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摘 要：为指导烟稻轮作区稻田用除草剂2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸的合理使用，通过室内盆栽与大田试验，研究了两种除草剂在土壤和烟株中的残留和消解动态，以及烟株药害症状和内源激素含量变化。结果表明：（1）两种除草剂残留均可导致烟株矮化，茎秆扭曲，烟叶卷曲黄化;（2）兩种除草剂残留导致不同部位烟叶IAA和GA3含量显著降低，ABA含量显著升高（p<0.05）;（3）随施用剂量和处理时间增加，两种除草剂残留对烟株农艺性状的抑制作用增强，以株高或叶面积抑制率为10%～15%为标准，2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸的致害阈值在土壤中分别为1.022和0.053 mg/kg，在叶片中分别为0.047 8和0.027 6 mg/kg;（4）结合致害阈值得出2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸的田间安全间隔期分别为53 d和160 d。
关键词：2，4-滴丁酯;氯氟吡氧乙酸;烟草;残留;药害
Abstract： In order to guide the rational use of 2，4-D butyl ester and fluroxypyr in paddy fields in tobacco-rice rotation areas， the residues and digestion dynamics of the two herbicides in soil and tobacco， tobacco plant phytotoxicity symptoms and endogenous hormone content changes were studied by indoor pot experiment and field experiment. The results showed that： （1） The residues of two herbicides could lead to dwarfing of tobacco plants， serious contortion of stems， curling and yellowing of tobacco leaves. （2） The residues of two herbicides significantly decreased the contents of IAA and GA3， and significantly increased the content of ABA in tobacco （p<0.05）. （3） With the increase of application dose and treatment time， the inhibition effect on agronomic traits of tobacco plants was enhanced. Taking the inhibition rate of 10%-15% for plant height or leaf area as the standard， the critical thresholds of 2，4-D butyl ester and fluroxypyr in soil were 1.022 mg/kg and 0.053 mg/kg， respectively， and the critical thresholds in leaves were 0.047 8 mg/kg and 0.027 6 mg/kg， respectively. （4） Combined with the critical threshold， the safety intervals of 2，4-D butyl ester and fluroxypyr in the field were estimated to be 53 days and 160 days， respectively.
Keywords： 2，4-D butyl ester; fluroxypyr; tobacco; residue; phytotoxicity
2，4-滴丁酯（2，4-D butyl ester）和氯氟吡氧乙酸（Fluroxypyr）作为两种典型的激素类除草剂，具有内吸性强、传导快且广谱的特点，除草效果好且应用面积广阔[1]。然而，由于不科学使用，药害问题在全国大面积发生，药害涉及到果树、蔬菜等多种作物，严重影响其产质量[2-4]。
稻烟轮作是我国南方烟区主要的烟草栽培方式，稻田常用激素类除草剂残留过量导致后茬烟草出现药害的现象常有发生。林建麒等[5]研究表明，二氯喹啉酸在稻田残留过量会导致后茬烟株出现生长迟缓，烟叶狭窄、下卷等症状;张国宾等[6]报道二甲四氯钠残留会严重抑制烟株株高、叶宽和叶长;杨森等[7]报道，麦草畏残留会导致烟株矮小，新叶皱缩畸形。王钢等[8]通过室内盆栽研究表明，2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸残留可导致烟叶畸形，烟株发育受阻。然而，由于气候等因素影响，室内盆栽试验产生的药害症状可能与田间不同，不利于药害症状的精准识别[9]。此外，药害的产生是由于除草剂在烟草体内残留导致，因此，结合药害症状，检测药害时发生的环境介质和烟草体内除草剂含量，对指导除草剂合理使用具有重要意义。
鉴于此，本研究以室内盆栽试验与大田试验相结合，研究了不同施药剂量下2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸对烟草造成的药害症状，检测药害发生时烟叶中激素含量和农艺性状的变化，并结合除草剂在烟草体内的残留量和在大田中的消解特征，计算致害阈值与安全施药间隔期，为规避除草剂药害发生，提高烟草生产质量提供指导。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验供试烟草品种为K326;57% 2，4-滴丁酯乳油和200 g/L氯氟吡氧乙酸乳油分别由山东侨昌现代农业有限公司和江苏辉丰农化股份有限公司提供;2，4-滴丁酯标准品（98.7%）和氯氟吡氧乙酸标准品（99%）由德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司提供。 1.2 试验方法
1.2.1 田间烟株药害症状及激素含量变化研究 （1）试验设计：57% 2，4-滴丁酯乳油和200 g/L氯氟吡氧乙酸乳油的推荐施用剂量分别为850和200 a.i. g/hm2，根据预试验结果，在烟草团棵期设计1/8、1和5倍推薦剂量3个施药浓度;在烟草旺长期设计1/4、2和10倍推荐剂量3个施药浓度。施药方法为：不同施药剂量均兑水3000 mL稀释，分别于团棵期和旺长期对烟株根部周围土壤进行喷施，各浓度处理20株烟。
（2）调查与测定：对不同处理组的田间烟株定期拍照，记录药害症状。在施药15 d后采集药害症状较为明显的烟株中上部和心叶部位烟叶，依据易勇等[9]的方法提取并测定生长素（IAA）、赤霉素（GA3）和脱落酸（ABA）的含量。
1.2.2 2种农药在烟田土壤中的残留消解研究 （1）试验设计：考虑到田间除草剂重复施药现象，设推荐剂量的10倍为2种农药田间消解试验处理浓度，利用施药器对土壤表面均匀喷施3次，每次施药间隔10 d。（2）调查与测定：在第3次施药后2 h，1、3、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70和80 d取土壤样品用于测定两种农药残留量变化。（3）2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸残留量测定：超高效液相色谱串联质谱系统（UPLC-MS/MS）用来检测为本研究中除草剂残留，其中进样量为5 L，流速为0.25 mL/min，液相色谱柱为Thermo Hypersil GOLD C18（2.1×100 mm，3.0 μm），柱温为25 ℃。2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸定性离子分别为235.0/147.0（m/z）、253.05/195.10（m/z）;定量离子分别为235.0/217.0（m/z）、253.05/233.05（m/z）。使用QuEChERS方法提取残留在土壤和烟叶中的2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸，提取剂为乙腈，净化剂为C18和无水硫酸镁，浓缩后经0.22 μm有机滤膜过滤，然后使用UPLC-MS/MS检测分析。
1.2.3 烟株药害及农药残留消解的盆栽研究 （1）试验设计：据预试验结果，分别设计57% 2，4-滴丁酯乳油推荐施用剂量的0（CK）、1/8、1/4、1/2、2、5和10倍，200 g/L氯氟吡氧乙酸乳油推荐施用剂量的0（CK）、1/32、1/16、1/8、1/4、1/2和1倍为施药浓度梯度。施药方法为：根据所需浓度将药剂兑500 mL水进行稀释，均匀喷施至10 kg土壤中，并将土壤含水量调整至土壤最大持水量的60%，药剂处理后的土壤充分拌匀后装入直径32 cm、高25.5 cm的花盆中，每个浓度处理的土壤装5个花盆。另设清水处理作为对照。
（2）调查与测定：分别于移栽后30、40、50和60 d测量烟株株高、叶面积等农艺性状。分别于药剂处理后2 h，1、3、5、10、15、20、30、40、50和60 d采集各处理组鲜烟叶和土壤样品用于测定2种农药残留量变化，测定方法同1.2.2。
1.3 致害阈值及安全间隔期确定
1.3.1 致害阈值计算 首先根据农艺性状结果计算叶面积抑制率和株高抑制率，具体公式参照文献[10];再根据抑制率结果，使用方程X=PX0（Y-A2）/（A1-Y）计算2种除草剂对烟株株高和叶面积的半数抑制浓度，其中，A1表示最大反应值，即曲线上渐近线估计值;A2表示本底反应值，即曲线下渐近线估计值;P表示曲线的斜率;Y表示抑制率（%）;X0表示抑制浓度（a.i. g/hm2）;X表示半数抑制浓度（a.i. g/hm2）。
致害阈值取值：叶面积抑制率、株高抑制率为10%～15%时的施药浓度，株高抑制率作为主要参考依据[11-12]。
1.3.2 安全间隔期确定 首先，2种除草剂降解动态采用一级动力学方程Ct=C0e-kt拟合，降解半衰期T1/2=ln2/k，其中，Ct和C0分别为时间为t时土壤中的农药含量（mg/kg）和农药的初始含量（mg/kg），k和T1/2分别为反应速率常数（d-1）和降解半衰期（d）。
然后，根据2种除草剂在盆栽烟株致害时间以及药害程度，并结合其在盆栽土壤中的消解状况，计算出致害临界剂量，代入田间消解试验动态方程，确定田间施药安全间隔期。
1.4 数据分析
本研究所得数据使用Origin 2019、SPSS 20.0和Microsoft Excel 2010分析处理。不同处理激素浓度采用最小显著差异方法进行多重比较。
2 结 果
2.1 田间试验2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸的残留消解及对烟株生长的影响
2.1.1 对烟株的药害症状 根据试验结果可知，烟草在团棵期经2，4-滴丁酯处理后，高剂量处理组（1倍和5倍剂量）出现明显药害症状，尤其是5倍剂量处理组出现烟株枯萎死亡现象（图1Ⅰ），而低剂量处理组（1/8倍剂量）药害症状轻微（图1Ⅱ）。药害症状主要表现为：烟叶出现卷曲、黄化现象并且部分烟叶边缘呈锯齿状，顶部叶片厚度、颜色深度增加，烟株茎叶连接处受损，茎秆出现扭曲且底部产生腐烂坏死现象。烟草在旺长期经2，4-滴丁酯处理后，10倍剂量处理组首先表现出明显的药害症状，而1/4倍和2倍剂量处理组药害症状不明显，尤其是1/4倍剂量处理组无药害症状出现。药害症状主要表现为：与初期症状相似，烟叶变得细小狭长、出现卷曲现象且部分烟叶边缘呈锯齿状，顶部叶片出现黄化现象并且厚度增加，烟株茎叶连接处受损，茎秆扭曲严重，腐烂坏死现象在底部产生（图1 Ⅲ、Ⅳ）。
烟草在团棵期经氯氟吡氧乙酸处理后，1/8倍剂量处理组无药害产生，1倍和5倍剂量处理组药害症状严重。药害症状主要表现为：叶片发黄并向后翻卷，顶部叶片颜色加深，心叶及叶片扭曲，叶脉有灼烧型药斑，茎秆有灼烧迹象，烟株整体发黄、矮小严重、停止生长（图1 V、VI）。烟草在旺长期经氯氟吡氧乙酸处理后，高剂量处理组（2倍和10倍剂量）首先表现出明显药害症状，而1/4倍剂量处理组药害症状轻微。药害症状主要表现为：心叶及叶片严重扭曲、发黄并向后翻卷，顶部烟叶停止生长且叶片颜色均比对照组深，烟株茎秆扭曲严重同时无法继续生长，与初期症状相似（图1 Ⅶ、Ⅷ）。 2.1.2 对烟株激素含量的影响 如图2所示，经2，4-滴丁酯处理后，在心叶和叶片中，ABA含量比对照组分别显著升高了1.27倍和1.60倍（p<0.05），GA3含量比对照组分别显著降低了1.36倍和1.58倍（p<0.05），IAA含量比对照组分别显著降低了2.39倍和3.87倍（p<0.05）。
经氯氟吡氧乙酸处理后，在心叶和叶片中，ABA含量比对照组分别显著升高了1.26倍和1.52倍（p<0.05），GA3含量比对照组分别显著降低了1.92倍和2.33倍（p<0.05），IAA含量比对照组分别显著降低了2.65倍和3.28倍（p<0.05）。
两种农药对烟株体内内源激素的影响情况相似。然而，心叶和叶片中，氯氟吡氧乙酸对于烟株内GA3的影响程度均高于2，4-滴丁酯，说明氯氟吡氧乙酸对烟株的细胞伸长和分裂等功能影响更为显著。
2.1.3 2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸在烟田土壤中的残留及消解 据图3所示，2，4-滴丁酯10倍推荐剂量在田间土壤中的初始残留量为8.624 mg/kg，其降解率在施药处理10 d后超过50%，施药处理80 d后，最终残留量为0.372 mg/kg。理论半衰期为18.2 d。氯氟吡氧乙酸10倍推荐剂量在田间土壤中的原始沉积量为3.219 mg/kg，其降解率在施药处理20 d后超过50%，在施药处理80 d后，最终残留量为0.391 mg/kg。理论半衰期为27.7 d。
2.2 盆栽试验中2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸的残留消解及对烟株农艺性状的影响
2.2.1 2种农药残留对烟株农艺性状的影响 如表1所示，2，4-滴丁酯不同处理组处理第30、40、50和60天后对株高的半数抑制浓度（EC50）分别为12 074、13 685、9788和11 935 a.i. g/hm2，对叶面积的EC50分别为6763、8577、53 368和287 959 a.i. g/hm2。且药剂处理60 d后，10倍剂量处理组对株高和叶面积的抑制率分别超过30%和20%，说明该农药对烟株株高的抑制作用高于对叶面积的抑制作用。
如表2，随着施药剂量和处理时间的增加，氯氟吡氧乙酸不同处理组对烟株的抑制作用越来越大。该农药不同处理组处理30、40、50和60 d后对株高的EC50分别为942、148、61.6和80.7 a.i. g/hm2，对叶面积的EC50分别为65.7、71、53.3和35.8 a.i. g/hm2。在药剂处理60 d后，1/2和1倍剂量处理组对叶面积和烟株高度的抑制率均在70%以上，其中对叶面积抑制率超过90%，说明该农药对烟株叶面积的抑制作用高于对株高的抑制作用。
2.2.2 2种农药在盆栽土壤中的残留与消解 如图4，在施药处理15 d后，2，4-滴丁酯不同浓度处理组在盆栽土壤中的降解率均大于50%。各处理组的降解过程均符合一级动力学方程，其降解半衰期按施药浓度由低到高依次为2.7、4.1、4.9、6.3、7.6和8.6 d;在药剂处理30 d后，氯氟吡氧乙酸不同处理组在盆栽土壤中的降解率均大于50%。各处理组的降解过程均符合一级动力学方程，其降解半衰期按施药浓度由低到高依次为2.2、5.0、11.5、12.0、23.0和18.0 d。
总体上，2种农药在土壤中消解速率均较快，不易形成持久性残留，同时氯氟吡氧乙酸在土壤中降解速率低于2，4-滴丁酯，推测这是氯氟吡氧乙酸对烟株产生药害程度高于2，4-滴丁酯的原因之一。
2.2.3 2种农药在盆栽烟叶中的残留与消解 盆栽试验中，不同浓度处理后，烟叶中2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸残留量检测结果如表3，其中前者1/8和1/4倍剂量处理组、后者1/32、1/16和1/8倍剂量处理组均未检测到相应的除草剂残留。两种农药其余剂量处理组在施药处理30 d后，降解速度较慢，但整体随时间推移呈降低趋势，药后60 d，施药浓度越高，残留量越大。
2.3 2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸对烟株的致害阈值及安全间隔期
根據2种除草剂在盆栽烟株致害时间以及药害症状，并与其在盆栽土壤中的消解状况相结合，计算出致害临界剂量，并将临界剂量代入田间消解试验动态方程，就可对2种除草剂的大田安全间隔期进行评估。
盆栽试验中，57% 2，4-滴丁酯乳油5倍推荐浓度施药30 d后，对株高抑制率达到20.4%（大于10%～15%）[11-12]，同时，此浓度施药30 d后，盆栽土壤和盆栽烟草叶片中2，4-滴丁酯残留量分别为1.022、0.047 8 mg/kg。田间消解试验中，该农药在田间土壤中的消解动态方程为y=7.721 7e-0.038x，将产生药害时土壤中该农药含量（即y=1.022 mg/kg）代入，可得该农药大田安全间隔期（x）为53 d。
同理，氯氟吡氧乙酸在盆栽土壤以及叶片中的致害阈值分别为0.053和0.027 6 mg/kg，大田安全间隔期为160 d。
3 讨 论
稻田除草剂残留导致后茬烟草产生药害，已成为影响稻烟轮作区烟草发展的重要因素之一[13-14]。明确除草剂药害症状可以为应对药害提供有力依据。本研究表明，2，4-滴丁酯可使田间烟株叶片边缘呈锯齿状，茎秆底部出现腐烂坏死;氯氟吡氧乙酸可使叶片发黄并向后翻卷，叶片褶皱。1/2倍推荐浓度2，4-滴丁酯和1/8倍推荐浓度氯氟吡氧乙酸在分别处理30 d和40 d后即可对盆栽烟株农艺性状产生明显的抑制效果，且两种除草剂施药剂量与药害程度呈明显的时间-剂量效应关系。与本研究结果一致，王钢等[8]在研究玉米田中该二种农药残留对烤烟药害症状时同样出现了暴露时间越长、浓度越大，药害程度越深的情况;杨森等[7]在研究激素类除草剂的麦草畏残留对烟株药害作用时同样发现，麦草畏残留可导致烟叶畸形，对烟株农艺性状有显著抑制作用。本研究表明两种农药在使用过程中药害风险较高。 植物分泌的ABA、GA3、IAA等内源激素不仅对自身生长分化、结实落果等生命过程具有调节作用，其含量还会发生变化以适应环境变化[15-16]。本研究发现，在心叶和叶片中，两种除草剂处理组中的IAA和GA3含量均比对照组显著降低（p<0.05），说明两种除草剂处理后，烟株的分裂分化、分蘖抽苔受到抑制，烟株衰老加速。袁祖丽等[17]也发现逆境胁迫影响下，烟株出现了IAA和GA3含量下降的结果，说明烟株通过延缓自身生长速度、节省能量来应对外界胁迫。值得注意的是，在心叶和叶片中，氯氟吡氧乙酸对于烟株内GA3的影响程度均高于2，4-滴丁酯，与氯氟吡氧乙酸处理组烟株农艺性状受抑制程度高于2，4-滴丁酯处理组这一现象相吻合;ABA是植株衰老的正化学信号，在心叶和叶片中，两种除草剂处理组中的ABA含量均比对照组显著升高（p<0.05），因此，该结果说明两种除草剂导致植株衰老加速、细胞程序性死亡来应对药害胁迫，这与药害症状观察结果相符，与本研究相似，李祖红等[18]、陈建国等[19]发现烟株受到逆境胁迫时，ABA含量会显著上升，这会诱导或增强抗性基因的转录活性，增强对植株的保护作用。
两种农药在盆栽土壤中消解速率均较快，不易形成持久性残留;同时，2，4-滴丁酯在盆栽土壤以及叶片中的致害浓度分别为1.022和0.047 8 mg/kg，大田安全间隔期为53 d;氯氟吡氧乙酸在盆栽土壤以及叶片中的致害浓度分别为0.053和0.027 6 mg/kg，大田安全间隔期为160 d。两种农药所引起的药害一般在烟株生长后期出现，而一旦出现药害症状，虽有补救措施，但还是会对烟草质量和产量造成影响。因此，明确除草剂致害浓度，在烟田规划期对土壤中除草剂残留量进行筛查，能够有效预防除草剂残留产生药害[15]。
4 结 论
研究探明了目标除草剂施药浓度与药害程度的关系，揭示了药害发生部位内源激素IAA、GA3和ABA含量的变化，并且探究了两种除草剂的降解规律，结合降解规律和烟株农艺性状变化确定了2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸在土壤中的致害阈值分别为1.022和0.053 mg/kg，超过此阈值则不得种植烟草，且施药间隔应分别不少于53和160 d。
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关键词：2，4-滴丁酯;氯氟吡氧乙酸;烟草;残留;药害
Abstract： In order to guide the rational use of 2，4-D butyl ester and fluroxypyr in paddy fields in tobacco-rice rotation areas， the residues and digestion dynamics of the two herbicides in soil and tobacco， tobacco plant phytotoxicity symptoms and endogenous hormone content changes were studied by indoor pot experiment and field experiment. The results showed that： （1） The residues of two herbicides could lead to dwarfing of tobacco plants， serious contortion of stems， curling and yellowing of tobacco leaves. （2） The residues of two herbicides significantly decreased the contents of IAA and GA3， and significantly increased the content of ABA in tobacco （p<0.05）. （3） With the increase of application dose and treatment time， the inhibition effect on agronomic traits of tobacco plants was enhanced. Taking the inhibition rate of 10%-15% for plant height or leaf area as the standard， the critical thresholds of 2，4-D butyl ester and fluroxypyr in soil were 1.022 mg/kg and 0.053 mg/kg， respectively， and the critical thresholds in leaves were 0.047 8 mg/kg and 0.027 6 mg/kg， respectively. （4） Combined with the critical threshold， the safety intervals of 2，4-D butyl ester and fluroxypyr in the field were estimated to be 53 days and 160 days， respectively.
Keywords： 2，4-D butyl ester; fluroxypyr; tobacco; residue; phytotoxicity
2，4-滴丁酯（2，4-D butyl ester）和氯氟吡氧乙酸（Fluroxypyr）作为两种典型的激素类除草剂，具有内吸性强、传导快且广谱的特点，除草效果好且应用面积广阔[1]。然而，由于不科学使用，药害问题在全国大面积发生，药害涉及到果树、蔬菜等多种作物，严重影响其产质量[2-4]。
稻烟轮作是我国南方烟区主要的烟草栽培方式，稻田常用激素类除草剂残留过量导致后茬烟草出现药害的现象常有发生。林建麒等[5]研究表明，二氯喹啉酸在稻田残留过量会导致后茬烟株出现生长迟缓，烟叶狭窄、下卷等症状;张国宾等[6]报道二甲四氯钠残留会严重抑制烟株株高、叶宽和叶长;杨森等[7]报道，麦草畏残留会导致烟株矮小，新叶皱缩畸形。王钢等[8]通过室内盆栽研究表明，2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸残留可导致烟叶畸形，烟株发育受阻。然而，由于气候等因素影响，室内盆栽试验产生的药害症状可能与田间不同，不利于药害症状的精准识别[9]。此外，药害的产生是由于除草剂在烟草体内残留导致，因此，结合药害症状，检测药害时发生的环境介质和烟草体内除草剂含量，对指导除草剂合理使用具有重要意义。
鉴于此，本研究以室内盆栽试验与大田试验相结合，研究了不同施药剂量下2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸对烟草造成的药害症状，检测药害发生时烟叶中激素含量和农艺性状的变化，并结合除草剂在烟草体内的残留量和在大田中的消解特征，计算致害阈值与安全施药间隔期，为规避除草剂药害发生，提高烟草生产质量提供指导。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验供试烟草品种为K326;57% 2，4-滴丁酯乳油和200 g/L氯氟吡氧乙酸乳油分别由山东侨昌现代农业有限公司和江苏辉丰农化股份有限公司提供;2，4-滴丁酯标准品（98.7%）和氯氟吡氧乙酸标准品（99%）由德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司提供。 1.2 试验方法
1.2.1 田间烟株药害症状及激素含量变化研究 （1）试验设计：57% 2，4-滴丁酯乳油和200 g/L氯氟吡氧乙酸乳油的推荐施用剂量分别为850和200 a.i. g/hm2，根据预试验结果，在烟草团棵期设计1/8、1和5倍推薦剂量3个施药浓度;在烟草旺长期设计1/4、2和10倍推荐剂量3个施药浓度。施药方法为：不同施药剂量均兑水3000 mL稀释，分别于团棵期和旺长期对烟株根部周围土壤进行喷施，各浓度处理20株烟。
（2）调查与测定：对不同处理组的田间烟株定期拍照，记录药害症状。在施药15 d后采集药害症状较为明显的烟株中上部和心叶部位烟叶，依据易勇等[9]的方法提取并测定生长素（IAA）、赤霉素（GA3）和脱落酸（ABA）的含量。
1.2.2 2种农药在烟田土壤中的残留消解研究 （1）试验设计：考虑到田间除草剂重复施药现象，设推荐剂量的10倍为2种农药田间消解试验处理浓度，利用施药器对土壤表面均匀喷施3次，每次施药间隔10 d。（2）调查与测定：在第3次施药后2 h，1、3、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70和80 d取土壤样品用于测定两种农药残留量变化。（3）2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸残留量测定：超高效液相色谱串联质谱系统（UPLC-MS/MS）用来检测为本研究中除草剂残留，其中进样量为5 L，流速为0.25 mL/min，液相色谱柱为Thermo Hypersil GOLD C18（2.1×100 mm，3.0 μm），柱温为25 ℃。2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸定性离子分别为235.0/147.0（m/z）、253.05/195.10（m/z）;定量离子分别为235.0/217.0（m/z）、253.05/233.05（m/z）。使用QuEChERS方法提取残留在土壤和烟叶中的2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸，提取剂为乙腈，净化剂为C18和无水硫酸镁，浓缩后经0.22 μm有机滤膜过滤，然后使用UPLC-MS/MS检测分析。
1.2.3 烟株药害及农药残留消解的盆栽研究 （1）试验设计：据预试验结果，分别设计57% 2，4-滴丁酯乳油推荐施用剂量的0（CK）、1/8、1/4、1/2、2、5和10倍，200 g/L氯氟吡氧乙酸乳油推荐施用剂量的0（CK）、1/32、1/16、1/8、1/4、1/2和1倍为施药浓度梯度。施药方法为：根据所需浓度将药剂兑500 mL水进行稀释，均匀喷施至10 kg土壤中，并将土壤含水量调整至土壤最大持水量的60%，药剂处理后的土壤充分拌匀后装入直径32 cm、高25.5 cm的花盆中，每个浓度处理的土壤装5个花盆。另设清水处理作为对照。
（2）调查与测定：分别于移栽后30、40、50和60 d测量烟株株高、叶面积等农艺性状。分别于药剂处理后2 h，1、3、5、10、15、20、30、40、50和60 d采集各处理组鲜烟叶和土壤样品用于测定2种农药残留量变化，测定方法同1.2.2。
1.3 致害阈值及安全间隔期确定
1.3.1 致害阈值计算 首先根据农艺性状结果计算叶面积抑制率和株高抑制率，具体公式参照文献[10];再根据抑制率结果，使用方程X=PX0（Y-A2）/（A1-Y）计算2种除草剂对烟株株高和叶面积的半数抑制浓度，其中，A1表示最大反应值，即曲线上渐近线估计值;A2表示本底反应值，即曲线下渐近线估计值;P表示曲线的斜率;Y表示抑制率（%）;X0表示抑制浓度（a.i. g/hm2）;X表示半数抑制浓度（a.i. g/hm2）。
致害阈值取值：叶面积抑制率、株高抑制率为10%～15%时的施药浓度，株高抑制率作为主要参考依据[11-12]。
1.3.2 安全间隔期确定 首先，2种除草剂降解动态采用一级动力学方程Ct=C0e-kt拟合，降解半衰期T1/2=ln2/k，其中，Ct和C0分别为时间为t时土壤中的农药含量（mg/kg）和农药的初始含量（mg/kg），k和T1/2分别为反应速率常数（d-1）和降解半衰期（d）。
然后，根据2种除草剂在盆栽烟株致害时间以及药害程度，并结合其在盆栽土壤中的消解状况，计算出致害临界剂量，代入田间消解试验动态方程，确定田间施药安全间隔期。
1.4 数据分析
本研究所得数据使用Origin 2019、SPSS 20.0和Microsoft Excel 2010分析处理。不同处理激素浓度采用最小显著差异方法进行多重比较。
2 结 果
2.1 田间试验2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸的残留消解及对烟株生长的影响
2.1.1 对烟株的药害症状 根据试验结果可知，烟草在团棵期经2，4-滴丁酯处理后，高剂量处理组（1倍和5倍剂量）出现明显药害症状，尤其是5倍剂量处理组出现烟株枯萎死亡现象（图1Ⅰ），而低剂量处理组（1/8倍剂量）药害症状轻微（图1Ⅱ）。药害症状主要表现为：烟叶出现卷曲、黄化现象并且部分烟叶边缘呈锯齿状，顶部叶片厚度、颜色深度增加，烟株茎叶连接处受损，茎秆出现扭曲且底部产生腐烂坏死现象。烟草在旺长期经2，4-滴丁酯处理后，10倍剂量处理组首先表现出明显的药害症状，而1/4倍和2倍剂量处理组药害症状不明显，尤其是1/4倍剂量处理组无药害症状出现。药害症状主要表现为：与初期症状相似，烟叶变得细小狭长、出现卷曲现象且部分烟叶边缘呈锯齿状，顶部叶片出现黄化现象并且厚度增加，烟株茎叶连接处受损，茎秆扭曲严重，腐烂坏死现象在底部产生（图1 Ⅲ、Ⅳ）。
烟草在团棵期经氯氟吡氧乙酸处理后，1/8倍剂量处理组无药害产生，1倍和5倍剂量处理组药害症状严重。药害症状主要表现为：叶片发黄并向后翻卷，顶部叶片颜色加深，心叶及叶片扭曲，叶脉有灼烧型药斑，茎秆有灼烧迹象，烟株整体发黄、矮小严重、停止生长（图1 V、VI）。烟草在旺长期经氯氟吡氧乙酸处理后，高剂量处理组（2倍和10倍剂量）首先表现出明显药害症状，而1/4倍剂量处理组药害症状轻微。药害症状主要表现为：心叶及叶片严重扭曲、发黄并向后翻卷，顶部烟叶停止生长且叶片颜色均比对照组深，烟株茎秆扭曲严重同时无法继续生长，与初期症状相似（图1 Ⅶ、Ⅷ）。 2.1.2 对烟株激素含量的影响 如图2所示，经2，4-滴丁酯处理后，在心叶和叶片中，ABA含量比对照组分别显著升高了1.27倍和1.60倍（p<0.05），GA3含量比对照组分别显著降低了1.36倍和1.58倍（p<0.05），IAA含量比对照组分别显著降低了2.39倍和3.87倍（p<0.05）。
经氯氟吡氧乙酸处理后，在心叶和叶片中，ABA含量比对照组分别显著升高了1.26倍和1.52倍（p<0.05），GA3含量比对照组分别显著降低了1.92倍和2.33倍（p<0.05），IAA含量比对照组分别显著降低了2.65倍和3.28倍（p<0.05）。
两种农药对烟株体内内源激素的影响情况相似。然而，心叶和叶片中，氯氟吡氧乙酸对于烟株内GA3的影响程度均高于2，4-滴丁酯，说明氯氟吡氧乙酸对烟株的细胞伸长和分裂等功能影响更为显著。
2.1.3 2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸在烟田土壤中的残留及消解 据图3所示，2，4-滴丁酯10倍推荐剂量在田间土壤中的初始残留量为8.624 mg/kg，其降解率在施药处理10 d后超过50%，施药处理80 d后，最终残留量为0.372 mg/kg。理论半衰期为18.2 d。氯氟吡氧乙酸10倍推荐剂量在田间土壤中的原始沉积量为3.219 mg/kg，其降解率在施药处理20 d后超过50%，在施药处理80 d后，最终残留量为0.391 mg/kg。理论半衰期为27.7 d。
2.2 盆栽试验中2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸的残留消解及对烟株农艺性状的影响
2.2.1 2种农药残留对烟株农艺性状的影响 如表1所示，2，4-滴丁酯不同处理组处理第30、40、50和60天后对株高的半数抑制浓度（EC50）分别为12 074、13 685、9788和11 935 a.i. g/hm2，对叶面积的EC50分别为6763、8577、53 368和287 959 a.i. g/hm2。且药剂处理60 d后，10倍剂量处理组对株高和叶面积的抑制率分别超过30%和20%，说明该农药对烟株株高的抑制作用高于对叶面积的抑制作用。
如表2，随着施药剂量和处理时间的增加，氯氟吡氧乙酸不同处理组对烟株的抑制作用越来越大。该农药不同处理组处理30、40、50和60 d后对株高的EC50分别为942、148、61.6和80.7 a.i. g/hm2，对叶面积的EC50分别为65.7、71、53.3和35.8 a.i. g/hm2。在药剂处理60 d后，1/2和1倍剂量处理组对叶面积和烟株高度的抑制率均在70%以上，其中对叶面积抑制率超过90%，说明该农药对烟株叶面积的抑制作用高于对株高的抑制作用。
2.2.2 2种农药在盆栽土壤中的残留与消解 如图4，在施药处理15 d后，2，4-滴丁酯不同浓度处理组在盆栽土壤中的降解率均大于50%。各处理组的降解过程均符合一级动力学方程，其降解半衰期按施药浓度由低到高依次为2.7、4.1、4.9、6.3、7.6和8.6 d;在药剂处理30 d后，氯氟吡氧乙酸不同处理组在盆栽土壤中的降解率均大于50%。各处理组的降解过程均符合一级动力学方程，其降解半衰期按施药浓度由低到高依次为2.2、5.0、11.5、12.0、23.0和18.0 d。
总体上，2种农药在土壤中消解速率均较快，不易形成持久性残留，同时氯氟吡氧乙酸在土壤中降解速率低于2，4-滴丁酯，推测这是氯氟吡氧乙酸对烟株产生药害程度高于2，4-滴丁酯的原因之一。
2.2.3 2种农药在盆栽烟叶中的残留与消解 盆栽试验中，不同浓度处理后，烟叶中2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸残留量检测结果如表3，其中前者1/8和1/4倍剂量处理组、后者1/32、1/16和1/8倍剂量处理组均未检测到相应的除草剂残留。两种农药其余剂量处理组在施药处理30 d后，降解速度较慢，但整体随时间推移呈降低趋势，药后60 d，施药浓度越高，残留量越大。
2.3 2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸对烟株的致害阈值及安全间隔期
根據2种除草剂在盆栽烟株致害时间以及药害症状，并与其在盆栽土壤中的消解状况相结合，计算出致害临界剂量，并将临界剂量代入田间消解试验动态方程，就可对2种除草剂的大田安全间隔期进行评估。
盆栽试验中，57% 2，4-滴丁酯乳油5倍推荐浓度施药30 d后，对株高抑制率达到20.4%（大于10%～15%）[11-12]，同时，此浓度施药30 d后，盆栽土壤和盆栽烟草叶片中2，4-滴丁酯残留量分别为1.022、0.047 8 mg/kg。田间消解试验中，该农药在田间土壤中的消解动态方程为y=7.721 7e-0.038x，将产生药害时土壤中该农药含量（即y=1.022 mg/kg）代入，可得该农药大田安全间隔期（x）为53 d。
同理，氯氟吡氧乙酸在盆栽土壤以及叶片中的致害阈值分别为0.053和0.027 6 mg/kg，大田安全间隔期为160 d。
3 讨 论
稻田除草剂残留导致后茬烟草产生药害，已成为影响稻烟轮作区烟草发展的重要因素之一[13-14]。明确除草剂药害症状可以为应对药害提供有力依据。本研究表明，2，4-滴丁酯可使田间烟株叶片边缘呈锯齿状，茎秆底部出现腐烂坏死;氯氟吡氧乙酸可使叶片发黄并向后翻卷，叶片褶皱。1/2倍推荐浓度2，4-滴丁酯和1/8倍推荐浓度氯氟吡氧乙酸在分别处理30 d和40 d后即可对盆栽烟株农艺性状产生明显的抑制效果，且两种除草剂施药剂量与药害程度呈明显的时间-剂量效应关系。与本研究结果一致，王钢等[8]在研究玉米田中该二种农药残留对烤烟药害症状时同样出现了暴露时间越长、浓度越大，药害程度越深的情况;杨森等[7]在研究激素类除草剂的麦草畏残留对烟株药害作用时同样发现，麦草畏残留可导致烟叶畸形，对烟株农艺性状有显著抑制作用。本研究表明两种农药在使用过程中药害风险较高。 植物分泌的ABA、GA3、IAA等内源激素不仅对自身生长分化、结实落果等生命过程具有调节作用，其含量还会发生变化以适应环境变化[15-16]。本研究发现，在心叶和叶片中，两种除草剂处理组中的IAA和GA3含量均比对照组显著降低（p<0.05），说明两种除草剂处理后，烟株的分裂分化、分蘖抽苔受到抑制，烟株衰老加速。袁祖丽等[17]也发现逆境胁迫影响下，烟株出现了IAA和GA3含量下降的结果，说明烟株通过延缓自身生长速度、节省能量来应对外界胁迫。值得注意的是，在心叶和叶片中，氯氟吡氧乙酸对于烟株内GA3的影响程度均高于2，4-滴丁酯，与氯氟吡氧乙酸处理组烟株农艺性状受抑制程度高于2，4-滴丁酯处理组这一现象相吻合;ABA是植株衰老的正化学信号，在心叶和叶片中，两种除草剂处理组中的ABA含量均比对照组显著升高（p<0.05），因此，该结果说明两种除草剂导致植株衰老加速、细胞程序性死亡来应对药害胁迫，这与药害症状观察结果相符，与本研究相似，李祖红等[18]、陈建国等[19]发现烟株受到逆境胁迫时，ABA含量会显著上升，这会诱导或增强抗性基因的转录活性，增强对植株的保护作用。
两种农药在盆栽土壤中消解速率均较快，不易形成持久性残留;同时，2，4-滴丁酯在盆栽土壤以及叶片中的致害浓度分别为1.022和0.047 8 mg/kg，大田安全间隔期为53 d;氯氟吡氧乙酸在盆栽土壤以及叶片中的致害浓度分别为0.053和0.027 6 mg/kg，大田安全间隔期为160 d。两种农药所引起的药害一般在烟株生长后期出现，而一旦出现药害症状，虽有补救措施，但还是会对烟草质量和产量造成影响。因此，明确除草剂致害浓度，在烟田规划期对土壤中除草剂残留量进行筛查，能够有效预防除草剂残留产生药害[15]。
4 结 论
研究探明了目标除草剂施药浓度与药害程度的关系，揭示了药害发生部位内源激素IAA、GA3和ABA含量的变化，并且探究了两种除草剂的降解规律，结合降解规律和烟株农艺性状变化确定了2，4-滴丁酯和氯氟吡氧乙酸在土壤中的致害阈值分别为1.022和0.053 mg/kg，超过此阈值则不得种植烟草，且施药间隔应分别不少于53和160 d。
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