将组织匀浆或损伤后酶活被活化，从而表现出活性[2]。茶多酚（tea polyphenols，TP）中的主要成分儿茶素类主要包括表没食子儿茶素（Epigallocatechin， EGC）、表儿茶素（Epicatechin，EC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（Epicatechin gallate， ECG）[3]。这4种儿茶素在多酚氧化酶（PPO）的作用下氧化缩合形成对应种类的茶黄素TF、TF2a、TF2b、TF3，颜色从淡黄色变成红色[4]。
茶黄素（theaflavins，TFs）具有多种药理功能与保健功效，如降血脂、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗突变、抗癌防癌等[5-8]，某些功能方面甚至优于儿茶素[9]，所以其在食品、医药保健等领域的作用也越来越突出[10]。目前对茶黄素的制备主要分为酶促氧化和化学氧化系统[11-12]。笔者采用L9（43）正交试验研究酶源与底物比例、温度、pH、时间对茶多酚氧化程度的影响，筛选出4个因素的最优组合，从而提高茶黄素生产的经济效益，降低生产成本。 1 材料与方法
1.1 材料
原料：
丰水梨，山东烟台。
主要试剂：茶多酚，四川富正源生物科技有限公司，批号TPH30523C1；乙酸乙酯、柠檬酸、柠檬酸钠等，均为分析纯。
主要设备仪器：UV2100型紫外可见分光光度计，上海尤尼克柯仪器有限公司；Datacolor 400 高精度台式分光光度测色仪；安捷伦1260高效液相色谱仪；RE52CS 旋转蒸发仪；发酵罐；MJBL25C3搅拌机，广东美的精品电器制造有限公司等。
1.2 方法
1.2.1
单因素试验。
取TPH30523C1批号的茶多酚10.00 g作为反应底物。分别取梨10、50、100、150、200、250、300、350、400 g，用搅拌机匀浆（1 min）。分别将底物与酶的混合物置于发酵罐中，25 ℃（实验室温度）、pH 4.8[13]（柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调制，丰水梨浆液pH）、通空气量0.6 L/min、搅拌速度300 r/min的条件下反应40 min[11]。产物经100 ℃沸水迅速灭酶（保证反应时间的一致性）。将混合液经2层纱布过滤，滤液经等体积乙酸乙酯萃取3次，取上层红色液体，经低压旋转蒸发仪浓缩后转入真空干燥箱干燥（40 ℃，1 h）得到红色固体粉末。将红色固体粉碾压均匀得到均匀的固体粉末。以上试验均重复3次。
选取以上试验获得的最佳反应比例分别在温度10、15、20、25 ℃；pH 3.5、4.5、5.5、6.5（柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液）、通空气量0.6 L/min、搅拌速度300 r/min的条件下反应20、30、40、50、60 min。反应后产物的处理与反应比例筛选试验保持一致。 按上述条件反应后，所得产物的处理与单因素试验操作保持一致。
1.3 测定内容及方法
1.3.1
单因素试验。
单因素试验所得产物以反应前茶多酚作为对照，采用高精度测色仪测定产物的色度值，以a（a值表示红绿，+表示偏红，-表示偏绿，a值越大，产物红色越深）值作为判定依据；采用比色法测定产物的吸光值（A），从而得知总酚的含量。
1.3.2
正交试验。
以反应前茶多酚作为对照，采用高精度测色仪测定产物的色度值，以a值作为判定依据；采用比色法测定产物的吸光值（A）；采用高效液相色谱法，测定4种儿茶素的浓度变化。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1
产物色度值。由图1可见，茶多酚与酶源质量比为1∶40时，所得产物a值最大；茶多酚与酶源质量比从1∶1到1∶40的反应比例条件下制备的产物a值呈现不同程度的递增趋势，而从1∶40到1∶50则呈现递减趋势。由图2可见，pH为5.5时产物a值最大，pH较低时对产物a值的影响小于pH较大时。由图3可见，反应时间为40 min时所得产物a值最大，且反应时间不足对a值影响大于反应时间过度对a值的影响。
利用天然来源的PPO制备茶黄素既经济又高效，这对寻求低成本的茶黄素生产途径具有重要意义。
参考文献
[1]
邬显章.酶的工业生产技术[M].长春：吉林科学技术出版社，1988.
[2] TOLBERT N E.Activation of polyphenol oxidase of chloroplasts[J].Plant Physiol，1973，51：575-580.
[3] 宛晓春.茶叶生物化学[M].3版.北京：中国农业出版社，2003：9210，30231，225-227，250-251.
[4] 李大祥，宛晓春，杨昌军，等.茶儿茶素氧化机理[J].天然产物研究与开发，2006，18（1）：171-181.
[5] 杜棋珍，江和源.茶色素的药理及应用阴[J].中国茶叶，1997，19（5）：36-37.
[6] STEELE V E，KELLOFF G J，BALETITINE D，et al.Comparativechemopreventivemechanism of green tea，black tea and sekected polyphenol[J].Carcinogenesis，2000，21（1）：63-67.
[7] 金恩慧，吴媛媛，屠幼英，等.茶黄素抑菌作用的研究[J].中国食品学报，2011，11（6）：108-117.
[8] 刘伟，周洁，龚正礼.茶黄素的功能活性研究进展[J].食品科学，2013（11）：394-399.
[9] 谢笔均.绿茶、乌龙茶、红茶中主要成分和酚类化合物抑制脂肪氧合酶活性和抗油脂自动氧化特性的研究[J].天然产物研究与开发，1994（4）：20-23.
[10] 潼野庆则，今川.茶叶儿茶酚氧化机制的研究[J].日本农艺学会志，1963（37）：417
[11] 萧伟祥.茶红色素形成机理和制取[J].茶叶科学，1997，17（1）：1-8.
[12] 姚立虎，NURSTEN H E.表儿素没食子酸及表没食子儿茶素没食子酸酯单体化学氧化研究[J].食品与发酵工业，1997，23（5）：21-25.
[13] 谷记平，刘仲华，黄建安，等.单双液相下不同多酚氧化酶对酶性合成茶黄素的影响[J].茶叶科学，2007（1）：176-182.