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摘 要：近年来，人们对防晒化妆品使用效果的要求逐渐增加，防晒产品中防晒剂由单一添加配方逐渐变成复配使用为主，那么，多种防晒剂的复合使用是否安全，会带来哪些潜在风险，这是消费者也是研究人员十分关注的问题。体外安全性评价法由于测试时间短，试验效率有所提高，同时避免了动物试验成本高、周期长、重复性差及人体安全等问题，所以现在各企业和研究人员会优先考虑体外评价法。文章主要介绍通过3D皮肤模型刺激性试验、眼刺激试验等体外方法对防晒产品进行安全性评价的原理。
关键词：防晒产品;安全性评价;体外方法;3D皮肤模型刺激性试验;眼刺激试验
中图分类号：R542.22 文献标识码：A 文章编号：1674-1064（2021）01-074-02
DOI：10.12310/j.issn.1674-1064.2021.01.032
随着人们生活水平逐渐提高，具有美白、祛斑、抗氧化等功效的化妆品在人们日常生活中的使用越来越多，防晒化妆品逐渐成为化妆品行业的重要产品之一。化妆品中加入防晒剂，是为了吸收或阻挡紫外线，使人体皮肤免受紫外线的损害。紫外线光谱有UVB、UVA、UVC三种。三者中，UVA和UVB对人体有直接危害;UVC的波长最短，但其能量最高，由于大气层的作用，几乎没有到达地球表面的概率。白天的日照光含有大量UVB，其大部分会被大气层吸收，只有极少量能到达地球表面，长时间照射会令皮肤产生黑色素，并会导致皮肤红肿甚至蜕皮。白天的日照光中含有的UVA大部分能穿过大气层到达地球表面，它对人体产生的危害是最大的，会破坏人体皮肤中的一些纤维组合物，对皮肤的伤害是累积且不可逆的。由此可见，人们对防晒化妆品的需求逐渐增加是非常必要的。
防晒化妆品是指隔绝或吸收阳光中的UVA和UVB，以防护人体皮肤免受或减少紫外线所引起的不良反应为目的的化妆品。防晒化妆品中防晒剂的使用种类与使用量，不得超过规定要求的最大允许使用浓度，以确保防晒产品的使用安全性。
近年来，随着消费者对防晒化妆品提出的使用要求或使用效果的增多，防晒产品中防晒剂的使用种类由原本仅添加一种逐渐增加到三至五种，一些企业为了达到其宣称的更好的防晒效果，添加的防晒剂种类甚至更多。目前来说，围绕多种防晒剂一起使用是否有相互产生作用的研究还不多，那么多种防晒剂的复合使用是否安全，会带来什么潜在风险，这也是消费者和研究人员十分关注的问题。
目前，我国在安全性评价方面的方法有很多，其中，体外安全性评价法由于测试时间短，试验效率有所提高，同时避免了动物试验成本高、周期长、重复性差及人体安全等问题，所以现在各企业和研究人员会优先考虑体外评价法。
1 安全性评价体外方法
1.1 3T3中性红摄取光毒性试验
作为动物皮肤光毒性试验的一种体外替代方法，我国体外3T3中性红摄取光毒性试验的技术已通过国家相关标准的测试，试验技术日臻成熟，试验步骤容易操作，测试费用低，测试周期短。
3T3中性红摄取光毒性试验结果是通过比较细胞毒性来判断的，该试验中的细胞毒性表现为在试验样品被模拟阳光辐射后的18～24小时，活性染料中性红（NR）摄取的浓度来呈现的。NR是一种深绿色结晶性粉末、弱的阳离子染料，其在常温常压下稳定，是一种活体及细胞的染色剂。当细胞质的pH值接近中性时，NR不带电，而是变成带正电并困在低pH的溶酶体腔内。低pH的溶酶体腔的维持，需要ATP，并且依赖于溶酶体膜的完整性。光毒素可通过形成活性氧（ROS）等机制诱导细胞损伤，导致溶酶体膜通透性增加、pH梯度降低等逐渐形成的变化是不可逆的。这种情况引起的变化会导致NR的摄取和结合的减少，因此有可能区分活细胞和受损或死亡细胞。
秦美蓉等[1]通过对3T3中性红摄取光毒性试验的验证研究，验证了3T3成纤维细胞中性红摄取试验检测化学物质光毒性试验方法的可行性。
1.2 3D皮肤模型刺激性试验
3D皮肤模型是将特定细胞从人体活体皮肤组织中获取并分离出来，后将细胞培养于特定的培养液上而得到的具有高度模拟人体皮肤模型。因为跟人体有相似的保护系统，因此可以避免因种间差异造成的试验结果偏差。市场上常用的三维皮肤模型包括3D黑素皮肤模型（有我国的MelaKutis、美国的MelanoDerm等）、3D表皮模型（EpiKutis）、3D全层皮肤模型（有美国的EpiDrmFT、我国的FulKutis等）。皮肤刺激性试验适用的皮肤模型是体外重组表皮模型EpiKutis、EpiDerm等。
皮肤模型体外刺激性评价主要包括皮肤刺激性单点试验（SIT）和时间毒性（ET50）试验。SIT试驗是将防晒化妆品或原料与表皮模型反应，冲洗干净，于特定条件的CO2培养箱中培养后，用MTT法对反应后的表皮模型进行细胞活性的测试。根据皮肤表面组织活力来定性评价防晒化妆品或原料有无刺激性，组织活力大于50%判为无刺激性（NI）;组织活力小于50%判为有刺激性（I）。对于部分温和的防晒化妆品或原料，需要延长样品在模型的表面的停留时间，按照不同时间点进行暴露，以时间毒性（ET50）进一步评价不同防晒化妆品或不同原料之间的刺激性强弱。以不同时间点组织活力下降曲线来判定，ET50越小，表示模型对防晒化妆品或原料的耐受时间越短，则防晒化妆品或原料的时间毒性越强，因此时间毒性试验特别适用于原料或配方与时间相关的刺激性进行比较。
Kandárová[2]等使用EpiDerm SIT验证皮肤模型在皮肤刺激性中的可行性，可以区分有无刺激性。简而言之，使用3D皮肤模型评价防晒化妆品或原料的皮肤刺激性，试验周期短，相对于动物模型和临床试验，因其操作简单、评价指标直观、测试成本减少、测试费用减少等特点，日益受到研究人员和企业的青睐。
1.3 眼刺激试验 1.3.1 短时暴露试验
短时暴露试验采用的是兔角膜上皮细胞（SIRC），在培养板培养，然后将测试样本暴露后，采用CCK-8细胞毒性测试法定量检测细胞存活率。暴露后的细胞与CCK-8试剂反应，活细胞线粒体中的脱氢酶会将CCK-8试剂还原成橙黄色的甲臜染料，存活细胞越多，被还原成的染料就越多，这时候，不同的颜料颜色与存活的细胞数量有线性关系。测定波长450 nm时的吸光度值，计算细胞的生存率，最终判断样品的眼刺激性程度。细胞的存活率大于70%，可判定样品为无刺激或具有轻微刺激性;细胞的存活率小于或等于70%，需进行刺激性确认试验，刺激性确认试验后，如果细胞的存活率大于30%，证明样品为中等眼刺激的样品，如果细胞的存活率小于或等于30%，证明样品为强眼刺激的样品。
细胞培养是指将组织用胰蛋白酶等处理分离出来，于模仿人体体内生长环境等条件下培养。其要在一定的生理条件下才能存活，对生存条件比较严苛。细胞培养现在已经广泛应用于我国的细胞学、化妆品等各个领域，成为基础研究科学的重要组成部分。黄琼[3]等研究基因转染家兔角膜上皮细胞，通过破裂解法提取质粒、细胞培养、转染结果的免疫组化检测等试验步骤，证实了外源基因可以转移至兔角膜上皮细胞内，为提高外源基因的靶向性和转移效率提供了研究方向。
1.3.2 体外重组人角膜上皮模型试验
体外重组人角膜上皮模型是由正常人角质细胞的非角质化上皮构成，能够模拟多层角膜上皮。据研究，SkinEthicTM和EpiOculaTM在眼刺激性试验中具有良好的重复性。该试验是将防晒化妆品或原料涂布作用于三维重组类似人角膜上皮组织模型，一定时间暴露后经过清洗、孵育等步骤，通过MTT试验测试组织细胞生存率，從而判定样品的刺激性。相对于阴性对照组织，样品平均组织活性大于60%时，判定该防晒化妆品或原料无眼刺激性（NI）;样品平均组织活性小于或等于50%，判定该防晒化妆品或原料具有眼刺激性（I）。
刘小勇[4]等成功探讨了人羊角膜上皮细胞诱导分化为角膜上皮细胞的可塑性及其重建角膜上皮的可行性，利用角膜基质作为载体诱导HAECs分化，得到了在形态结构以及在角膜上皮特异性表面标志蛋白CK3/12表达上，均类似角膜上皮细胞的细胞，进一步证明角膜基质微环境在调控角膜上皮细胞的分化过程中起重要作用。
2 结语
物理防晒剂是不吸收紫外线的，它只起到物理阻挡及反射、散射紫外线的作用，是不改变自身的一个成分，相对于化学防晒剂来说比较稳定。而化学防晒剂会吸收紫外线能量，大多化学防晒剂是可被皮肤吸收，然后进入皮下组织、血液循环系统等，而被皮肤吸收的成分是否存在潜在风险仍是未知数。由于目前企业或机构对于多种化学防晒剂一起使用是否有相互作用的研究不多，在试验防晒产品的复配中，没有控制多种化学防晒剂浓度的限度，种种因素叠加，可能给使用防晒化妆品的消费者带来一定的风险。
参考文献
[1] 秦美蓉.3T3中性红摄取光毒性试验的验证研究[J].今日药学，2012，22（11）：687-689.
[2] Kandárová H，Hayden P，Klausner M，et al.An In Vitro Skin Irritation Test（SIT）using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal（RHE）Model[J].Electrophoresis，2009，（29）：1366.
[3] 黄琼，胡燕华，姜发纲，等.脂质体介导TGF-β1质粒DNA转染家兔角膜上皮细胞的实验研究[J].眼视光学杂志，2002，4（2）：103-105，108.
[4] 刘小勇，陈剑，周清，等.人羊角膜上皮细胞体外培养重建角膜上皮的实验研究[J].中国病理生理杂志，2012，28（4）：689-693.
关键词：防晒产品;安全性评价;体外方法;3D皮肤模型刺激性试验;眼刺激试验
中图分类号：R542.22 文献标识码：A 文章编号：1674-1064（2021）01-074-02
DOI：10.12310/j.issn.1674-1064.2021.01.032
随着人们生活水平逐渐提高，具有美白、祛斑、抗氧化等功效的化妆品在人们日常生活中的使用越来越多，防晒化妆品逐渐成为化妆品行业的重要产品之一。化妆品中加入防晒剂，是为了吸收或阻挡紫外线，使人体皮肤免受紫外线的损害。紫外线光谱有UVB、UVA、UVC三种。三者中，UVA和UVB对人体有直接危害;UVC的波长最短，但其能量最高，由于大气层的作用，几乎没有到达地球表面的概率。白天的日照光含有大量UVB，其大部分会被大气层吸收，只有极少量能到达地球表面，长时间照射会令皮肤产生黑色素，并会导致皮肤红肿甚至蜕皮。白天的日照光中含有的UVA大部分能穿过大气层到达地球表面，它对人体产生的危害是最大的，会破坏人体皮肤中的一些纤维组合物，对皮肤的伤害是累积且不可逆的。由此可见，人们对防晒化妆品的需求逐渐增加是非常必要的。
防晒化妆品是指隔绝或吸收阳光中的UVA和UVB，以防护人体皮肤免受或减少紫外线所引起的不良反应为目的的化妆品。防晒化妆品中防晒剂的使用种类与使用量，不得超过规定要求的最大允许使用浓度，以确保防晒产品的使用安全性。
近年来，随着消费者对防晒化妆品提出的使用要求或使用效果的增多，防晒产品中防晒剂的使用种类由原本仅添加一种逐渐增加到三至五种，一些企业为了达到其宣称的更好的防晒效果，添加的防晒剂种类甚至更多。目前来说，围绕多种防晒剂一起使用是否有相互产生作用的研究还不多，那么多种防晒剂的复合使用是否安全，会带来什么潜在风险，这也是消费者和研究人员十分关注的问题。
目前，我国在安全性评价方面的方法有很多，其中，体外安全性评价法由于测试时间短，试验效率有所提高，同时避免了动物试验成本高、周期长、重复性差及人体安全等问题，所以现在各企业和研究人员会优先考虑体外评价法。
1 安全性评价体外方法
1.1 3T3中性红摄取光毒性试验
作为动物皮肤光毒性试验的一种体外替代方法，我国体外3T3中性红摄取光毒性试验的技术已通过国家相关标准的测试，试验技术日臻成熟，试验步骤容易操作，测试费用低，测试周期短。
3T3中性红摄取光毒性试验结果是通过比较细胞毒性来判断的，该试验中的细胞毒性表现为在试验样品被模拟阳光辐射后的18～24小时，活性染料中性红（NR）摄取的浓度来呈现的。NR是一种深绿色结晶性粉末、弱的阳离子染料，其在常温常压下稳定，是一种活体及细胞的染色剂。当细胞质的pH值接近中性时，NR不带电，而是变成带正电并困在低pH的溶酶体腔内。低pH的溶酶体腔的维持，需要ATP，并且依赖于溶酶体膜的完整性。光毒素可通过形成活性氧（ROS）等机制诱导细胞损伤，导致溶酶体膜通透性增加、pH梯度降低等逐渐形成的变化是不可逆的。这种情况引起的变化会导致NR的摄取和结合的减少，因此有可能区分活细胞和受损或死亡细胞。
秦美蓉等[1]通过对3T3中性红摄取光毒性试验的验证研究，验证了3T3成纤维细胞中性红摄取试验检测化学物质光毒性试验方法的可行性。
1.2 3D皮肤模型刺激性试验
3D皮肤模型是将特定细胞从人体活体皮肤组织中获取并分离出来，后将细胞培养于特定的培养液上而得到的具有高度模拟人体皮肤模型。因为跟人体有相似的保护系统，因此可以避免因种间差异造成的试验结果偏差。市场上常用的三维皮肤模型包括3D黑素皮肤模型（有我国的MelaKutis、美国的MelanoDerm等）、3D表皮模型（EpiKutis）、3D全层皮肤模型（有美国的EpiDrmFT、我国的FulKutis等）。皮肤刺激性试验适用的皮肤模型是体外重组表皮模型EpiKutis、EpiDerm等。
皮肤模型体外刺激性评价主要包括皮肤刺激性单点试验（SIT）和时间毒性（ET50）试验。SIT试驗是将防晒化妆品或原料与表皮模型反应，冲洗干净，于特定条件的CO2培养箱中培养后，用MTT法对反应后的表皮模型进行细胞活性的测试。根据皮肤表面组织活力来定性评价防晒化妆品或原料有无刺激性，组织活力大于50%判为无刺激性（NI）;组织活力小于50%判为有刺激性（I）。对于部分温和的防晒化妆品或原料，需要延长样品在模型的表面的停留时间，按照不同时间点进行暴露，以时间毒性（ET50）进一步评价不同防晒化妆品或不同原料之间的刺激性强弱。以不同时间点组织活力下降曲线来判定，ET50越小，表示模型对防晒化妆品或原料的耐受时间越短，则防晒化妆品或原料的时间毒性越强，因此时间毒性试验特别适用于原料或配方与时间相关的刺激性进行比较。
Kandárová[2]等使用EpiDerm SIT验证皮肤模型在皮肤刺激性中的可行性，可以区分有无刺激性。简而言之，使用3D皮肤模型评价防晒化妆品或原料的皮肤刺激性，试验周期短，相对于动物模型和临床试验，因其操作简单、评价指标直观、测试成本减少、测试费用减少等特点，日益受到研究人员和企业的青睐。
1.3 眼刺激试验 1.3.1 短时暴露试验
短时暴露试验采用的是兔角膜上皮细胞（SIRC），在培养板培养，然后将测试样本暴露后，采用CCK-8细胞毒性测试法定量检测细胞存活率。暴露后的细胞与CCK-8试剂反应，活细胞线粒体中的脱氢酶会将CCK-8试剂还原成橙黄色的甲臜染料，存活细胞越多，被还原成的染料就越多，这时候，不同的颜料颜色与存活的细胞数量有线性关系。测定波长450 nm时的吸光度值，计算细胞的生存率，最终判断样品的眼刺激性程度。细胞的存活率大于70%，可判定样品为无刺激或具有轻微刺激性;细胞的存活率小于或等于70%，需进行刺激性确认试验，刺激性确认试验后，如果细胞的存活率大于30%，证明样品为中等眼刺激的样品，如果细胞的存活率小于或等于30%，证明样品为强眼刺激的样品。
细胞培养是指将组织用胰蛋白酶等处理分离出来，于模仿人体体内生长环境等条件下培养。其要在一定的生理条件下才能存活，对生存条件比较严苛。细胞培养现在已经广泛应用于我国的细胞学、化妆品等各个领域，成为基础研究科学的重要组成部分。黄琼[3]等研究基因转染家兔角膜上皮细胞，通过破裂解法提取质粒、细胞培养、转染结果的免疫组化检测等试验步骤，证实了外源基因可以转移至兔角膜上皮细胞内，为提高外源基因的靶向性和转移效率提供了研究方向。
1.3.2 体外重组人角膜上皮模型试验
体外重组人角膜上皮模型是由正常人角质细胞的非角质化上皮构成，能够模拟多层角膜上皮。据研究，SkinEthicTM和EpiOculaTM在眼刺激性试验中具有良好的重复性。该试验是将防晒化妆品或原料涂布作用于三维重组类似人角膜上皮组织模型，一定时间暴露后经过清洗、孵育等步骤，通过MTT试验测试组织细胞生存率，從而判定样品的刺激性。相对于阴性对照组织，样品平均组织活性大于60%时，判定该防晒化妆品或原料无眼刺激性（NI）;样品平均组织活性小于或等于50%，判定该防晒化妆品或原料具有眼刺激性（I）。
刘小勇[4]等成功探讨了人羊角膜上皮细胞诱导分化为角膜上皮细胞的可塑性及其重建角膜上皮的可行性，利用角膜基质作为载体诱导HAECs分化，得到了在形态结构以及在角膜上皮特异性表面标志蛋白CK3/12表达上，均类似角膜上皮细胞的细胞，进一步证明角膜基质微环境在调控角膜上皮细胞的分化过程中起重要作用。
2 结语
物理防晒剂是不吸收紫外线的，它只起到物理阻挡及反射、散射紫外线的作用，是不改变自身的一个成分，相对于化学防晒剂来说比较稳定。而化学防晒剂会吸收紫外线能量，大多化学防晒剂是可被皮肤吸收，然后进入皮下组织、血液循环系统等，而被皮肤吸收的成分是否存在潜在风险仍是未知数。由于目前企业或机构对于多种化学防晒剂一起使用是否有相互作用的研究不多，在试验防晒产品的复配中，没有控制多种化学防晒剂浓度的限度，种种因素叠加，可能给使用防晒化妆品的消费者带来一定的风险。
参考文献
[1] 秦美蓉.3T3中性红摄取光毒性试验的验证研究[J].今日药学，2012，22（11）：687-689.
[2] Kandárová H，Hayden P，Klausner M，et al.An In Vitro Skin Irritation Test（SIT）using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal（RHE）Model[J].Electrophoresis，2009，（29）：1366.
[3] 黄琼，胡燕华，姜发纲，等.脂质体介导TGF-β1质粒DNA转染家兔角膜上皮细胞的实验研究[J].眼视光学杂志，2002，4（2）：103-105，108.
[4] 刘小勇，陈剑，周清，等.人羊角膜上皮细胞体外培养重建角膜上皮的实验研究[J].中国病理生理杂志，2012，28（4）：689-693.