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摘 要：用标准曲线法测定硫酸巴龙霉素片的抗生素效价，其浓度在0.82-4.88u/mL 范围内抑菌圈清晰，标准品抑菌圈直径与中心浓度抑菌圈的差与抗生素浓度对数线性关系良好r=0.9992，结果重现性好，效果满意。
关键词：标准曲线法 抗生素效价 硫酸巴龙霉素片
硫酸巴龙霉素是氨基糖苷类抗生素。参照中华人民共和国药典2010年版二部规定的二剂量或三剂量法测定其生物效价的方法，利用标准曲线测定该抗生素效价，并对该方法进行验证。
一、材料与试剂
1.仪器和设备
ZY-300Ⅳ多功能微生物自动测量分析仪（；HH.BII.600-S电热恒温培养箱；MS电子天平；直径90mm培养皿；牛津杯；陶瓦盖；钢圈放置器等。
2.试剂和药品
磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，抗生素检定培养基I，枯草芽孢杆菌（[CMCC（B）63 501]）。
二、方法与结果
1.磷酸盐缓冲液（pH7.8）的配制
取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g加水至1000ml，过滤，在115℃条件下灭菌30分钟，备用。
2.枯草芽孢杆菌菌悬液的制备
取枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35-37℃下培养7天，用革兰染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
3.培养皿的制备
取直径约90mm，高16-17mm的平底培养皿，分别注入加热融化的备用培养基20mL，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层；另取备用培养基，适量加热融化后，放冷至60℃ ，加入备用的枯草芽孢杆菌菌悬液适量（能使抑菌圈边缘清晰，使标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径为15-18mm）摇匀，在每一培养皿中分别加入上述菌悬液5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。用钢圈放置器在每一平皿中以等距离均匀放置牛津杯4个，用陶瓦圆盖覆盖。
4.标准曲线的制备
4.1选择中心浓度：中心浓度选择：根据抗生素的对数浓度与抑菌圈关系的线性范围，选择中心浓度C0=2 u/mL。
4.2标准溶液浓度确定：各剂量按等比级数稀释，剂距为1：0.8，计算中心剂量邻近的高低2个浓度，再分别计算各剂量的浓度，各种浓度分别为C1： 0.82u/mL，C2： 1.02u/mL，C3： 1.28u/mL，C4： 1.6u/mL，C5： 2.5u/mL，C6： 3.13u/mL，C7：3.91u/mL，C8：4.88u/mL。
硫酸巴龙霉素标准溶液的制备：精密称取硫酸巴龙霉素标准品，用磷酸盐缓冲液稀释成1000u/mL的溶液，精密吸取4mL于100mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液定容稀释成40u/mL，再分别吸取2.5mL，1.02mL，1.28mL，1.60mL，2.0 mL，3.13mL，3.91mL，4.88 mL，6.1mL至50ml容量瓶中，用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，分别制成中心浓度和各浓度的标准溶液。
4.3标准曲线的绘制：取制备完毕的培养皿32个，分为8组，每组4个，组内各培养皿内间隔的3个牛津杯中分别滴加C1-8溶液各200uL，另三个牛津杯滴加中心浓度溶液2 u/mL 200ul，在35-37℃电热恒温培养箱中培养14-16小时后，用微生物测量分析仪分别测量每个培养皿中抑菌圈的直径。分别求得每组6个培养皿中心浓度C0所得的抑菌圈平均直径y0和各浓度标准溶液所得的抑菌圈平均值yk，设fk=yk-y0，计算可得则8组培养皿的反应参数（见表1）。以相应抗生素浓度的对数值为纵坐标，fk为横坐标，绘制标准曲线图（见图1）；经计算，得到回归曲线方程y = 0.3218x + 0.299 ，相关系数r=0.9992。
表1 硫酸巴龙霉素标准曲线试验数据
表2 样品测定结果（%，n=6）
4.4供试品的测定：取中心浓度的标准溶液，并取供试品预估效价后，研细精密称取适量，加磷酸盐缓冲液灭菌水制成1000u/mL溶液，摇匀，静置，精密量取上清液适量，用磷酸盐缓冲液灭菌水稀释成与标准品中心浓度相同的供试液。取准备好的放置6只牛津杯的培养皿6个，在每一双碟中，间隔的3只牛津杯中分别滴满中心浓度的标准液，另3只牛津杯中滴满供试液。在35-37℃下培养14-16小时后，测量各抑菌圈的直徑。分别求得标准液抑菌圈的直径，再求得标准液抑菌圈直径平均值 和供试液抑菌圈直径的平均值 ，算出的差数fk。据此在标准曲线上读取供试液的浓度，即可转换成供试品所含效价u·mL-1，也可以代入直线回归方程，算出供试品的效价。
样品效价测定结果：用此法测定硫酸巴龙霉素片（批号分别为20130707、20130708、20130709、20130710），并与二剂量法比较，结果见表2。
4.5重现性试验：取硫酸巴龙霉素片（批号为20130710），按本法测定8 份，其平均值为99.0%，RSD=1.21% 。
三、讨论
本法测定硫酸巴龙霉素片效价，选标准品中心浓度为2.0u/mL，加菌液适量，直径在18-22mm的抑菌圈边缘清晰。
本法与二剂量法比较，结果无显著差异，虽操作烦琐，但结果准确，重现性较好。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版（二部）[M]北京：化学工业出版社，2010：966，附录93-98
[2]马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册[M] 北京：科学出版社，2001：231-234
关键词：标准曲线法 抗生素效价 硫酸巴龙霉素片
硫酸巴龙霉素是氨基糖苷类抗生素。参照中华人民共和国药典2010年版二部规定的二剂量或三剂量法测定其生物效价的方法，利用标准曲线测定该抗生素效价，并对该方法进行验证。
一、材料与试剂
1.仪器和设备
ZY-300Ⅳ多功能微生物自动测量分析仪（；HH.BII.600-S电热恒温培养箱；MS电子天平；直径90mm培养皿；牛津杯；陶瓦盖；钢圈放置器等。
2.试剂和药品
磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，抗生素检定培养基I，枯草芽孢杆菌（[CMCC（B）63 501]）。
二、方法与结果
1.磷酸盐缓冲液（pH7.8）的配制
取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g加水至1000ml，过滤，在115℃条件下灭菌30分钟，备用。
2.枯草芽孢杆菌菌悬液的制备
取枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35-37℃下培养7天，用革兰染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
3.培养皿的制备
取直径约90mm，高16-17mm的平底培养皿，分别注入加热融化的备用培养基20mL，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层；另取备用培养基，适量加热融化后，放冷至60℃ ，加入备用的枯草芽孢杆菌菌悬液适量（能使抑菌圈边缘清晰，使标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径为15-18mm）摇匀，在每一培养皿中分别加入上述菌悬液5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。用钢圈放置器在每一平皿中以等距离均匀放置牛津杯4个，用陶瓦圆盖覆盖。
4.标准曲线的制备
4.1选择中心浓度：中心浓度选择：根据抗生素的对数浓度与抑菌圈关系的线性范围，选择中心浓度C0=2 u/mL。
4.2标准溶液浓度确定：各剂量按等比级数稀释，剂距为1：0.8，计算中心剂量邻近的高低2个浓度，再分别计算各剂量的浓度，各种浓度分别为C1： 0.82u/mL，C2： 1.02u/mL，C3： 1.28u/mL，C4： 1.6u/mL，C5： 2.5u/mL，C6： 3.13u/mL，C7：3.91u/mL，C8：4.88u/mL。
硫酸巴龙霉素标准溶液的制备：精密称取硫酸巴龙霉素标准品，用磷酸盐缓冲液稀释成1000u/mL的溶液，精密吸取4mL于100mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液定容稀释成40u/mL，再分别吸取2.5mL，1.02mL，1.28mL，1.60mL，2.0 mL，3.13mL，3.91mL，4.88 mL，6.1mL至50ml容量瓶中，用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，分别制成中心浓度和各浓度的标准溶液。
4.3标准曲线的绘制：取制备完毕的培养皿32个，分为8组，每组4个，组内各培养皿内间隔的3个牛津杯中分别滴加C1-8溶液各200uL，另三个牛津杯滴加中心浓度溶液2 u/mL 200ul，在35-37℃电热恒温培养箱中培养14-16小时后，用微生物测量分析仪分别测量每个培养皿中抑菌圈的直径。分别求得每组6个培养皿中心浓度C0所得的抑菌圈平均直径y0和各浓度标准溶液所得的抑菌圈平均值yk，设fk=yk-y0，计算可得则8组培养皿的反应参数（见表1）。以相应抗生素浓度的对数值为纵坐标，fk为横坐标，绘制标准曲线图（见图1）；经计算，得到回归曲线方程y = 0.3218x + 0.299 ，相关系数r=0.9992。
表1 硫酸巴龙霉素标准曲线试验数据
表2 样品测定结果（%，n=6）
4.4供试品的测定：取中心浓度的标准溶液，并取供试品预估效价后，研细精密称取适量，加磷酸盐缓冲液灭菌水制成1000u/mL溶液，摇匀，静置，精密量取上清液适量，用磷酸盐缓冲液灭菌水稀释成与标准品中心浓度相同的供试液。取准备好的放置6只牛津杯的培养皿6个，在每一双碟中，间隔的3只牛津杯中分别滴满中心浓度的标准液，另3只牛津杯中滴满供试液。在35-37℃下培养14-16小时后，测量各抑菌圈的直徑。分别求得标准液抑菌圈的直径，再求得标准液抑菌圈直径平均值 和供试液抑菌圈直径的平均值 ，算出的差数fk。据此在标准曲线上读取供试液的浓度，即可转换成供试品所含效价u·mL-1，也可以代入直线回归方程，算出供试品的效价。
样品效价测定结果：用此法测定硫酸巴龙霉素片（批号分别为20130707、20130708、20130709、20130710），并与二剂量法比较，结果见表2。
4.5重现性试验：取硫酸巴龙霉素片（批号为20130710），按本法测定8 份，其平均值为99.0%，RSD=1.21% 。
三、讨论
本法测定硫酸巴龙霉素片效价，选标准品中心浓度为2.0u/mL，加菌液适量，直径在18-22mm的抑菌圈边缘清晰。
本法与二剂量法比较，结果无显著差异，虽操作烦琐，但结果准确，重现性较好。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版（二部）[M]北京：化学工业出版社，2010：966，附录93-98
[2]马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册[M] 北京：科学出版社，2001：231-234