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[摘要]目的：探讨上调miRNA-769-5p表达对正常人成纤维细胞生物活性的影响。方法：将miRNA-769-5p mimics转染至人成纤维细胞中，CCK-8试剂盒测定细胞增殖率，荧光显微镜下观察氧化损伤荧光，流式细胞仪测定荧光值与细胞凋亡率，将通过转染miRNA-769-5p mimics上调miRNA-769-5p表达的转染组与未经处理的对照组成纤维细胞进行比较。结果：转染组miRNA-769-5p相对表达量为（1.36±0.2）显著高于对照组的（1.0±0.1），差异有统计学意义（P<0.05）；转染组细胞增值率为（0.747±0.072）明显低于对照组的（1.007±0.025），差异有统计学意义（P<0.05）；转染组细胞荧光值（92.067±3.092）明顯高于对照组的（21.600±8.487），差异有统计学意义（P<0.05）；转染组细胞凋亡率为（49.299±5.184）%明显高于对照组的（5.977±0.939）%，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：上调miRNA-769-5p可诱导出类似紫外线光损伤效应，对正常人成纤维细胞生物活性产生影响。
[关键词]miRNA；成纤维细胞；紫外线；光损伤
[中图分类号]R329.2+8 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）04-0109-03
Effect of miRNA-769-5p on Biological Activity of Normal Human Fibroblasts
NI Na，ZHOU Bing-rong，MA Wei-wei，LUO Dan
（Department of Dermatology，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，Jiangsu，China）
Abstract： Objective To investigate the effect of miRNA-769-5p on biological activity in normal human fibroblasts. Methods Human fibroblasts were transfected with miRNA-769-5p mimic. CCK-8 kit was performed to test proliferation rate. Cell were observed under fluorescence microscope. Flow cytometer was used to measured rate of reactive oxygen species and apoptosis. All the parameters of the mimics group were compared with the control group. Results The relative expression of miRNA-769-5p in the mimics group was （1.36±0.2）， which was significantly higher than that of the control group （1.0±0.1）， the difference was statistically significant（P<0.05）. The cell proliferation rate in the mimics group （0.747±0.072） was significantly lower than that of the control group （1.007±0.025）（P<0.05）. The fluorescence value of the mimics group （92.067±3.092） was significantly higher than that of the control group （21.600±8.487）（P<0.05）. The apoptotic rate in the mimics group was （49.299 ± 5.184）%， which was significantly higher than that of the control group （5.977±0.939）%（P<0.05）. Conclusion Up-regulation of miRNA-769-5p induce photo-damage and have effect on biological activity in normal human fibroblasts.
Key words： miRNA； fibroblasts； ultraviolet； photodamage
紫外线是自然界广泛传播的一种辐射来源，研究者将其定义为一种波长为180～400nm的非电离辐射。根据波长，可将紫外线分为短波紫外线UVC（200～280nm）、中波紫外线UVB（280～320nm）和长波紫外线UVA（320～400nm）。其中短波紫外线穿透能力最弱，日光中含有的短波紫外线几乎完全被臭氧层吸收。紫外线辐射可造成被辐射细胞出现光损伤，表现为多种生物学指标异常。研究发现，除了直接受辐射的细胞，未被辐射的临近细胞甚至远隔细胞也可能出现类似的光损伤现象，这种现象被称之为“旁观者效应”[1]。在前期实验中，通过对光损伤后差异性表达的miRNA进行基因芯片筛选，发现miRNA-769-5p在光损伤中可能起到一定作用。过去的研究显示，miRNA-769-5p可以调控部分生物进程。在本次研究中，通过对正常人成纤维细胞转染外源性miRNA-769-5p，观察其对正常成纤维细胞生物活性产生的影响。 1 材料和方法
1.1 材料：成纤维细胞取自于健康成年男性包皮组织。DMEM培养液购于美国Hyclone公司，小牛血清购于杭州四季青公司，Trizol核算提取液购于美国Invitrogen公司，CCK-8试剂盒购于日本Dojindo公司，DCFH氧化损伤试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，miRNA转染试剂盒购于广州锐博生物科技有限公司，UVA、UVB照射仪购于上海希格玛高技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞的分离与培养：获得包皮后，用含青-链霉素的PBS反复冲洗3次至无肉眼可见血迹，剪去包皮皮下组织，将其剪成约0.5cm×0.5cm大小皮片，PBS冲洗3次后弃PBS，加入分散酶，放入4℃冰箱中消化18～20h后将表皮和真皮分离。取真皮部分，加入胶原酶消化液，放入37℃细胞培养箱中消化2h，取出后加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，吹打过滤后离心，之后弃细胞上清液，加入含10%胎牛血清及1%青-链霉素的DMEM培养基，转移至培养皿中，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
1.2.2 细胞转染与分组：成纤维细胞接种于实验所需相应培养皿中，培养24h后贴壁，在0℃中使用转染缓冲液与转染试剂混合，稀释其至50nm，冰上放置10min。去除细胞上清液，加入混合转染液后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养48h。使用聚合链式酶反应检测转染效果，转染成功后进行下一步检测。将转染miRNA-769-5p mimics的成纤维细胞称为转染组，未进行转染的正常人成纤维细胞称为对照组。
1.2.3 细胞增值率测定：将细胞以每2 000/100μl密度均匀种植在96孔板中，去除细胞上清后，每孔避光加入10μl CCK-8溶液及100μl培养液，在37℃、5% CO2的细胞培养箱中避光孵育2h，使用酶标仪测定在450nm处的吸光度值。
1.2.4 氧化损伤检测：将细胞以每2 000/100μl的密度均匀种植在6孔板中，按照1：1 000用无血清培养液稀释DCFH-DA使终浓度为10μmol/L，去除细胞培养液，每孔加入稀释好的DCFH-DA 1ml，37℃细胞培养箱内孵育20min，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次后在镜下观察荧光强度。加入胰酶后，消化下的细胞在流式细胞仪下检测荧光值。
1.2.5 细胞凋亡测定：将细胞以每2 000/100μl的密度均匀种植在6孔板中，去除细胞上清，PBS洗涤后，使用胰酶消化贴壁细胞，将细胞悬液放入离心机中1 000g离心5min，弃上清，收集细胞，PBS重悬后，转移至离心管1 000g离心5min弃上清，使用AnnexinV-FIFC重悬细胞，加入5?l AnnexinV-FIFC及10?l碘化丙啶染色液混匀，室温避光孵育10～20min后，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.6 统计学分析：使用SPSS 17.0軟件进行版本，检测数据均以（x?±s）表示，采用t检验，P<0.05被认为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 miRNA-769-5p mimics转染上调miRNA-769-5p的表达：转染组miRNA-769-5p相对表达量为（1.36±0.2）显著高于对照组的（1.0±0.1），差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。
2.2 上调miRNA-769-5p对细胞增殖率的影响：使用CCK-8试剂盒在酶标仪下测细胞增殖率，转染组细胞增值率为（0.747±0.072）明显低于对照组的（1.007±0.025），差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。
2.3 上调miRNA-769-5p对细胞氧化损伤的影响：使用活性氧检测试剂盒观察、测定细胞氧化损伤情况，激光共聚焦显微镜下，转染组大部分细胞出现荧光染色阳性，对照组在荧光显微镜下无明显荧光。经流式细胞仪检测，转染组细胞荧光值（92.067±3.092）明显高于对照组的（21.600±8.487），差异有统计学意义（P<0.05）。见图3～4。
2.4 上调miRNA-769-5p对细胞凋亡率的影响：转染组细胞凋亡率为（49.299±5.184）%明显高于对照组的（5.977±0.939）%，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5。
3 讨论
紫外线照射可以造成被辐射细胞发生不同程度的光损伤[2]，在成纤维细胞中，细胞发生的变化包括基因表达的改变、细胞增殖异常、氧化损伤、凋亡等[3]。研究发现，旁观者效应可以发生在电离或者非电离辐射中，除了直接辐射的部分，同一个体临近的未被辐射的部分也会发生类似辐射后的反应。体外细胞实验发现，通过将辐射后细胞培养上清液转移至正常未辐射细胞，类似的损伤现象同样可以发生在未经紫外线辐射的细胞中[4]。
miRNAs是一组调控蛋白质基因表达的非编码RNA，它可以通过结合到mRNAs而进行负向调控。通过这种途径，miRNAs在许多生物进程中起到了至关重要的作用[5]。细胞内的miRNAs被囊泡包裹后可以释放到细胞外环境，免于被各种酶消化而稳定存在，这种包裹在囊泡中的miRNAs被称为分泌型miRNAs[6]。目前有些研究认为在光损伤中，分泌型miRNAs可能通过被释放至细胞外环境从而在被辐射细胞与旁观者细胞之间的信号通路中起到调控作用[7]，临床研究也证明在多种疾病中，内含miRNAs的外泌体的含量可发生一定的改变[8]。
mimics是一种运用化学方法合成的生物体内源性miRNA模拟体，能够起到增强内源性miRNA功能的作用。本次选择使用miRNA mimics转染引起内源性成熟miRNA的高表达，以增强内源性miRNA的调控作用。CCK-8目前已被广泛用于细胞增殖试验中。活性氧簇为需氧细胞在代谢过程中产生，但中、高浓度ROS通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死。 前期实验中发现，显微镜下观察直接由受辐射细胞上清液共同孵育的旁观者细胞出现了明显的形态改变，如过度伸展、排列疏松、出现细胞碎片等。还会出现细胞增殖率降低、氧化损伤及凋亡率升高等，这些都是细胞出现光损伤的实验室表现。本次实验中选择使用miRNA mimics对miRNA-769-5p进行表达上调，研究其对正常人成纤维细胞生物活性的影响。将正常人成纤维细胞转染miRNA-769-5pmimics，导致miRNA-769-5p表达上调后，可出现细胞增殖率下降、氧化损伤增加以及凋亡率增加等现象。这些结果均表明miRNA-769-5p可以诱导出类似紫外线光损伤效应，这可能是急性中长波紫外线辐射后光损伤机制之一。
有研究表明，miRNA-769-5p在细胞增殖、分化、凋亡的生物进程中发挥着一定作用[9]，如部分肺腺癌患者体内的miRNA-769-5p可发生显著失调，炎症性肠病的患者血液中的miRNA-769-5p也会发生变化[10]，Sebastien发现miRNA-769-5p在神经退行性疾病中出现了阳性信号。除此之外，miRNA-769-5p也可以通过调控下游的因子，如ARID1A以及GSK3B来调控细胞增殖[11-12]。
本次研究着重探讨了miRNA-769-5p对成纤维细胞生物学活性的影响，通过增加外源性miRNA-769-5p的表达，产生了类似光损伤后的生物学指标变化。但本文并未详细阐述miRNA-769-5p在旁观者效应中的具体作用，这有待于后续进一步探讨。除了miRNA-769-5p外，也有其他miRNAs在紫外线光损伤进程中发挥着调控作用。随着研究的深入，希望能发现更多与紫外线光损伤有关的miRNAs及其相关作用机制，为今后光老化的预防与治疗提供新的思路与线索。
[参考文献]
[1]Whiteside JR，McMillan TJ.A bystander effect is induced in human cells treated with UVA radiation but not UVB radiation[J].Radiat Res，2009，171（2）：204-211.
[2]Kammeyer A，Luiten RM.Oxidation events and skin aging[J].Ageing Res Rev，2015， 21：16-29.
[3]Ohba T，Ishisaka M，Tsujii S，et al.Crocetin protects ultraviolet A-induced oxidative stress and cell death in skin in vitro and in vivo[J].Eur J Pharmacol，2016，789：244-253.
[4]Le M，McNeill FE，Seymour C，et al.An Observed Effect of Ultraviolet Radiation Emitted from Beta-Irradiated HaCaT Cells upon Non-Beta-Irradiated Bystander Cells[J].Radiat Res，2015，183（3）：279-290.
[5]Xu S，Wang J，Ding N，et al.Exosome-mediated microRNA transfer plays a role in radiation-induced bystander effect[J].RNA Biol，2015，12（12）：1355-1363.
[6]劉娟，周炳荣，王申，等.中长波紫外线辐射诱导皮肤成纤维细胞上清液中微囊泡功能的检测[J].中国皮肤性病学杂志，2016，30（1）：1-5.
[7]Penfornis P，Vallabhaneni KC，Whitt J，et al.Extracellular vesicles as carriers of microRNA， proteins and lipids in tumor microenvironment[J].Int J Cancer，2016，138（1）：14-21.
[8]Bastos N，Melo SA.Quantitative Analysis of Precursors MicroRNAs and Their Respective Mature MicroRNAs in Cancer Exosomes Overtime[J].Methods Mol Biol，2018，1733：137-143.
[9]Gasparini P，Cascione L，Landi L，et al.microRNA classifiers are powerful diagnostic/prognostic tools in ALK-， EGFR-， and KRAS-driven lung cancers[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2015，112（48）：14924-14929.
[10]Fisher K，Lin J.MicroRNA in inflammatory bowel disease： Translational
research and clinical implication[J].World J Gastroenterol，
2015，21（43）：12274-12282.
[11]Heckl M，Schmoeckel E，Hertlein L，et al.The ARID1A， p53 and ?-Catenin statuses are strong prognosticators in clear cell and endometrioid carcinoma of the ovary and the endometrium[J].PLoS One，2018，13（2）：e0192881.
[12]Qiu HJ，Lu XH，Yang SS，et al.MiR-769 promoted cell proliferation in human melanoma by suppressing GSK3B expression[J].Biomed Pharmacother，2016，82：117-123.
[关键词]miRNA；成纤维细胞；紫外线；光损伤
[中图分类号]R329.2+8 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）04-0109-03
Effect of miRNA-769-5p on Biological Activity of Normal Human Fibroblasts
NI Na，ZHOU Bing-rong，MA Wei-wei，LUO Dan
（Department of Dermatology，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，Jiangsu，China）
Abstract： Objective To investigate the effect of miRNA-769-5p on biological activity in normal human fibroblasts. Methods Human fibroblasts were transfected with miRNA-769-5p mimic. CCK-8 kit was performed to test proliferation rate. Cell were observed under fluorescence microscope. Flow cytometer was used to measured rate of reactive oxygen species and apoptosis. All the parameters of the mimics group were compared with the control group. Results The relative expression of miRNA-769-5p in the mimics group was （1.36±0.2）， which was significantly higher than that of the control group （1.0±0.1）， the difference was statistically significant（P<0.05）. The cell proliferation rate in the mimics group （0.747±0.072） was significantly lower than that of the control group （1.007±0.025）（P<0.05）. The fluorescence value of the mimics group （92.067±3.092） was significantly higher than that of the control group （21.600±8.487）（P<0.05）. The apoptotic rate in the mimics group was （49.299 ± 5.184）%， which was significantly higher than that of the control group （5.977±0.939）%（P<0.05）. Conclusion Up-regulation of miRNA-769-5p induce photo-damage and have effect on biological activity in normal human fibroblasts.
Key words： miRNA； fibroblasts； ultraviolet； photodamage
紫外线是自然界广泛传播的一种辐射来源，研究者将其定义为一种波长为180～400nm的非电离辐射。根据波长，可将紫外线分为短波紫外线UVC（200～280nm）、中波紫外线UVB（280～320nm）和长波紫外线UVA（320～400nm）。其中短波紫外线穿透能力最弱，日光中含有的短波紫外线几乎完全被臭氧层吸收。紫外线辐射可造成被辐射细胞出现光损伤，表现为多种生物学指标异常。研究发现，除了直接受辐射的细胞，未被辐射的临近细胞甚至远隔细胞也可能出现类似的光损伤现象，这种现象被称之为“旁观者效应”[1]。在前期实验中，通过对光损伤后差异性表达的miRNA进行基因芯片筛选，发现miRNA-769-5p在光损伤中可能起到一定作用。过去的研究显示，miRNA-769-5p可以调控部分生物进程。在本次研究中，通过对正常人成纤维细胞转染外源性miRNA-769-5p，观察其对正常成纤维细胞生物活性产生的影响。 1 材料和方法
1.1 材料：成纤维细胞取自于健康成年男性包皮组织。DMEM培养液购于美国Hyclone公司，小牛血清购于杭州四季青公司，Trizol核算提取液购于美国Invitrogen公司，CCK-8试剂盒购于日本Dojindo公司，DCFH氧化损伤试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，miRNA转染试剂盒购于广州锐博生物科技有限公司，UVA、UVB照射仪购于上海希格玛高技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞的分离与培养：获得包皮后，用含青-链霉素的PBS反复冲洗3次至无肉眼可见血迹，剪去包皮皮下组织，将其剪成约0.5cm×0.5cm大小皮片，PBS冲洗3次后弃PBS，加入分散酶，放入4℃冰箱中消化18～20h后将表皮和真皮分离。取真皮部分，加入胶原酶消化液，放入37℃细胞培养箱中消化2h，取出后加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，吹打过滤后离心，之后弃细胞上清液，加入含10%胎牛血清及1%青-链霉素的DMEM培养基，转移至培养皿中，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
1.2.2 细胞转染与分组：成纤维细胞接种于实验所需相应培养皿中，培养24h后贴壁，在0℃中使用转染缓冲液与转染试剂混合，稀释其至50nm，冰上放置10min。去除细胞上清液，加入混合转染液后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养48h。使用聚合链式酶反应检测转染效果，转染成功后进行下一步检测。将转染miRNA-769-5p mimics的成纤维细胞称为转染组，未进行转染的正常人成纤维细胞称为对照组。
1.2.3 细胞增值率测定：将细胞以每2 000/100μl密度均匀种植在96孔板中，去除细胞上清后，每孔避光加入10μl CCK-8溶液及100μl培养液，在37℃、5% CO2的细胞培养箱中避光孵育2h，使用酶标仪测定在450nm处的吸光度值。
1.2.4 氧化损伤检测：将细胞以每2 000/100μl的密度均匀种植在6孔板中，按照1：1 000用无血清培养液稀释DCFH-DA使终浓度为10μmol/L，去除细胞培养液，每孔加入稀释好的DCFH-DA 1ml，37℃细胞培养箱内孵育20min，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次后在镜下观察荧光强度。加入胰酶后，消化下的细胞在流式细胞仪下检测荧光值。
1.2.5 细胞凋亡测定：将细胞以每2 000/100μl的密度均匀种植在6孔板中，去除细胞上清，PBS洗涤后，使用胰酶消化贴壁细胞，将细胞悬液放入离心机中1 000g离心5min，弃上清，收集细胞，PBS重悬后，转移至离心管1 000g离心5min弃上清，使用AnnexinV-FIFC重悬细胞，加入5?l AnnexinV-FIFC及10?l碘化丙啶染色液混匀，室温避光孵育10～20min后，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.6 统计学分析：使用SPSS 17.0軟件进行版本，检测数据均以（x?±s）表示，采用t检验，P<0.05被认为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 miRNA-769-5p mimics转染上调miRNA-769-5p的表达：转染组miRNA-769-5p相对表达量为（1.36±0.2）显著高于对照组的（1.0±0.1），差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。
2.2 上调miRNA-769-5p对细胞增殖率的影响：使用CCK-8试剂盒在酶标仪下测细胞增殖率，转染组细胞增值率为（0.747±0.072）明显低于对照组的（1.007±0.025），差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。
2.3 上调miRNA-769-5p对细胞氧化损伤的影响：使用活性氧检测试剂盒观察、测定细胞氧化损伤情况，激光共聚焦显微镜下，转染组大部分细胞出现荧光染色阳性，对照组在荧光显微镜下无明显荧光。经流式细胞仪检测，转染组细胞荧光值（92.067±3.092）明显高于对照组的（21.600±8.487），差异有统计学意义（P<0.05）。见图3～4。
2.4 上调miRNA-769-5p对细胞凋亡率的影响：转染组细胞凋亡率为（49.299±5.184）%明显高于对照组的（5.977±0.939）%，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5。
3 讨论
紫外线照射可以造成被辐射细胞发生不同程度的光损伤[2]，在成纤维细胞中，细胞发生的变化包括基因表达的改变、细胞增殖异常、氧化损伤、凋亡等[3]。研究发现，旁观者效应可以发生在电离或者非电离辐射中，除了直接辐射的部分，同一个体临近的未被辐射的部分也会发生类似辐射后的反应。体外细胞实验发现，通过将辐射后细胞培养上清液转移至正常未辐射细胞，类似的损伤现象同样可以发生在未经紫外线辐射的细胞中[4]。
miRNAs是一组调控蛋白质基因表达的非编码RNA，它可以通过结合到mRNAs而进行负向调控。通过这种途径，miRNAs在许多生物进程中起到了至关重要的作用[5]。细胞内的miRNAs被囊泡包裹后可以释放到细胞外环境，免于被各种酶消化而稳定存在，这种包裹在囊泡中的miRNAs被称为分泌型miRNAs[6]。目前有些研究认为在光损伤中，分泌型miRNAs可能通过被释放至细胞外环境从而在被辐射细胞与旁观者细胞之间的信号通路中起到调控作用[7]，临床研究也证明在多种疾病中，内含miRNAs的外泌体的含量可发生一定的改变[8]。
mimics是一种运用化学方法合成的生物体内源性miRNA模拟体，能够起到增强内源性miRNA功能的作用。本次选择使用miRNA mimics转染引起内源性成熟miRNA的高表达，以增强内源性miRNA的调控作用。CCK-8目前已被广泛用于细胞增殖试验中。活性氧簇为需氧细胞在代谢过程中产生，但中、高浓度ROS通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死。 前期实验中发现，显微镜下观察直接由受辐射细胞上清液共同孵育的旁观者细胞出现了明显的形态改变，如过度伸展、排列疏松、出现细胞碎片等。还会出现细胞增殖率降低、氧化损伤及凋亡率升高等，这些都是细胞出现光损伤的实验室表现。本次实验中选择使用miRNA mimics对miRNA-769-5p进行表达上调，研究其对正常人成纤维细胞生物活性的影响。将正常人成纤维细胞转染miRNA-769-5pmimics，导致miRNA-769-5p表达上调后，可出现细胞增殖率下降、氧化损伤增加以及凋亡率增加等现象。这些结果均表明miRNA-769-5p可以诱导出类似紫外线光损伤效应，这可能是急性中长波紫外线辐射后光损伤机制之一。
有研究表明，miRNA-769-5p在细胞增殖、分化、凋亡的生物进程中发挥着一定作用[9]，如部分肺腺癌患者体内的miRNA-769-5p可发生显著失调，炎症性肠病的患者血液中的miRNA-769-5p也会发生变化[10]，Sebastien发现miRNA-769-5p在神经退行性疾病中出现了阳性信号。除此之外，miRNA-769-5p也可以通过调控下游的因子，如ARID1A以及GSK3B来调控细胞增殖[11-12]。
本次研究着重探讨了miRNA-769-5p对成纤维细胞生物学活性的影响，通过增加外源性miRNA-769-5p的表达，产生了类似光损伤后的生物学指标变化。但本文并未详细阐述miRNA-769-5p在旁观者效应中的具体作用，这有待于后续进一步探讨。除了miRNA-769-5p外，也有其他miRNAs在紫外线光损伤进程中发挥着调控作用。随着研究的深入，希望能发现更多与紫外线光损伤有关的miRNAs及其相关作用机制，为今后光老化的预防与治疗提供新的思路与线索。
[参考文献]
[1]Whiteside JR，McMillan TJ.A bystander effect is induced in human cells treated with UVA radiation but not UVB radiation[J].Radiat Res，2009，171（2）：204-211.
[2]Kammeyer A，Luiten RM.Oxidation events and skin aging[J].Ageing Res Rev，2015， 21：16-29.
[3]Ohba T，Ishisaka M，Tsujii S，et al.Crocetin protects ultraviolet A-induced oxidative stress and cell death in skin in vitro and in vivo[J].Eur J Pharmacol，2016，789：244-253.
[4]Le M，McNeill FE，Seymour C，et al.An Observed Effect of Ultraviolet Radiation Emitted from Beta-Irradiated HaCaT Cells upon Non-Beta-Irradiated Bystander Cells[J].Radiat Res，2015，183（3）：279-290.
[5]Xu S，Wang J，Ding N，et al.Exosome-mediated microRNA transfer plays a role in radiation-induced bystander effect[J].RNA Biol，2015，12（12）：1355-1363.
[6]劉娟，周炳荣，王申，等.中长波紫外线辐射诱导皮肤成纤维细胞上清液中微囊泡功能的检测[J].中国皮肤性病学杂志，2016，30（1）：1-5.
[7]Penfornis P，Vallabhaneni KC，Whitt J，et al.Extracellular vesicles as carriers of microRNA， proteins and lipids in tumor microenvironment[J].Int J Cancer，2016，138（1）：14-21.
[8]Bastos N，Melo SA.Quantitative Analysis of Precursors MicroRNAs and Their Respective Mature MicroRNAs in Cancer Exosomes Overtime[J].Methods Mol Biol，2018，1733：137-143.
[9]Gasparini P，Cascione L，Landi L，et al.microRNA classifiers are powerful diagnostic/prognostic tools in ALK-， EGFR-， and KRAS-driven lung cancers[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2015，112（48）：14924-14929.
[10]Fisher K，Lin J.MicroRNA in inflammatory bowel disease： Translational
research and clinical implication[J].World J Gastroenterol，
2015，21（43）：12274-12282.
[11]Heckl M，Schmoeckel E，Hertlein L，et al.The ARID1A， p53 and ?-Catenin statuses are strong prognosticators in clear cell and endometrioid carcinoma of the ovary and the endometrium[J].PLoS One，2018，13（2）：e0192881.
[12]Qiu HJ，Lu XH，Yang SS，et al.MiR-769 promoted cell proliferation in human melanoma by suppressing GSK3B expression[J].Biomed Pharmacother，2016，82：117-123.