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【摘要】目的：建立山茶油中角鲨烯含量高效液相色谱法测定法。方法：采用Inertsil ODS-SP色谱柱（250mm×46mm，5μm）；甲醇/乙腈体积比60/40为流动相；流速10mL/min；检测波长210nm。结果：在此色谱条件下，角鲨烯峰得到良好分离，在1～200μg/mL浓度范围内，浓度与峰面积呈良好线性，线性相关系数R2=09991，精密度RSD为039%，重复性RSD为122%，16h内测定稳定性RSD为275%，角鲨烯平均回收率为9812%。测定山茶油原油、粗炼山茶油、精炼山茶油中角鲨烯含量，分别为00139%、00118%、00056%和00045%，有较大差异。结论：本研究建立的方法可用于山茶油中角鲨烯含量的质量控制。
【关键词】山茶油；角鲨烯；高效液相色谱法
【中图分类号】R917【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）21-0007-03
Content determination of squalene in camellia oil by HPLC
ZENG Yong1ZHANG Yamin2XU Rongqing2*LIN Wenjin2XU Xiaomei2SUN Fengling1
1Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350003，China；2Fujian Academy of Medical Sciences，Fujian Key Laboratory of Medical Testing，Fuzhou 350001，China
Abstract：Objective To establishe a method to determine the content of squalene in camellia oil. Methods HPLC was performed on the column of Inertsil ODS-SP （250mm×46mm，5μm） with mobile phase of acetonitrile ： methanol （60∶40， v/v）， at flow rate of 1mL/min， the detection wavelength was 210nm， column temperature was room temperature， and volumn injection was 10μl. Results On this chromatographic conditions， squalene peaks was well separated and the linear range of squalene was 1～200μg/mL；RSDs of precision，stability and reproduciblity tests were repeatability lower than 30%， the average recovery was 9812%. The content of squalene in camellia oil， camellia oil smelting and refining camellia oil were 00139%， 00118%， 00056% and 00045% respectivety. Conclusions The method is simple and reproducible，and can be used for the quality control of camellia oil.
Keywords：Squalene； Camellia Oil； HPLC
山茶油（又名茶籽油、茶油、茶树油）是从山茶科植物油茶（Camellia oleifera Abel）籽中经压榨或浸出法制取的高档食用油脂，是世界四大木本食用油脂之一，其不饱和脂肪酸含量高达80%以上，被联合国粮农组织推荐为健康食品[1]。现代药理研究表明，山茶油中的角鲨烯（又称鱼肝油萜或鲨烯）是一种脂质不皂化物，具有促进机体新陈代谢，提高机体的防御机能及应激能力，具有抗衰老、抗肿瘤和提高免疫调节作用等多种生理功能[2-5]。目前，山茶油中角鲨烯的检测方法主要采用气相色谱法、气相质谱联用法[6～9]。本研究拟采用HPLC测定山茶油中角鲨烯，为山茶油及相关保健产品的质量控制提供快速简便的检测手段。
1仪器与材料
11仪器LC-20AT型高效液相色谱仪（SPD-M20A检测器，岛津公司）；电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；RE-200B型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。
12材料角鲨烯对照品（批号：140721-200601，纯度995%，中国药品生物制品检定所）；山茶油（批号20151001，由福建颐元宝生物技术有限公司）；柱层析硅胶（230～400目，青岛海洋化工有限公司）；石油醚（沸点60～90℃）、甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
21对照品溶液的制备精密称取100mg角鲨烯对照品于10mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，摇匀，制成10mg/mL的角鲨烯对照品溶液。
22供试品溶液的制备取山茶油10g，精密称定，置小烧杯中，加入5mL石油醚，混匀，用玻璃棒引流倒入硅胶柱[15mm（250mm）中（230～400目柱层析硅胶8g，湿法装柱]，用石油醚润洗烧杯2次，每次5mL，将2次洗涤液一并倒硅胶柱中，当石油醚液面与柱上端无水硫酸钠层相切时，加入30mL石油醚，收集45mL全部的洗脱液至茄形瓶中，用旋转蒸发仪旋干，随后用正己烷定容到2ml容量瓶中，充分振摇，022μm有机相滤膜过滤，转移到进样小瓶，作为供试品溶液。 23色谱条件色谱柱为Inertsil ODS-SP柱（250mm×46mm，5μm），甲醇︰乙腈体积比60︰40作为流动相，流速为10mL/min，检测波长为210nm，柱温40℃，进样量10μL。在此色谱条件下，角鲨烯对照品溶液和山茶油供试品溶液色谱图如图1、2所示。结果表明角鲨烯可得到良好的分离，角鲨烯对照品保留时间9375min，供试品溶液中角鲨烯保留时间为9537min，两者基本一致。
24线性关系分别精密吸取适量10mg/mL的角鲨烯对照品溶液，用正己烷配制成质量浓度分别为10、20、100、250、500、1000和200μg/mL的系列浓度标准溶液，按“23”的色谱条件，取10μL进样，以峰面积（y）对质量浓度（x）进行线性回归，得到回归方程为y=36221x+85454，线性相关系数R2=09991。结果表明，角鲨烯在10～2000mg/L浓度范围内线性关系良好。
25精密度试验取10mg/mL角鲨烯对照品溶液，稀释成100μg/mL，连续进样6次，每次进样体积为10μL，按“23”的色谱条件测定峰面积，结果见表1，相对标准偏差RSD为039%（n=6），精密度良好。
26重复性试验取同一批山茶油，分别称取6份样品，每份10g，精密称定，按“22”供试品溶液制备方法制备6份供试液。取供试品溶液与稀释成100μg/mL的对照品溶液各进样10μL，按“23”的色谱条件测定峰面积，计算角鲨烯含量，结果见表2，角鲨烯平均含量为00120%，RSD为122%，试验重复性良好。
27稳定性试验 取山茶油10g，精密称定，按“22”的方法配制供试品溶液，配制后立即测定一次，随后每隔4h进样一次，按“23”的色谱条件测定峰面积，结果见表3，16h内测定RSD为275%（n=6），样品溶液稳定性良好。
28回收率试验采用加样回收法，取已知含量（0012%）的山茶油平行样品9份，每份05g，精密称定，添加005mL、006mL、007mL角鲨烯对照品溶液（10mg/mL）各3份，按照22方法制备供试品溶液，取供试品溶液与对照品溶液各进样10μL，按23的色谱条件测定峰面积，计算回收率如表4所示，回收率为9546%～10181%间，平均回收率为9812%，RSD为190%（n=9），该方法回收率良好。
29样品测定取4批山茶油，分别按照“22”项的方法处理，在“23”项色谱条件下每批平行测定三次，计算各批山茶油中角鲨烯的平均含量。结果见表5。
3讨论
31山茶油成分复杂，本实验采用过硅胶柱对山茶油样品进行预处理，可大幅减少山茶杂质对角鲨烯测定的干扰，同时有利于改善角鲨烯峰形，并减少对色谱柱的污染。
32所测定的4批山茶油中角鲨烯含量有较大差异，三者间最大差异达3倍。角鲨烯含量山茶油原油中最高，粗炼山茶油次之，精炼山茶油最低，角鲨烯含量随着山茶油精制程度的提高而降低，提示研制保健营养品时，应以山茶油原油作为生产原料。
33角鲨烯具有多方面的功效与作用，是一种不可多得的营养保健成分。福建是我国油茶的中心产区之一，但福建油茶种植产业面临制约瓶颈，没有医药保健品或化工原料深加工项目，因此开发山茶油功能性保健产品对我省油茶产业持续健康发展具有重要的现实意义和广阔的应用前景。本文研究采用高效液相色谱法测定山茶油中角鲨烯含量，方法快速、简便、准确，可为山茶油及相关保健产品的质量控制提供检测手段。
参考文献
[1]贺桂先，李林松，徐林初，等. 油茶的生产特性及其功能价值[J]. 江西林业科技， 2007，（4）： 39-42.
[2]沈建福，姜天甲. 山茶油的营养价值与保健功能[J]. 粮食与食品工业， 2006，13（6）：6-8，21.
[3]李志晓，金青哲，叶小飞，等. 油茶籽油中的微量物质[J]. 粮油加工， 2014， （1）： 36-38，41.
[4]吴时敏. 角鲨烯开发利用[J].粮食与油脂， 2001，36（1）：36.
[5]陈伟珠，方华，张怡评，等. 超高效液相色谱法检测角鲨烯[J]. 食品与发酵科技， 2014， 50（6）： 74-76.
[6]汪运明，陈华勇，杨继国.气相色谱质谱联用测定茶油中角鲨烯含量[J]. 食品工业科技， 2011，32（6）：404-406.
[7]吕建云，孙丰霞，耿越. 山茶油中4种功能性成分的测定[J]. 食品安全质量检测学报， 2014， 5（6）： 1641-1646.
[8]罗月红. 山茶油中功能性成分的测定[J]. 山东工业技术， 2014， （22）： 306-306.
[9]钟冬莲，汤富彬，沈丹玉，等. 油茶籽油中角鲨烯含量的气相色谱法测定[J]. 分析试验室， 2011，30（11）：104-106.
（编辑：梁志庆）
【关键词】山茶油；角鲨烯；高效液相色谱法
【中图分类号】R917【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）21-0007-03
Content determination of squalene in camellia oil by HPLC
ZENG Yong1ZHANG Yamin2XU Rongqing2*LIN Wenjin2XU Xiaomei2SUN Fengling1
1Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350003，China；2Fujian Academy of Medical Sciences，Fujian Key Laboratory of Medical Testing，Fuzhou 350001，China
Abstract：Objective To establishe a method to determine the content of squalene in camellia oil. Methods HPLC was performed on the column of Inertsil ODS-SP （250mm×46mm，5μm） with mobile phase of acetonitrile ： methanol （60∶40， v/v）， at flow rate of 1mL/min， the detection wavelength was 210nm， column temperature was room temperature， and volumn injection was 10μl. Results On this chromatographic conditions， squalene peaks was well separated and the linear range of squalene was 1～200μg/mL；RSDs of precision，stability and reproduciblity tests were repeatability lower than 30%， the average recovery was 9812%. The content of squalene in camellia oil， camellia oil smelting and refining camellia oil were 00139%， 00118%， 00056% and 00045% respectivety. Conclusions The method is simple and reproducible，and can be used for the quality control of camellia oil.
Keywords：Squalene； Camellia Oil； HPLC
山茶油（又名茶籽油、茶油、茶树油）是从山茶科植物油茶（Camellia oleifera Abel）籽中经压榨或浸出法制取的高档食用油脂，是世界四大木本食用油脂之一，其不饱和脂肪酸含量高达80%以上，被联合国粮农组织推荐为健康食品[1]。现代药理研究表明，山茶油中的角鲨烯（又称鱼肝油萜或鲨烯）是一种脂质不皂化物，具有促进机体新陈代谢，提高机体的防御机能及应激能力，具有抗衰老、抗肿瘤和提高免疫调节作用等多种生理功能[2-5]。目前，山茶油中角鲨烯的检测方法主要采用气相色谱法、气相质谱联用法[6～9]。本研究拟采用HPLC测定山茶油中角鲨烯，为山茶油及相关保健产品的质量控制提供快速简便的检测手段。
1仪器与材料
11仪器LC-20AT型高效液相色谱仪（SPD-M20A检测器，岛津公司）；电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；RE-200B型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。
12材料角鲨烯对照品（批号：140721-200601，纯度995%，中国药品生物制品检定所）；山茶油（批号20151001，由福建颐元宝生物技术有限公司）；柱层析硅胶（230～400目，青岛海洋化工有限公司）；石油醚（沸点60～90℃）、甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
21对照品溶液的制备精密称取100mg角鲨烯对照品于10mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，摇匀，制成10mg/mL的角鲨烯对照品溶液。
22供试品溶液的制备取山茶油10g，精密称定，置小烧杯中，加入5mL石油醚，混匀，用玻璃棒引流倒入硅胶柱[15mm（250mm）中（230～400目柱层析硅胶8g，湿法装柱]，用石油醚润洗烧杯2次，每次5mL，将2次洗涤液一并倒硅胶柱中，当石油醚液面与柱上端无水硫酸钠层相切时，加入30mL石油醚，收集45mL全部的洗脱液至茄形瓶中，用旋转蒸发仪旋干，随后用正己烷定容到2ml容量瓶中，充分振摇，022μm有机相滤膜过滤，转移到进样小瓶，作为供试品溶液。 23色谱条件色谱柱为Inertsil ODS-SP柱（250mm×46mm，5μm），甲醇︰乙腈体积比60︰40作为流动相，流速为10mL/min，检测波长为210nm，柱温40℃，进样量10μL。在此色谱条件下，角鲨烯对照品溶液和山茶油供试品溶液色谱图如图1、2所示。结果表明角鲨烯可得到良好的分离，角鲨烯对照品保留时间9375min，供试品溶液中角鲨烯保留时间为9537min，两者基本一致。
24线性关系分别精密吸取适量10mg/mL的角鲨烯对照品溶液，用正己烷配制成质量浓度分别为10、20、100、250、500、1000和200μg/mL的系列浓度标准溶液，按“23”的色谱条件，取10μL进样，以峰面积（y）对质量浓度（x）进行线性回归，得到回归方程为y=36221x+85454，线性相关系数R2=09991。结果表明，角鲨烯在10～2000mg/L浓度范围内线性关系良好。
25精密度试验取10mg/mL角鲨烯对照品溶液，稀释成100μg/mL，连续进样6次，每次进样体积为10μL，按“23”的色谱条件测定峰面积，结果见表1，相对标准偏差RSD为039%（n=6），精密度良好。
26重复性试验取同一批山茶油，分别称取6份样品，每份10g，精密称定，按“22”供试品溶液制备方法制备6份供试液。取供试品溶液与稀释成100μg/mL的对照品溶液各进样10μL，按“23”的色谱条件测定峰面积，计算角鲨烯含量，结果见表2，角鲨烯平均含量为00120%，RSD为122%，试验重复性良好。
27稳定性试验 取山茶油10g，精密称定，按“22”的方法配制供试品溶液，配制后立即测定一次，随后每隔4h进样一次，按“23”的色谱条件测定峰面积，结果见表3，16h内测定RSD为275%（n=6），样品溶液稳定性良好。
28回收率试验采用加样回收法，取已知含量（0012%）的山茶油平行样品9份，每份05g，精密称定，添加005mL、006mL、007mL角鲨烯对照品溶液（10mg/mL）各3份，按照22方法制备供试品溶液，取供试品溶液与对照品溶液各进样10μL，按23的色谱条件测定峰面积，计算回收率如表4所示，回收率为9546%～10181%间，平均回收率为9812%，RSD为190%（n=9），该方法回收率良好。
29样品测定取4批山茶油，分别按照“22”项的方法处理，在“23”项色谱条件下每批平行测定三次，计算各批山茶油中角鲨烯的平均含量。结果见表5。
3讨论
31山茶油成分复杂，本实验采用过硅胶柱对山茶油样品进行预处理，可大幅减少山茶杂质对角鲨烯测定的干扰，同时有利于改善角鲨烯峰形，并减少对色谱柱的污染。
32所测定的4批山茶油中角鲨烯含量有较大差异，三者间最大差异达3倍。角鲨烯含量山茶油原油中最高，粗炼山茶油次之，精炼山茶油最低，角鲨烯含量随着山茶油精制程度的提高而降低，提示研制保健营养品时，应以山茶油原油作为生产原料。
33角鲨烯具有多方面的功效与作用，是一种不可多得的营养保健成分。福建是我国油茶的中心产区之一，但福建油茶种植产业面临制约瓶颈，没有医药保健品或化工原料深加工项目，因此开发山茶油功能性保健产品对我省油茶产业持续健康发展具有重要的现实意义和广阔的应用前景。本文研究采用高效液相色谱法测定山茶油中角鲨烯含量，方法快速、简便、准确，可为山茶油及相关保健产品的质量控制提供检测手段。
参考文献
[1]贺桂先，李林松，徐林初，等. 油茶的生产特性及其功能价值[J]. 江西林业科技， 2007，（4）： 39-42.
[2]沈建福，姜天甲. 山茶油的营养价值与保健功能[J]. 粮食与食品工业， 2006，13（6）：6-8，21.
[3]李志晓，金青哲，叶小飞，等. 油茶籽油中的微量物质[J]. 粮油加工， 2014， （1）： 36-38，41.
[4]吴时敏. 角鲨烯开发利用[J].粮食与油脂， 2001，36（1）：36.
[5]陈伟珠，方华，张怡评，等. 超高效液相色谱法检测角鲨烯[J]. 食品与发酵科技， 2014， 50（6）： 74-76.
[6]汪运明，陈华勇，杨继国.气相色谱质谱联用测定茶油中角鲨烯含量[J]. 食品工业科技， 2011，32（6）：404-406.
[7]吕建云，孙丰霞，耿越. 山茶油中4种功能性成分的测定[J]. 食品安全质量检测学报， 2014， 5（6）： 1641-1646.
[8]罗月红. 山茶油中功能性成分的测定[J]. 山东工业技术， 2014， （22）： 306-306.
[9]钟冬莲，汤富彬，沈丹玉，等. 油茶籽油中角鲨烯含量的气相色谱法测定[J]. 分析试验室， 2011，30（11）：104-106.
（编辑：梁志庆）