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目的 探讨1例临床出血表现与凝血因子Ⅷ活性(FⅧ:C)检测结果明显不符的血友病A患者表型、基因型诊断及其分子发病机制。方法 凝血、抗凝及纤溶相关指标检测，一步法及发色底物法检测FⅧ:C，ELISA法检测FⅧ的抗原(FⅧ:Ag)。活化部分凝血活酶时间(APTT)纠正实验筛查FⅧ抑制物;PCR扩增先证者F8基因的所有外显子及其侧翼序列，利用直接核苷酸测序法进行基因序列分析。针对先证者的基因突变位点，对其家系成员进行相应外显子基因检测;定点突变法构建B亚基缺失(760aa～1639aa)的人FⅧHis99Arg和His99Ala两种突变的表达质粒(pRC/RS Ⅴ-BDhFⅦcDNA)，两种突变质粒分别瞬时转染HEK293T细胞，测定细胞上清液中的FⅧ:C和细胞上清液及裂解液中的FⅧ:Ag。结果 先证者APTT 延长，一步法及发色底物法检测的F Ⅷ:C均低于1.0％，血浆FⅧ:Ag为120.0％。APTT纠正试验阴性，其他凝血、抗凝及纤溶相关检测均未见异常。诊断为交叉反应阳性(CRM+)的血友病A。患者F8基因直接核苷酸测序发现3号外显子存在28828A→G突变，导致His99Arg氨基酸改变，其母亲该位点为杂合突变。体外表达研究结果显示细胞上清液中His99Arg突变蛋白FⅧ:Ag及FⅧ:C分别为野生型的180.0％及5.8％，His99Ala突变蛋白FⅧ:Ag及F Ⅷ:C分别为野生型的45.0％和20.0％。Western blot显示，His99Arg突变质粒表达上清液中FⅧ蛋白含量较野生型明显增高，而His99Ala突变质粒表达上清液FⅧ蛋白含量较野生型减少。提示His99Arg为CRM+血友病A突变而His99Ala为CRM-血友病A突变。结论 体外检测发现His99Arg和His99Ala两种FⅧ能够表达，但常规凝血检测Hi99Arg突变FⅧ基本无功能，而His99Ala凝血功能也降低。