探讨下调let－7微小RNA(miRNA)的表达对卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)裂解复制的影响。
方法采用miRNA海绵技术抑制let－7 miRNAs的表达，脂质体法将pEGFP－C2－let－7 sponge质粒转染到BCBL－1和293T细胞中。实时荧光定量PCR法检测let－7 miRNAs的表达，丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶4(MAP4K4)、环氧合酶2(COX－2)和基质金属蛋白酶13(MMP－13)mRNA的表达以及KSHV开放读码框(ORF)50和ORF72基因DNA复制水平。Western blot法检测MAP4K4和COX－2蛋白的表达以及p38丝裂原活化蛋白激酶、细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)和c－Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白的表达及磷酸化水平。
结果在BCBL－1细胞中，let－7 sponge组中let－7 miRNAs的相对表达水平与空载体组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)；在293T细胞中，let－7 sponge组中let－7a、let－7b、let－7c、let－7d、let－7e、let－7f、let－7g和let－7i的相对表达水平与空载体组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。质粒转染BCBL－1细胞48 h后，空载体组和let－7 sponge组中KSHV ORF50 DNA的相对复制水平分别为1.00±0.10和2.33±0.18，差异有统计学意义(P<0.001); KSHV ORF50 mRNA的相对表达水平分别为1.08±0.48和3.22±0.27，差异有统计学意义(P<0.001)。空载体组和let－7 sponge组中KSHV ORF72 DNA的相对复制水平分别为1.07±0.49和1.67±0.45，mRNA相对表达水平分别为1.01±0.19和1.54±0.11，差异均有统计学意义(均P<0.05)。转染质粒48 h后，空载体组和let－7 sponge组中MAP4K4 mRNA的相对表达水平分别为1.00±0.05和5.73±0.96，COX－2 mRNA的相对表达水平分别为1.00±0.05和2.68±0.19，MMP－13 mRNA的相对表达水平分别为1.00±0.02和2.69±0.25，差异均有统计学意义(均P<0.001)。let－7 sponge组与空载体组比较，MAP4K4和COX－2的蛋白表达水平也明显提高。在BCBL－1细胞中let－7 miRNAs的表达下调时，KSHV ORF50和ORF72 mRNA的表达水平增加，KSHV ORF50和ORF72 DNA的复制水平增加，MAP4K4、COX－2和MMP－13 mRNA的表达上调。在293T和BCBL－1细胞中，let－7 sponge组的ERK1/2磷酸化水平高于空载体组，但p38和JNK磷酸化水平无变化。
结论抑制细胞let－7 miRNAs的表达可激活KSHV复制，其可能是通过上调其靶基因MAP4K4的表达，上调MAP4K4下游因子COX－2和MMP－13的表达水平及ERK1/2磷酸化水平来诱发KSHV的激活，最终导致卡波西肉瘤的发生和发展。