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摘 要：为明确生长素与水稻锰毒及抗性的关系，揭示水稻锰毒调控机制，该文采用水培方法研究了锰胁迫对水稻根尖游离生长素含量的影响及外源生长素萘乙酸对水稻幼苗锰吸收、积累和毒害的影响。结果表明：（1）在2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中培养的水稻，根尖游离吲哚乙酸含量显著下降，仅为对照处理的47.7%;水稻根相对伸长率也显著减少，降至对照处理的71.1%。（2）在锰溶液中添加生长素极性运输抑制剂萘基邻氨甲酰苯甲酸（NPA）后，根尖锰含量显著增加，达到了对照处理的1.5倍。（3）在锰溶液中添加萘乙酸后，虽然根尖细胞壁锰含量与对照处理间的差异不显著，但是水稻根相对伸长率显著降低，而植株锰吸收量、根尖锰含量、根尖细胞液中锰的分配比均显著增加;茎基部浸入锰溶液中的离体稻株叶片中的锰含量也在加入萘乙酸后显著提高;在锰胁迫下，添加外源萘乙酸后，水稻根尖OsYSL2、OsYSL6及OsMTP8.1的表达均显著增加。综上结果说明，过量的锰显著抑制水稻根伸长，降低水稻根尖游离态生长素水平，而生长素参与调控水稻对锰的吸收、转运及毒性。
关键词：水稻，生长素，锰，吸收，积累
中图分类号：Q945
文献标识码：A
文章编号：1000-3142（2021）09-1411-06
Abstract：In order to clarify the relationship between auxin and Mn toxicity and resistance of rice，and to reveal the regulatory mechanism of Mn toxicity in rice，the effects of Mn stress on the content of free auxin in root tips of rice and the effects of exogenous auxin NAA on the absorption，accumulation and toxicity of Mn in rice seedlings were studied by hydroponic experiments. The results were as follows：（1）The content of free indoleacetic acid in root tips of rice cultivated in 2 000 μmol·L-1 MnCl2 solution decreased significantly，which was only 47.7% of the control treatment; The relative root elongation was also significantly reduced to 71.1% of the control treatment. （2）The content of Mn in root tips increased significantly after adding the polar auxin transport inhibitor NPA to the Mn solution，which was 1.5 times that of the control treatment. （3）After adding NAA into the Mn solution，the Mn content in root tip cell wall was not significantly different from that of the control treatment，but the relative root elongation was significantly reduced while the absorption amount of Mn in plants，the Mn content in root tips and the distribution ratio of Mn into cell sap of root tips were all significantly increased; The Mn content in the leaves of vitro rice plants immersed in the Mn solution at the stem base was also significantly increased after the addition of NAA; The expressions of OsYSL2，OsYSL6 and OsMTP8.1 in root tips of rice were significantly increased after the addition of NAA under Mn stress. These results indicate that excessive Mn can significantly inhibit root elongation and reduce the level of free auxin in rice root tips. Auxin was involved in the regulation of Mn absorption，transport and toxicity in rice.
Key words：rice，auxin，Mn，absorption，accumulation
錳是植物正常生长发育必需的营养元素。然而，过量的锰会扰乱植物代谢，导致营养失衡、活性氧自由基积累、光合作用受阻，最终抑制植物的正常生长（龙光霞等，2011;吴星等，2015;Huang et al.，2016）。锰毒症状多表现为老叶叶尖和叶缘焦枯，并在叶面上分布大小不一的褐色坏死斑点。幼叶失绿也是一些植物锰毒害的症状（Huang et al.，2016;Yang et al.，2019）。锰毒害是植物吸收、积累过多锰的结果。植物对锰的吸收、转运和分配受金属转运蛋白如NRAMP、YSL、CDFs等家族成员的调节（Socha & Guerinot，2014）。水稻中包含7个NRAMP家族基因，目前仅报道OsNRAMP3和OsNRAMP5具有吸收、转运锰的功能。OsNRAMP3 定位在木质部转移细胞和韧皮部维管束，具有转运锰的功能，可调节锰在新老组织间的分配（Yamaji et al.，2013）。水稻中有18个YSL家族基因，其中OsYSL2参与锰在植物体内的长距离运输及分配（Ishimaru et al.，2010）。OsYSL6 在根系和苗中表达，敲除 OsYSL6 的突变体仅在高锰条件下抑制根系和苗的生长（Sasaki et al.，2011）。水稻 Mn-CDFs 家族包括5个基因，已有关于OsMTP8.1、OsMTP8.2、OsMTP9在锰吸收和转运功能方面的报道。OsMTP8.1是定位于液泡膜上的锰特异性转运蛋白，可以将过量的锰隔离在根系液泡中，以减轻高锰对水稻的毒害作用（Chen et al.，2013）。 生长素是重要的植物激素，在植物逆境响应及抗性调控中发挥着重要作用。游离吲哚乙酸（IAA）可以显著减轻Cu2+对向日葵主根生长的毒害，促进侧根生长（Ouzounidou & Ilias，2005）。在盐胁迫下，IAA 通过降低大豆幼苗膜脂的过氧化伤害，增强大豆幼苗对盐渍环境的抵抗能力，缓解盐害（魏爱丽和陈云昭，2000）。过量的锰会抑制生长素的合成并加速生长素的分解（Zhao et al.，2017）。而生长素作为一种信号物质，在影响植物生长发育的同时也影响植物对锰毒的抗性。外源IAA能减轻豌豆锰毒，提高植物对锰毒的抗性（Sarita & Dubey，2011）。类生长素植物生长调节剂萘乙酸（NAA）可以刺激拟南芥根细胞壁半纤维素1的合成而使更多的镉吸附在细胞壁上，减少镉向地上部的转运，从而减轻镉的毒害（朱晓芳，2014）。生长素也可能参与甘蔗对锰吸收的调控，外源NAA能减少甘蔗对锰的吸收并缓解甘蔗的锰毒（武欣等，2018）。这些发现暗示着植物生长素与锰毒之间似乎存在某种关联（Gangwar et al.，2010）。然而，关于生长素是否调控锰积累与毒害、外源生长素是否调控水稻锰吸收、转运和分配方面的研究國内外鲜有报道。因此，该文研究了锰对水稻生长素含量的影响及外源生长素NAA对水稻锰吸收、转运、锰转运蛋白基因表达的影响，旨在为揭示生长素对水稻锰毒的调控作用及相关机制提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
供试水稻品种为‘日本晴’。种子经消毒（1%次氯酸钠）、浸种、催芽后均匀播撒于底部为筛网的塑料框内，在种子上覆盖纱布保湿，塑料框架在培养盆上。培养盆内盛0.5 mmol·L-1 CaCl2溶液，液面紧贴筛网。待种子出芽、幼根长约2 cm后，将幼苗移栽到内盛0.5 mmol·L-1 CaCl2 （pH 5.6）溶液的1 L塑料烧杯中培养，每盆10株。1周后培养液更换为1/2木村B营养液（pH5.6）。培养液每隔2 d更换一次。植株长势一致的幼苗为供试材料。
1.2 实验方法
1.2.1 锰对水稻根尖生长素含量的影响 将供试幼苗分别于0 （对照，CK）、 2 000 μmol·L-1MnCl2溶液中培养。每处理重复3次，培养液含0.5 mmol·L-1 CaCl2，pH为5.6（下同）。培养1 d后，切取距尖端1.0 cm的根尖。提取IAA，采用酶联免疫吸附法通过酶标仪测定根尖IAA含量，每个测定样品含60条根尖。根尖经微波消解法消化后用原子吸收分光光度仪测定其锰含量（下同）。
1.2.2 生长素极性运输抑制剂对根尖锰积累的影响 将供试幼苗分别于内含0、40 nmol·L-1 NAA、1 000 nmol·L-1萘基邻氨甲酰苯甲酸（NPA）的2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中培养。培养1 d后切取根尖1.0 cm，消化后测定其锰含量。
1.2.3 萘乙酸对根伸长和锰吸收、转运及分布的影响 为探讨NAA对水稻根伸长及根尖锰含量的影响，将供试幼苗分别于0、1 000、2 000 μmol·L-1 MnCl2或内含0、40、80 nmol·L-1 NAA的2 000 μmol·L-1 MnCl2的溶液中培养。培养前和培养1 d后分别测量根长，计算根伸长率。每处理测定15条根的伸长率。处理1 d后切取根尖1.0 cm，消化后测定其锰含量。
为探讨NAA对根尖细胞液及细胞壁锰含量的影响，将供试幼苗培养于含0（-NAA）、80 nmol·L-1 NAA（+NAA）和2 000 μmol·L-1 MnCl2的CaCl2溶液中，培养1 d后，根系经去离子水洗后切取根尖1.0 cm，每处理取60条根尖，参照朱晓芳（2014）的方法提取细胞液及细胞壁，消化后测定其锰含量。
为探讨NAA对锰从茎基部至叶片间的长距离运输的影响，将从基部剪下的离体稻株茎基部浸入至含有0、80 nmol·L-1 NAA的2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中来测定叶片锰含量。供试植株为在1/2木村B营养液中培养至抽穗期的稻株，地上部的叶片数、节数相同。为保证离体植株短期内保持正常生理活性，短时处理8 h后取+1叶（第一片完全展开叶）、+2叶（第二片完全展开叶）叶片，消化后测定其锰含量。
为探讨NAA对锰累积和吸收的影响，将在1/2木村B营养液中培养3周的幼苗转移至含0、80 nmol·L-1 NAA的2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中培养。培养3 d后，收获植株，称重、水洗、消化后测定地上部与根系中的锰含量，计算锰吸收量。
1.2.4 萘乙酸对锰转运蛋白基因表达的影响 将供试幼苗分别于内含0、80 nmol·L-1 NAA的2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中培养。培养1 d后，切取根尖来提取RNA，反转录后通过荧光实时定量PCR仪分析锰转运蛋白OsNRAMP3、OsYSL2、OsYSL6及OsMTP8.1基因的表达。
1.3 统计分析
数据采用新复极差法进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 锰对水稻根尖生长素含量、根尖锰含量及根伸长的影响
在高锰胁迫下，水稻根尖生长素含量显著下降（图1：A）。 2 000 μmol·L-1 MnCl2处理的根尖IAA含量为50.0 μg·kg-1，相当于对照（CK）处理的47.7%。MnCl2处理后的根尖锰含量显著增加，而根伸长率显著降低（图1：B）。2 000 μmol·L-1 MnCl2处理后的根尖锰含量达到了3.54 μg·root tip-1，为CK处理的2.3倍，而根伸长率降至CK处理的71.1%。结果表明，过量的锰使水稻根尖游离生长素的水平降低并显著抑制水稻根伸长。 2.2 生长素极性运输抑制剂对根尖锰含量的影响
NPA是生长素极性输出抑制剂。在2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中加入NPA后，水稻根尖的锰含量显著增加（图2）。CK处理的根尖锰含量为1.21 μg·root tip-1，NAA和NPA处理的根尖锰含量分别为1.67、1.90 μg·root tip-1。NPA处理的根尖锰含量为CK处理的1.5倍。结果表明，NPA抑制了根尖生长素的极性输出，使生长素在根尖积累，根尖内源生长素的输出参与了根尖锰积累的调控。
2.3 萘乙酸对水稻根伸长和锰吸收、转运及分布的影响
在2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中添加NAA后，水稻根伸长显著减少（图3）。40、80 nmol·L-1NAA处理的根伸长率分别降至对照的44.9%、27.5%。在高锰胁迫下，根尖锰含量随着外源施加NAA浓度的提高而显著增加。40、80 nmol L-1NAA处理后，根尖锰含量（0.91、1.30 μg·root tip-1）分别为对照（0.44 μg·root tip-1）的2.1、3.0倍。结果表明，NAA能够显著抑制水稻根伸长并增加根尖的锰积累。
在2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中添加NAA后，植株锰吸收量显著高于对照（-NAA），为对照的2.8倍（表1）。将离体的稻株基部浸入2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中8 h后，可检测到从茎基部运输到叶片中的锰。锰溶液中的NAA使新完全展开叶中的锰含量显著增加（表1）。NAA处理后+1叶、+2叶的锰含量分别为229.50、295.14 mg·kg-1，分别比对照（-NAA）处理的锰含量（138.73、173.66 mg·kg-1）高65.4%和70.0%。在锰毒胁迫条件下，NAA处理后根尖细胞液中锰的分配量显著增加（表1）。NAA处理后，锰在根尖细胞液中的占比高达53.67%，显著高于对照（-NAA）处理（45.86%）。相反，NAA处理植株根尖细胞壁中的锰含量与对照处理（-NAA）的相当。结果表明，NAA能够显著提高锰吸收量，NAA处理有利于锰的长距离运输和在液泡中的积累，NAA参与水稻锰吸收、转运和分布的调控。
2.4 萘乙酸对锰转运蛋白基因表达的影响
OsNRAMP3是定位于质膜的锰专一转运蛋白，定位在茎基部及茎节的木质部转移细胞，参与锰在地上部的分配。在2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中加入NAA后，茎节点的OsNRAMP3表达水平与对照（-NAA）相当（图4）。OsYSL2是锰向地上部运输必需的转运蛋白。在锰胁迫下，NAA处理后的根尖OsYSL2表达水平显著提高（图4）。OsMTP8.1和OsYSL6是水稻锰的解毒蛋白（Socha & Guerinot，2014）。虽然OsYSL6的亚细胞定位尚不清楚，但是已明确OsMTP8.1定位于液泡膜。OsYSL6和OsMTP8.1功能缺失的突变体更容易受到锰的毒害。在2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中加入NAA后，根尖OsYSL6和OsMTP8.1的表达水平均显著上调（图4）。NAA处理后根尖OsYSL2、OsYSL6和OsMTP8.1的表达水平分别上调2.7、1.6和2.1倍。这些结果进一步说明NAA参与锰从根向地上部转运的调控，NAA处理有利于錳在液泡中积累并调控水稻锰毒害。
3 讨论与结论
生长素是重要的植物激素，大量的研究发现生长素参与植物铝、镉、锌毒害和抗性的调控。然而，生长素对水稻锰毒害的调控及其机制的研究却鲜有报道。
本研究发现生长素参与水稻锰吸收的调控。在锰毒胁迫下，水稻根尖锰含量显著增加，而IAA的含量显著减少。这与前人在拟南芥上的研究结果相似，在锰毒胁迫下，植物组织中IAA氧化酶活性增加、生长素分解加快，而生长素水平下降（Schwertner & Morgan，1966;孙雅慧，2016;Zhao et al.，2017）。在锰溶液中添加NAA后，植株锰积累量和吸收量显著增加。Prabhakar et al.（2013）研究发现叶面喷施NAA也可以促进豇豆对锰的吸收。本研究还发现，锰溶液中的生长素极性运输抑制剂NPA处理使根尖中锰的积累量增加。李春俭（1995）研究发现NPA处理影响根尖内源生长素极性分布，NPA处理会造成生长素在处理部位的积累。本研究结果表明，锰胁迫会降低水稻根尖内源生长素的含量，而内源生长素参与调控水稻的锰吸收及锰积累。
本研究发现生长素参与调控锰的长距离运输。生长素处理有利于苜蓿中锰向地上部转运（Lopez et al.，2009），生长素也影响镉在玉米中的移动性（张婷，2012）。本研究结果表明，外源NAA处理后从茎基部向叶片转运的锰显著增加。虽然定位于茎节上的锰转运蛋白OsNRAMP3的基因表达水平并不受NAA处理的影响，但是参与锰向地上部转运蛋白OsYSL2的基因在NAA处理后显著上调。结果表明，NAA处理能够增加锰向地上部的转运，外源NAA可能通过内源生长素调控水稻中锰的长距离运输。
本研究发现生长素参与水稻对锰毒害及耐性的调控。在锰毒胁迫下根伸长显著受阻，而NAA（40、80 nmol·L-1）处理影响锰引起的根伸长。朱晓芳（2014）采用与本研究相近的NAA浓度（50 nmol·L-1），结果发现NAA影响拟南芥根伸长。大量研究结果表明，将锰转运至液泡中避免有毒的锰对细胞膜或其他亚细胞器的伤害是一些植物种类耐锰的主要机制（Chen et al.，2013;赵秋芳等，2019）。在锰毒胁迫下，NAA处理后细胞液中锰积累量增加，并且定位于液泡膜上的锰解毒蛋白OsMTP8.1的基因表达在NAA处理后也显著上调。与此相似，在锰胁迫下，耐锰蛋白OsYSL6的基因表达水平也显著上调。结果说明外源NAA可能通过影响耐锰蛋白基因的表达和液泡中锰的积累来调控植物锰毒及耐性。 综上所述，在锰胁迫条件下，水稻内源生长素水平下降，而生长素参与水稻锰吸收、转运、分布及毒性的调控。
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（责任编辑 何永艳）
关键词：水稻，生长素，锰，吸收，积累
中图分类号：Q945
文献标识码：A
文章编号：1000-3142（2021）09-1411-06
Abstract：In order to clarify the relationship between auxin and Mn toxicity and resistance of rice，and to reveal the regulatory mechanism of Mn toxicity in rice，the effects of Mn stress on the content of free auxin in root tips of rice and the effects of exogenous auxin NAA on the absorption，accumulation and toxicity of Mn in rice seedlings were studied by hydroponic experiments. The results were as follows：（1）The content of free indoleacetic acid in root tips of rice cultivated in 2 000 μmol·L-1 MnCl2 solution decreased significantly，which was only 47.7% of the control treatment; The relative root elongation was also significantly reduced to 71.1% of the control treatment. （2）The content of Mn in root tips increased significantly after adding the polar auxin transport inhibitor NPA to the Mn solution，which was 1.5 times that of the control treatment. （3）After adding NAA into the Mn solution，the Mn content in root tip cell wall was not significantly different from that of the control treatment，but the relative root elongation was significantly reduced while the absorption amount of Mn in plants，the Mn content in root tips and the distribution ratio of Mn into cell sap of root tips were all significantly increased; The Mn content in the leaves of vitro rice plants immersed in the Mn solution at the stem base was also significantly increased after the addition of NAA; The expressions of OsYSL2，OsYSL6 and OsMTP8.1 in root tips of rice were significantly increased after the addition of NAA under Mn stress. These results indicate that excessive Mn can significantly inhibit root elongation and reduce the level of free auxin in rice root tips. Auxin was involved in the regulation of Mn absorption，transport and toxicity in rice.
Key words：rice，auxin，Mn，absorption，accumulation
錳是植物正常生长发育必需的营养元素。然而，过量的锰会扰乱植物代谢，导致营养失衡、活性氧自由基积累、光合作用受阻，最终抑制植物的正常生长（龙光霞等，2011;吴星等，2015;Huang et al.，2016）。锰毒症状多表现为老叶叶尖和叶缘焦枯，并在叶面上分布大小不一的褐色坏死斑点。幼叶失绿也是一些植物锰毒害的症状（Huang et al.，2016;Yang et al.，2019）。锰毒害是植物吸收、积累过多锰的结果。植物对锰的吸收、转运和分配受金属转运蛋白如NRAMP、YSL、CDFs等家族成员的调节（Socha & Guerinot，2014）。水稻中包含7个NRAMP家族基因，目前仅报道OsNRAMP3和OsNRAMP5具有吸收、转运锰的功能。OsNRAMP3 定位在木质部转移细胞和韧皮部维管束，具有转运锰的功能，可调节锰在新老组织间的分配（Yamaji et al.，2013）。水稻中有18个YSL家族基因，其中OsYSL2参与锰在植物体内的长距离运输及分配（Ishimaru et al.，2010）。OsYSL6 在根系和苗中表达，敲除 OsYSL6 的突变体仅在高锰条件下抑制根系和苗的生长（Sasaki et al.，2011）。水稻 Mn-CDFs 家族包括5个基因，已有关于OsMTP8.1、OsMTP8.2、OsMTP9在锰吸收和转运功能方面的报道。OsMTP8.1是定位于液泡膜上的锰特异性转运蛋白，可以将过量的锰隔离在根系液泡中，以减轻高锰对水稻的毒害作用（Chen et al.，2013）。 生长素是重要的植物激素，在植物逆境响应及抗性调控中发挥着重要作用。游离吲哚乙酸（IAA）可以显著减轻Cu2+对向日葵主根生长的毒害，促进侧根生长（Ouzounidou & Ilias，2005）。在盐胁迫下，IAA 通过降低大豆幼苗膜脂的过氧化伤害，增强大豆幼苗对盐渍环境的抵抗能力，缓解盐害（魏爱丽和陈云昭，2000）。过量的锰会抑制生长素的合成并加速生长素的分解（Zhao et al.，2017）。而生长素作为一种信号物质，在影响植物生长发育的同时也影响植物对锰毒的抗性。外源IAA能减轻豌豆锰毒，提高植物对锰毒的抗性（Sarita & Dubey，2011）。类生长素植物生长调节剂萘乙酸（NAA）可以刺激拟南芥根细胞壁半纤维素1的合成而使更多的镉吸附在细胞壁上，减少镉向地上部的转运，从而减轻镉的毒害（朱晓芳，2014）。生长素也可能参与甘蔗对锰吸收的调控，外源NAA能减少甘蔗对锰的吸收并缓解甘蔗的锰毒（武欣等，2018）。这些发现暗示着植物生长素与锰毒之间似乎存在某种关联（Gangwar et al.，2010）。然而，关于生长素是否调控锰积累与毒害、外源生长素是否调控水稻锰吸收、转运和分配方面的研究國内外鲜有报道。因此，该文研究了锰对水稻生长素含量的影响及外源生长素NAA对水稻锰吸收、转运、锰转运蛋白基因表达的影响，旨在为揭示生长素对水稻锰毒的调控作用及相关机制提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
供试水稻品种为‘日本晴’。种子经消毒（1%次氯酸钠）、浸种、催芽后均匀播撒于底部为筛网的塑料框内，在种子上覆盖纱布保湿，塑料框架在培养盆上。培养盆内盛0.5 mmol·L-1 CaCl2溶液，液面紧贴筛网。待种子出芽、幼根长约2 cm后，将幼苗移栽到内盛0.5 mmol·L-1 CaCl2 （pH 5.6）溶液的1 L塑料烧杯中培养，每盆10株。1周后培养液更换为1/2木村B营养液（pH5.6）。培养液每隔2 d更换一次。植株长势一致的幼苗为供试材料。
1.2 实验方法
1.2.1 锰对水稻根尖生长素含量的影响 将供试幼苗分别于0 （对照，CK）、 2 000 μmol·L-1MnCl2溶液中培养。每处理重复3次，培养液含0.5 mmol·L-1 CaCl2，pH为5.6（下同）。培养1 d后，切取距尖端1.0 cm的根尖。提取IAA，采用酶联免疫吸附法通过酶标仪测定根尖IAA含量，每个测定样品含60条根尖。根尖经微波消解法消化后用原子吸收分光光度仪测定其锰含量（下同）。
1.2.2 生长素极性运输抑制剂对根尖锰积累的影响 将供试幼苗分别于内含0、40 nmol·L-1 NAA、1 000 nmol·L-1萘基邻氨甲酰苯甲酸（NPA）的2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中培养。培养1 d后切取根尖1.0 cm，消化后测定其锰含量。
1.2.3 萘乙酸对根伸长和锰吸收、转运及分布的影响 为探讨NAA对水稻根伸长及根尖锰含量的影响，将供试幼苗分别于0、1 000、2 000 μmol·L-1 MnCl2或内含0、40、80 nmol·L-1 NAA的2 000 μmol·L-1 MnCl2的溶液中培养。培养前和培养1 d后分别测量根长，计算根伸长率。每处理测定15条根的伸长率。处理1 d后切取根尖1.0 cm，消化后测定其锰含量。
为探讨NAA对根尖细胞液及细胞壁锰含量的影响，将供试幼苗培养于含0（-NAA）、80 nmol·L-1 NAA（+NAA）和2 000 μmol·L-1 MnCl2的CaCl2溶液中，培养1 d后，根系经去离子水洗后切取根尖1.0 cm，每处理取60条根尖，参照朱晓芳（2014）的方法提取细胞液及细胞壁，消化后测定其锰含量。
为探讨NAA对锰从茎基部至叶片间的长距离运输的影响，将从基部剪下的离体稻株茎基部浸入至含有0、80 nmol·L-1 NAA的2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中来测定叶片锰含量。供试植株为在1/2木村B营养液中培养至抽穗期的稻株，地上部的叶片数、节数相同。为保证离体植株短期内保持正常生理活性，短时处理8 h后取+1叶（第一片完全展开叶）、+2叶（第二片完全展开叶）叶片，消化后测定其锰含量。
为探讨NAA对锰累积和吸收的影响，将在1/2木村B营养液中培养3周的幼苗转移至含0、80 nmol·L-1 NAA的2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中培养。培养3 d后，收获植株，称重、水洗、消化后测定地上部与根系中的锰含量，计算锰吸收量。
1.2.4 萘乙酸对锰转运蛋白基因表达的影响 将供试幼苗分别于内含0、80 nmol·L-1 NAA的2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中培养。培养1 d后，切取根尖来提取RNA，反转录后通过荧光实时定量PCR仪分析锰转运蛋白OsNRAMP3、OsYSL2、OsYSL6及OsMTP8.1基因的表达。
1.3 统计分析
数据采用新复极差法进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 锰对水稻根尖生长素含量、根尖锰含量及根伸长的影响
在高锰胁迫下，水稻根尖生长素含量显著下降（图1：A）。 2 000 μmol·L-1 MnCl2处理的根尖IAA含量为50.0 μg·kg-1，相当于对照（CK）处理的47.7%。MnCl2处理后的根尖锰含量显著增加，而根伸长率显著降低（图1：B）。2 000 μmol·L-1 MnCl2处理后的根尖锰含量达到了3.54 μg·root tip-1，为CK处理的2.3倍，而根伸长率降至CK处理的71.1%。结果表明，过量的锰使水稻根尖游离生长素的水平降低并显著抑制水稻根伸长。 2.2 生长素极性运输抑制剂对根尖锰含量的影响
NPA是生长素极性输出抑制剂。在2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中加入NPA后，水稻根尖的锰含量显著增加（图2）。CK处理的根尖锰含量为1.21 μg·root tip-1，NAA和NPA处理的根尖锰含量分别为1.67、1.90 μg·root tip-1。NPA处理的根尖锰含量为CK处理的1.5倍。结果表明，NPA抑制了根尖生长素的极性输出，使生长素在根尖积累，根尖内源生长素的输出参与了根尖锰积累的调控。
2.3 萘乙酸对水稻根伸长和锰吸收、转运及分布的影响
在2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中添加NAA后，水稻根伸长显著减少（图3）。40、80 nmol·L-1NAA处理的根伸长率分别降至对照的44.9%、27.5%。在高锰胁迫下，根尖锰含量随着外源施加NAA浓度的提高而显著增加。40、80 nmol L-1NAA处理后，根尖锰含量（0.91、1.30 μg·root tip-1）分别为对照（0.44 μg·root tip-1）的2.1、3.0倍。结果表明，NAA能够显著抑制水稻根伸长并增加根尖的锰积累。
在2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中添加NAA后，植株锰吸收量显著高于对照（-NAA），为对照的2.8倍（表1）。将离体的稻株基部浸入2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中8 h后，可检测到从茎基部运输到叶片中的锰。锰溶液中的NAA使新完全展开叶中的锰含量显著增加（表1）。NAA处理后+1叶、+2叶的锰含量分别为229.50、295.14 mg·kg-1，分别比对照（-NAA）处理的锰含量（138.73、173.66 mg·kg-1）高65.4%和70.0%。在锰毒胁迫条件下，NAA处理后根尖细胞液中锰的分配量显著增加（表1）。NAA处理后，锰在根尖细胞液中的占比高达53.67%，显著高于对照（-NAA）处理（45.86%）。相反，NAA处理植株根尖细胞壁中的锰含量与对照处理（-NAA）的相当。结果表明，NAA能够显著提高锰吸收量，NAA处理有利于锰的长距离运输和在液泡中的积累，NAA参与水稻锰吸收、转运和分布的调控。
2.4 萘乙酸对锰转运蛋白基因表达的影响
OsNRAMP3是定位于质膜的锰专一转运蛋白，定位在茎基部及茎节的木质部转移细胞，参与锰在地上部的分配。在2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中加入NAA后，茎节点的OsNRAMP3表达水平与对照（-NAA）相当（图4）。OsYSL2是锰向地上部运输必需的转运蛋白。在锰胁迫下，NAA处理后的根尖OsYSL2表达水平显著提高（图4）。OsMTP8.1和OsYSL6是水稻锰的解毒蛋白（Socha & Guerinot，2014）。虽然OsYSL6的亚细胞定位尚不清楚，但是已明确OsMTP8.1定位于液泡膜。OsYSL6和OsMTP8.1功能缺失的突变体更容易受到锰的毒害。在2 000 μmol·L-1 MnCl2溶液中加入NAA后，根尖OsYSL6和OsMTP8.1的表达水平均显著上调（图4）。NAA处理后根尖OsYSL2、OsYSL6和OsMTP8.1的表达水平分别上调2.7、1.6和2.1倍。这些结果进一步说明NAA参与锰从根向地上部转运的调控，NAA处理有利于錳在液泡中积累并调控水稻锰毒害。
3 讨论与结论
生长素是重要的植物激素，大量的研究发现生长素参与植物铝、镉、锌毒害和抗性的调控。然而，生长素对水稻锰毒害的调控及其机制的研究却鲜有报道。
本研究发现生长素参与水稻锰吸收的调控。在锰毒胁迫下，水稻根尖锰含量显著增加，而IAA的含量显著减少。这与前人在拟南芥上的研究结果相似，在锰毒胁迫下，植物组织中IAA氧化酶活性增加、生长素分解加快，而生长素水平下降（Schwertner & Morgan，1966;孙雅慧，2016;Zhao et al.，2017）。在锰溶液中添加NAA后，植株锰积累量和吸收量显著增加。Prabhakar et al.（2013）研究发现叶面喷施NAA也可以促进豇豆对锰的吸收。本研究还发现，锰溶液中的生长素极性运输抑制剂NPA处理使根尖中锰的积累量增加。李春俭（1995）研究发现NPA处理影响根尖内源生长素极性分布，NPA处理会造成生长素在处理部位的积累。本研究结果表明，锰胁迫会降低水稻根尖内源生长素的含量，而内源生长素参与调控水稻的锰吸收及锰积累。
本研究发现生长素参与调控锰的长距离运输。生长素处理有利于苜蓿中锰向地上部转运（Lopez et al.，2009），生长素也影响镉在玉米中的移动性（张婷，2012）。本研究结果表明，外源NAA处理后从茎基部向叶片转运的锰显著增加。虽然定位于茎节上的锰转运蛋白OsNRAMP3的基因表达水平并不受NAA处理的影响，但是参与锰向地上部转运蛋白OsYSL2的基因在NAA处理后显著上调。结果表明，NAA处理能够增加锰向地上部的转运，外源NAA可能通过内源生长素调控水稻中锰的长距离运输。
本研究发现生长素参与水稻对锰毒害及耐性的调控。在锰毒胁迫下根伸长显著受阻，而NAA（40、80 nmol·L-1）处理影响锰引起的根伸长。朱晓芳（2014）采用与本研究相近的NAA浓度（50 nmol·L-1），结果发现NAA影响拟南芥根伸长。大量研究结果表明，将锰转运至液泡中避免有毒的锰对细胞膜或其他亚细胞器的伤害是一些植物种类耐锰的主要机制（Chen et al.，2013;赵秋芳等，2019）。在锰毒胁迫下，NAA处理后细胞液中锰积累量增加，并且定位于液泡膜上的锰解毒蛋白OsMTP8.1的基因表达在NAA处理后也显著上调。与此相似，在锰胁迫下，耐锰蛋白OsYSL6的基因表达水平也显著上调。结果说明外源NAA可能通过影响耐锰蛋白基因的表达和液泡中锰的积累来调控植物锰毒及耐性。 综上所述，在锰胁迫条件下，水稻内源生长素水平下降，而生长素参与水稻锰吸收、转运、分布及毒性的调控。
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（责任编辑 何永艳）