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【摘 要】食品微生物与我们的生活的息息相关，近来年我们对于食品微生物的利用、检测和防治也越来越重视。LAMP也称环介导等温扩增技术，是近年来新兴微生物检测技术，该技术较其他检测技术相比具有更高的灵敏性，并且能够节约时间和成本、操作和结果判定相对简单等优点，因此能够快速应用于食物中的细菌、霉菌、病毒等微生物的检测。本文通过对LAMP技术在细菌、病毒、寄生虫、支原体等病菌中的检测进行分析，以期为食品高质量快速检测提供参考。
【关键词】LAMP方法;食品微生物;检测;食品安全
一、前言
食品微生物伴随这人类的产生，对我们的生活有利有弊，但食源性致病菌以及实物变质产生的病菌不断的威胁着人们的健康，甚至不断威胁着我们的生命[1]。随着分子生物学的不断发展，各种微生物检测方法不断被研究，而快速、高效、低成本的检测方法也越来越得到人们的重视，其中环介导等温扩增技术作为新型的核酸扩增技术以其独特的优点和特异性被广泛应用于食品快速检测和现场检测中，为我们进行快速的食品检测提供了可靠依据[2]。
二、LAMP技术原理及检测方法发展
LAMP技术是由Notomi等人于2000年提出的一种高效的链取代核酸技术，其特殊的灵敏性和特异性立即被应用于各种诊断而备受瞩目[3]。
1.LAMP基本原理
LAMP是针对靶序列的6个区域设计4条特殊的引物，然后利用Bst DNA聚合酶在恒温条件下保温进行核酸扩增反应，扩增后观察副产物焦癖酸镑的沉淀情况。LAMP不仅仅可以对DNA和RNA都可以扩增，所有的操作过程只需要用到水浴锅既可。
2.LAMP的终点检测方法
① 我们根据可以LAMP在将DNA扩增后产生的焦磷酸根离子能与镁离子生成白色的沉淀这一的特性来判断LAMP反应是否发生;
② 通过向在扩增产物中加入荧光染料后颜色的变化来辨别;
③ 通过琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察分离后行成的梯形状条带来确定。
三、LAMP在临床微生物检测中应用及进展
①对沙门氏菌的检测
沙门氏菌是一种常见的病原菌，多见于禽肉类食品当中，往往可以引起人们的食物中毒[4]。自使用LAMP法对沙门氏菌检测以来，大大节约了检测该病菌的时间和成本，将以往检测的时间由2-3天缩短到一个小时内。且传统的检测方法对仪器的要求严格，而LAMP法则针对沙氏门菌中的STN、fimY或者 invA设计引物，然后通过琼脂糖凝胶电泳法分离，最后通过肉眼就能观察出结果，以此来检测食品中沙门氏菌的存在。曾有人利用该方法检测出 7 种不同的沙门氏菌，可见该方法在食品检测方面的灵活性与特异性。
②对中阪崎肠杆菌的检测
阪崎肠杆菌多见于婴儿食品中，为革兰氏阴性菌常可致使婴儿患败血症、脑膜炎、菌血症等疾病，因此对于阪崎肠杆菌的检测相当重要。我们根据阪崎肠杆菌的16S-23S rRNA或者OmpA作为靶序列设计引物，利用聚合酶缓冲液恒温扩增并结合荧光染料监测扩增反应的进程，该方法能够实现对样品进行实时且直观的分析，显示检测结果的阴阳性，且耗时短，是常规PCR技术的100倍。
③对单增李斯特菌的检测
单增李斯特菌是一种人畜共患病原菌和食源性病原菌，可引发呕吐、腹痛甚至骨髓炎、心肌炎等疾病。检测中我们针对单增李斯特菌的hlyA基因设计引物在Bst DNA聚合酶作用下63℃反应45 min，然后采用琼脂糖凝胶电泳法进行确定最终的检测结果。杨爱华[5]等利用DNA提取试剂盒，采用Primer 4.0软件对单增生性李斯特菌的hlyA基因设计了4条具有特异性的环介导等温核酸扩增引物，
并对引物浓度、反应温度和Mg2+浓度优化，在63℃恒温下反应和80℃加热后，用1.5%琼脂糖凝胶电泳和显色反应鉴定出单增李斯特菌最低检测限为3 CFU/mL。
④对金黄色葡萄球菌的检测
金黄色葡萄球菌很容易污染食品，甚至能够导致人们食物中毒，检测中我们根据金黄色葡萄球菌的nuc基因作为靶序列，然后进行LAMP扩增，最后用琼脂糖凝胶电泳进行验证实验。张涛涛[6]也利用改良的LAMP技术进行实验，确定了金黄色葡萄球菌的生长曲线呈对数增长，且基因组DNA的提取方法为改良的SDS法，从而得出LAMP法的最佳温度为60℃，时间为45 min，并证明出LAMP技术的灵敏度要比PCR高出100倍。
四、总结
食品中微生物检测是食品安全检测的重要部分，食品的安全额也是人们健康与否的关键，传统方法的食品微生物检测的局限性和弊端日渐突出，甚至不能检测出食品中的有害物质，大大的影响着食品的安全性。LAMP技术作为新型的快速、安全的检测方法，也在不断的被改进和研究，目前它不仅能够实现对单样品多种不同靶基因的同时检测，也能够实现对多种样品的高通量检测。
LAMP技术的实施与不断改进不但在食品微生物方面有突出的表现，在检测食品过敏原成分和食品动物源成分方面也有重要的应用，从而对寻找和检测过敏原和肉类食品检测方面大大提高了检测的效率，为预防和治疗多种疾病提高了时效和安全保证。此外LAMP技术能够转基因食品的改良上也有突出的表现，对转基因食品实现了快速的现场检测。
参考文献：
[1]刘宏伟，侯睿林，张妙霞，等.河南省农产品检测中心发展现状与建议[J].农产品质量与安全，2014：41-42.
[2]胡霞.我国食品安全检验检测体系问题及对策研究[J].山西农经，2017（21）：22-25.
[3]Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Research，2000，28（12）：e63.
[4]孔超，董娜，高伟.应用环介导等温扩增法快速检测食品中沙门氏菌的研究[J].中国病原生物学杂志.2015，10（9）：816-818.
[5]杨爱華，李秀梅，韩文瑜.单增李斯特菌环介导等温扩增快速检测方法的建立[J].中国畜牧兽医文摘，2017，33（2）：331-337.
[6]张涛涛.改良型环介导等温扩增法检测金黄色葡萄球菌的研究[D].陕西科技大学，2014.
（作者单位：1.广西中知国华知识产权代理有限公司;2.广西中知科创知识产权代理有限公司）
【关键词】LAMP方法;食品微生物;检测;食品安全
一、前言
食品微生物伴随这人类的产生，对我们的生活有利有弊，但食源性致病菌以及实物变质产生的病菌不断的威胁着人们的健康，甚至不断威胁着我们的生命[1]。随着分子生物学的不断发展，各种微生物检测方法不断被研究，而快速、高效、低成本的检测方法也越来越得到人们的重视，其中环介导等温扩增技术作为新型的核酸扩增技术以其独特的优点和特异性被广泛应用于食品快速检测和现场检测中，为我们进行快速的食品检测提供了可靠依据[2]。
二、LAMP技术原理及检测方法发展
LAMP技术是由Notomi等人于2000年提出的一种高效的链取代核酸技术，其特殊的灵敏性和特异性立即被应用于各种诊断而备受瞩目[3]。
1.LAMP基本原理
LAMP是针对靶序列的6个区域设计4条特殊的引物，然后利用Bst DNA聚合酶在恒温条件下保温进行核酸扩增反应，扩增后观察副产物焦癖酸镑的沉淀情况。LAMP不仅仅可以对DNA和RNA都可以扩增，所有的操作过程只需要用到水浴锅既可。
2.LAMP的终点检测方法
① 我们根据可以LAMP在将DNA扩增后产生的焦磷酸根离子能与镁离子生成白色的沉淀这一的特性来判断LAMP反应是否发生;
② 通过向在扩增产物中加入荧光染料后颜色的变化来辨别;
③ 通过琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察分离后行成的梯形状条带来确定。
三、LAMP在临床微生物检测中应用及进展
①对沙门氏菌的检测
沙门氏菌是一种常见的病原菌，多见于禽肉类食品当中，往往可以引起人们的食物中毒[4]。自使用LAMP法对沙门氏菌检测以来，大大节约了检测该病菌的时间和成本，将以往检测的时间由2-3天缩短到一个小时内。且传统的检测方法对仪器的要求严格，而LAMP法则针对沙氏门菌中的STN、fimY或者 invA设计引物，然后通过琼脂糖凝胶电泳法分离，最后通过肉眼就能观察出结果，以此来检测食品中沙门氏菌的存在。曾有人利用该方法检测出 7 种不同的沙门氏菌，可见该方法在食品检测方面的灵活性与特异性。
②对中阪崎肠杆菌的检测
阪崎肠杆菌多见于婴儿食品中，为革兰氏阴性菌常可致使婴儿患败血症、脑膜炎、菌血症等疾病，因此对于阪崎肠杆菌的检测相当重要。我们根据阪崎肠杆菌的16S-23S rRNA或者OmpA作为靶序列设计引物，利用聚合酶缓冲液恒温扩增并结合荧光染料监测扩增反应的进程，该方法能够实现对样品进行实时且直观的分析，显示检测结果的阴阳性，且耗时短，是常规PCR技术的100倍。
③对单增李斯特菌的检测
单增李斯特菌是一种人畜共患病原菌和食源性病原菌，可引发呕吐、腹痛甚至骨髓炎、心肌炎等疾病。检测中我们针对单增李斯特菌的hlyA基因设计引物在Bst DNA聚合酶作用下63℃反应45 min，然后采用琼脂糖凝胶电泳法进行确定最终的检测结果。杨爱华[5]等利用DNA提取试剂盒，采用Primer 4.0软件对单增生性李斯特菌的hlyA基因设计了4条具有特异性的环介导等温核酸扩增引物，
并对引物浓度、反应温度和Mg2+浓度优化，在63℃恒温下反应和80℃加热后，用1.5%琼脂糖凝胶电泳和显色反应鉴定出单增李斯特菌最低检测限为3 CFU/mL。
④对金黄色葡萄球菌的检测
金黄色葡萄球菌很容易污染食品，甚至能够导致人们食物中毒，检测中我们根据金黄色葡萄球菌的nuc基因作为靶序列，然后进行LAMP扩增，最后用琼脂糖凝胶电泳进行验证实验。张涛涛[6]也利用改良的LAMP技术进行实验，确定了金黄色葡萄球菌的生长曲线呈对数增长，且基因组DNA的提取方法为改良的SDS法，从而得出LAMP法的最佳温度为60℃，时间为45 min，并证明出LAMP技术的灵敏度要比PCR高出100倍。
四、总结
食品中微生物检测是食品安全检测的重要部分，食品的安全额也是人们健康与否的关键，传统方法的食品微生物检测的局限性和弊端日渐突出，甚至不能检测出食品中的有害物质，大大的影响着食品的安全性。LAMP技术作为新型的快速、安全的检测方法，也在不断的被改进和研究，目前它不仅能够实现对单样品多种不同靶基因的同时检测，也能够实现对多种样品的高通量检测。
LAMP技术的实施与不断改进不但在食品微生物方面有突出的表现，在检测食品过敏原成分和食品动物源成分方面也有重要的应用，从而对寻找和检测过敏原和肉类食品检测方面大大提高了检测的效率，为预防和治疗多种疾病提高了时效和安全保证。此外LAMP技术能够转基因食品的改良上也有突出的表现，对转基因食品实现了快速的现场检测。
参考文献：
[1]刘宏伟，侯睿林，张妙霞，等.河南省农产品检测中心发展现状与建议[J].农产品质量与安全，2014：41-42.
[2]胡霞.我国食品安全检验检测体系问题及对策研究[J].山西农经，2017（21）：22-25.
[3]Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Research，2000，28（12）：e63.
[4]孔超，董娜，高伟.应用环介导等温扩增法快速检测食品中沙门氏菌的研究[J].中国病原生物学杂志.2015，10（9）：816-818.
[5]杨爱華，李秀梅，韩文瑜.单增李斯特菌环介导等温扩增快速检测方法的建立[J].中国畜牧兽医文摘，2017，33（2）：331-337.
[6]张涛涛.改良型环介导等温扩增法检测金黄色葡萄球菌的研究[D].陕西科技大学，2014.
（作者单位：1.广西中知国华知识产权代理有限公司;2.广西中知科创知识产权代理有限公司）