【摘 要】
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目的 探讨沉默轴突导向蛋白4D(Sema4D)基因对卵巢癌SKOV3细胞增殖、侵袭、转移的影响,并验证Sema4D干扰RNA对人卵巢癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用.方法 针对Sema4D基因构建短发
【机 构】
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天津医科大学附属肿瘤医院妇瘤科,天津市肿瘤防治重点实验室
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目的 探讨沉默轴突导向蛋白4D(Sema4D)基因对卵巢癌SKOV3细胞增殖、侵袭、转移的影响,并验证Sema4D干扰RNA对人卵巢癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用.方法 针对Sema4D基因构建短发夹RNA(shRNA)重组载体pshRNA Sema4D-A、pshRNASema4D-B和pshRNASema4D-C质粒,并行酶切鉴定和测序分析.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法筛选RNA干扰效果最佳的重组载体,通过脂质体介导转染卵巢癌SKOV3细胞(重组载体组),并以空载体组(转染空载体pcDNA3.1质粒)和未转染组(未作任何处理)为对照.采用RT-PCR法和Westem blot法分别检测转染前后SKOV3细胞中Sema4D mRNA和蛋白表达,并榆测转染前后SKO3细胞的增殖、侵袭和转移能力.建立人卵巢癌裸鼠移植瘤模型,将满足成瘤标准的15只裸鼠随机分为pshRNASema4D组(重组载体组)、空载体组和未转染组,每组5只,分别向瘤块内注射pshRNASema4D-B(50μg/次)、空载体(50μg/次)和磷酸盐缓冲液(PBS,100μl/次),每3 d注射1次,共3周,观察移植瘤生长情况.结果 酶切鉴定和测序分析证实,靶向Sema4D的3个ShRNA重组载体pshRNASema4D-A、pshRNASema4D-B和pshRNASema4D-C质粒构建成功.RT-PCR法筛选显示,重组载体pshRNASema4D-B质粒干扰效果最佳.重组载体组转染24、48和72 h时,SKOV3细胞中Sema4DmRNA的相对表达水平分别为0.401.4±0.051、0.120±0.035和0.014±0.015,重组载体组转染72 h时的Sema4D mRNA相对表达水平明显低于空载体组(0.521±0.019)和未转染组(0.536±0.040,P
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