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摘 要 对海南粗榧（Cephalotaxus hainanensis Li.）内生真菌F127发酵液化学组分进行研究。用多种色谱技术对F127代谢产物进行分离纯化，以LC-MS、ESI-MS和超导核磁共振分析鉴定化合物结构，最后采用MTT法测定化合物的抗肿瘤活性。从海南粗榧内生真菌F127的发酵液中分离得到5个单体化合物，分别鉴定为oblongolide T（1）、sorbicillin（2）、邻苯二甲酸二丁酯（3）、phomopsolide B（4）、6，8-二羟基-3-甲基-3，4-二氢异香豆素（5），且化合物1、4、5对肿瘤细胞K562、NB4、HL-60、HepG-2和Lovo表现出不同抑制活性。化合物4对5株肿瘤细胞均表现出抑制活性，对K562、NB4、HL-60抑制效果显著，IC50值分别为3.35、0.014和0.16 μg/mL，对HepG-2和LoVo只有温和抑制作用；化合物1对K562、NB4、HL-60抑制作用良好，IC50值分别为51.82、54.25和29.31 μg/mL；化合物5对NB4和HepG-2则具有一定抑制活性；化合物2和3对测试细胞株未表现出抑制活性。5个化合物均是首次从海南粗榧内生真菌中分离得到，并首次报道了化合物1、4对K562、NB4、HL-60的优良细胞毒活性，为进一步研究海南粗榧内生真菌中的活性天然产物奠定了基础。
关键词 海南粗榧；内生真菌；天然产物；抗肿瘤活性；phomopsolide；oblongolide
中图分类号 R284 文献标识码 A
Abstract To study the chemical constituents of the endophyte F127 of Cephalotaxus hainanensis Li.， the constituents were isolated and purified by multi-chromatography， and their structure were elucidated by spectroscopic analyses including LC-MS， ESI-MS， 1H NMR and 13C NMR. Meanwhile， the cyctotoxic activities were evaluated by MTT assay. Five known metabolites including oblongolide T（1）， sorbicillin（2）， dibutylphthalate（3）， phomopsolide B（4） and one 3，4-dihydroisocoumarin（5） were isolated from the broth of the endophyte F127. And compound 1，4，5 exhibited different cyototoxic activities against K562， NB4， HL-60， HepG-2 and LoVo. Compound 4 showed cytotoxic activities against 5 tumor cell lines in vitro， which significantly inhibiting K562， NB4， HL-60 cells with IC50 of 3.35， 0.014 and 0.16 μg/mL， and moderately inhibiting HepG-2 and LoVo. Compound 1 exhibited good cytotoxic activites aginst K562， NB4， HL-60 cells as well， with IC50 of 51.82， 54.25 and 29.31 μg/mL. Moderate cytotoxic activites aginst NB4 and HepG-2 were alsso observed for compound 5. The rest of the founds showed no substantial effect against the tumor cells. The five compounds were all the first time isolated from the endophytes from C. hainanensis Li.. And the significant cytotoxic activtities against to K562， NB4， HL-60 of compound 1 and 4 was reported for the first time， which laid the foundation of studying the bioactive natural products from endophytes from C. hainanensis Li..
Key words Cephalotaxus hainanensis； endophyte； natural products； antitumor activity； phomopsolide； oblongolide
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.05.029
海南粗榧（Cephalotaxus hainanensis Li.），別名红壳松、薄叶篦子杉，因其含有抗白血病活性的三尖杉酯碱（Harringtonine，HT）和高三尖杉酯碱（Homoharringtonine，HHT）而备受关注[1]。植物内生真菌（endophyte）作为生活史一定阶段或全部阶段生活于健康植物内部组织中，且不对宿主植物本身造成任一明显病害的真菌[2]。其代谢产物不仅种类丰富，活性多样，一些内生真菌还能产与宿主植物相同或相似次级代谢产物，内生真菌的生态特性使其还具有产新颖结构活性物质的潜力[3]。这些天然产物突破了植物资源稀缺、再生周期长等限制，使得内生真菌逐渐成为重要的新兴药用资源库[4]。越来越多重要活性和（或）新型结构天然产物如紫杉醇[5]、脱氧鬼臼毒素[6]、喜树碱[7]、新色原烯[8]、新吡咯辛[9]相继从内生真菌被挖掘开发。海南粗榧内生真菌研究尚处于初步阶段，目前已从其分离获得了环二肽、棕榈酸、乙酰基细胞松弛素D1和D2等单体化合物，并见有对抑制胃癌细胞株SGC-7901的报道[10-11]。但海南粗榧内生真菌代谢产物对白血病等细胞株的抑制作用，还鲜有文章报道。 菌株F127是课题组从海南粗榧植株分离得到的一株强活性菌株，经摇瓶预发酵，发现其粗提物对白血病细胞具有强细胞毒活性。故此，笔者用发酵罐对其进行扩大培养，选择白血病细胞株为主要体外细胞毒活筛选细胞株，研究海南粗榧内生真菌F127次级代谢产物及其生物活性。以期从海南粗榧内生真菌中发掘抗肿瘤先导化合物，保护海南粗榧过度开采，并为从药用植物开发药用资源奠定研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与肿瘤细胞株
（1）内生菌菌株。内生真菌F127，由本实验室分离自霸王岭自然保护区海南粗榧茎干韧皮部，菌落呈棕黑色，种属暂未定。
（2）肿瘤细胞系。K562（人慢性髓原白血病细胞），NB4（急性早幼粒白血病细胞），购于中国典型培养物保藏中心；HL-60（人急性髓原白血病细胞），HepG-2（人肝癌细胞），LoVo（人结肠癌细胞）购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库。
1.1.2 试剂与仪器
（1）试剂。柱色谱200-300目硅胶和薄层色谱硅胶GF254，购自青岛市基亿达硅胶试剂厂。RPMI1640培养基购自北京索来宝；IMDM培养基购自Gibco；DMEM高糖培养基购自武汉博士德；F12K培养基购自Sigma；胎牛血清购自Hyclone，以上试剂均为细胞实验级。HHT、阿霉素标品购自中国药品生物制品检定所。
（2）仪器。100 L半自动发酵罐110380型，上海百仑有限公司；立式旋转蒸发仪RE-5203AA型，上海亚荣仪器设备有限公司；CO2培养箱MCO-175型，SANYO；全自动酶标仪Synergy HT型，Bio-Tek；倒置显微镜CKX41SF型，OLYMPUS；全自动细胞计数器TC10型，Bio-Rad；高速冷冻离心机Hettich32R型，德国ZENTRIFΜGEN；液质联用Waters XEV0 TQ-S型，美国生物应用公司；超导核磁共振仪Bruker AV400 MHz型，瑞士Bruker公司。
（3）培养基。发酵培养基PDB：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1 L，pH自然，121 ℃，灭菌20 min；种子培养基同PDB；活化培养基：琼脂20 g，其余同PDB。
1.2 方法
1.2.1 大罐发酵培养 将F127菌株在PDA平板上活化后，取5 mm菌饼转接到PDB培养基中，26 ℃，转速115 r/min，恒温摇床震荡培养5 d获得种子液，再以8%的接种量接种至含60 L发酵培养基的发酵罐中，26 ℃，转速为115 r/min，通气量为2 m3/h，pH自然，大罐发酵培养11 d。
1.2.2 代谢产物提取与分离 将全部发酵培养物于45 ℃减压浓缩至5 L，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得粗提物浸膏。采用硅胶柱层析法，以石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇（V∶V∶V）对粗提物进行梯度洗脱，结合薄层色谱分析，反复洗脱极性相似组分，直至获得单体化合物。
1.2.3 化合物结构鉴定 将分离得到的单体化合物测定LC-MS和ES-MS，并进行核磁共振（NMR）分析，根据波谱数据解析其化学结构。
1.2.4 化合物抗肿瘤活性测定 采用MTT法[12]测定化合物的抗肿瘤活性，以1% DMSO为空白对照，以HHT、阿霉素为阳性对照，570 nm波长下测定每孔的吸光值，按下式计算抑制率。
抑制率（IR）=（1-待测样品OD570值/空白对照OD570值）×100%。
所有待测样品每个浓度设置5个复孔，结果取其平均值。用SPSS软件分析，测得化合物IC50值[13]。
2 结果与分析
2.1 代谢产物提取与分离
经浓缩过后的培养物用乙酸乙酯多次提取，减压悬蒸获得粗提物浸膏15.6 g。对粗提物浸膏以石油醚-乙酸乙酯（V∶V，50∶1、30∶1、10∶1、1∶1、1∶10、1∶30、1∶50）等梯度洗脱得到9个流分（Fr.1～Fr.9）。在薄层色谱的分析下进一步對流分梯度洗脱，Fr.2经石油醚-乙酸乙酯（5∶1）洗脱得到化合物1（11 mg）；Fr.3经石油醚-乙酸乙酯（1∶1）洗脱得到化合物2（8 mg）；Fr.4经乙酸乙酯-甲醇（8∶1）和乙酸乙酯-甲醇（4∶1）洗脱分别得到化合物3（5 mg）和4（20 mg）；Fr.7经乙酸乙酯-甲醇（4∶1）洗脱得到化合物5（6 mg）。
2.2 化合物结构鉴定
化合物1：白色粉末，易溶于氯仿甲醇，分子式为C16H24O3，ESI-MS： m/z=265.17[M+H]+，波谱数据1H NMR和13C NMR见表1，与文献[14]数据对照可以鉴定化合物1为oblongolide T。
化合物2：黄色粉末，易溶于氯仿甲醇，分子式为C14H16O3，ESI-MS： m/z=233.58[M+H]+，波谱数据1H NMR和13C NMR见表2，与文献[15]数据对照可鉴定化合物2为sorbicillin。
化合物3：无色油状物，易溶于氯仿甲醇，分子式为C16H22O4，ESI-MS： m/z=279.14[M+H]+，波谱数据1H NMR和13C NMR见表3，与文献[16]数据对照可鉴定化合物3为邻苯二甲酸二丁酯（Dibutylphthalate）。
化合物4：无色油状物，易溶于氯仿甲醇，分子式为C15H20O6，ESI-MS： m/z=296.89[M+H]+，波谱数据1H NMR和13C NMR见表4，与文献[17]数据对照可鉴定化合物4为phomopsolide B。
化合物5：白色针晶，易溶于氯仿甲醇，分子式为C10H10O4，ESI-MS： m/z=195.04[M+H]+，波谱数据1H NMR和13C NMR见表5，与文献[18，19]数据对照可鉴定化合物为6，8-二羟基-3-甲基-3，4-二氢异香豆素。 以上5種化合物的化学结构式如图1所示。
2.3 抗肿瘤活性测试
以MTT法对5个化合物进行抗肿瘤活性测试，结果IC50（μg/mL）如表6所示。化合物4对5株测试肿瘤细胞均表现出抑制作用，对K562、NB4、HL-60具有强细胞毒活性，IC50值均小于10 μg/mL；化合物1对3株白血病细胞均具有良好细胞毒活性，对HL-60细胞具有较强细胞毒活性，IC50值达到29.31 μg/mL；化合物5则对NB4、HepG-2表现出温和细胞毒活性；化合物2和3对这5株肿瘤细胞则未展现出细胞毒活性。
3 讨论
本研究成功从F127发酵液中分离得到5个单体化合物，以波谱技术对其进行结构解析，依次鉴定为：oblongolide T（1）、sorbicillin（2）、邻苯二甲酸二丁酯（3）、phomopsolide B（4）、6，8-二羟基-3-甲基-3，4-二氢异香豆素（5）。进一步肿瘤细胞毒活性测定，发现phomopsolide B对5株肿瘤细胞均表现出抑制活性，对K562、NB4、HL-60抑制效果显著，IC50值分别为3.35、0.014和0.16 μg/mL，对HepG-2和LoVo抑制温和，IC50值分别为92.94和87.34 μg/mL；oblongolide T对K562、NB4、HL-60均具有较好抑制活性，IC50值分别为51.82、54.25和29.31 μg/mL；6，8-二羟基-3-甲基-3，4-二氢异香豆素对NB4和HepG-2具有温和抑制活性，IC50值为87.08和96.57 μg/mL；Sorbicillin和邻苯二甲酸二丁酯对这5株测试肿瘤细胞则未表现出抑制活性。故此，首次从海南粗榧内生真菌获得的化合物1和化合物4 具有较强白血病毒活性，进一步研究，有望成为抗白血病药物的先导化合物。
Oblongolide为六缩酮γ-内酯（hexaketide γ-lactone），从榆树（elm tree）树皮韧皮部的Phomopsis oblonga次级代谢物中首次分离得到。Oblongolide T属于洛伐他汀类似物，由Lin等[14]首次从Phomopsis sp. XZ-26中分离得到，该文首次发现此物质对K562、NB4、HL-60具有良好抑制活性。Phomopsolide B从多种植物包括榆柳、喜树、白栎树、法国梧桐、木兰的Phomopsis sp.都曾分离得到过[20]，推测该次生代谢物的生物合成与Phomopsis sp.宿主植物不相关；此外，除本研究报道了该物质对K562、NB4、HL-60的强细胞毒活性外，Lin等[21]还发现该物质对HeLa细胞也具有强细胞毒活性（IC50=5.7 μg/mL）。化合物5属于二氢异香豆素类物质，这是一类植物体内比较常见天然物质，具有抗菌、抗虫、抗炎等多重活性[22]。Sorbicillin和邻苯二甲酸二丁酯虽然在本研究的抗肿瘤活性筛选中未表现出活性。但Bringmann等[23]从Penicillium chrysogenum代谢产物分离得的Sorbicillin类似物具有抗HIV活性且对 L5178y表现出强抑制作用。赵瑞等[24]从海洋青霉属分离得邻苯二甲酸二丁酯具有较强抗MRSA活性；曲新颜等[16]还报道了邻苯二甲酸二丁酯对小鼠乳腺癌温敏型tsFT210细胞具有G0/G1期细胞周期抑制作用。综上，本研究所分离化合物表现出较好且多样的生物活性，对相关药物的研发具有一定参考价值。
通过对海南粗榧内生真菌F127代谢产物的分离纯化、结构鉴定和活性测试，发现海南粗榧内生真菌F127能产多种抗肿瘤活性物质。目前正进一步研究该高活性菌株，采用不同发酵方式对其发酵，以期获得更多活性优良、结构新颖的化合物，为最终实现从药用植物内生真菌开发新颖药效成分提供科学依据。
参考文献
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关键词 海南粗榧；内生真菌；天然产物；抗肿瘤活性；phomopsolide；oblongolide
中图分类号 R284 文献标识码 A
Abstract To study the chemical constituents of the endophyte F127 of Cephalotaxus hainanensis Li.， the constituents were isolated and purified by multi-chromatography， and their structure were elucidated by spectroscopic analyses including LC-MS， ESI-MS， 1H NMR and 13C NMR. Meanwhile， the cyctotoxic activities were evaluated by MTT assay. Five known metabolites including oblongolide T（1）， sorbicillin（2）， dibutylphthalate（3）， phomopsolide B（4） and one 3，4-dihydroisocoumarin（5） were isolated from the broth of the endophyte F127. And compound 1，4，5 exhibited different cyototoxic activities against K562， NB4， HL-60， HepG-2 and LoVo. Compound 4 showed cytotoxic activities against 5 tumor cell lines in vitro， which significantly inhibiting K562， NB4， HL-60 cells with IC50 of 3.35， 0.014 and 0.16 μg/mL， and moderately inhibiting HepG-2 and LoVo. Compound 1 exhibited good cytotoxic activites aginst K562， NB4， HL-60 cells as well， with IC50 of 51.82， 54.25 and 29.31 μg/mL. Moderate cytotoxic activites aginst NB4 and HepG-2 were alsso observed for compound 5. The rest of the founds showed no substantial effect against the tumor cells. The five compounds were all the first time isolated from the endophytes from C. hainanensis Li.. And the significant cytotoxic activtities against to K562， NB4， HL-60 of compound 1 and 4 was reported for the first time， which laid the foundation of studying the bioactive natural products from endophytes from C. hainanensis Li..
Key words Cephalotaxus hainanensis； endophyte； natural products； antitumor activity； phomopsolide； oblongolide
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.05.029
海南粗榧（Cephalotaxus hainanensis Li.），別名红壳松、薄叶篦子杉，因其含有抗白血病活性的三尖杉酯碱（Harringtonine，HT）和高三尖杉酯碱（Homoharringtonine，HHT）而备受关注[1]。植物内生真菌（endophyte）作为生活史一定阶段或全部阶段生活于健康植物内部组织中，且不对宿主植物本身造成任一明显病害的真菌[2]。其代谢产物不仅种类丰富，活性多样，一些内生真菌还能产与宿主植物相同或相似次级代谢产物，内生真菌的生态特性使其还具有产新颖结构活性物质的潜力[3]。这些天然产物突破了植物资源稀缺、再生周期长等限制，使得内生真菌逐渐成为重要的新兴药用资源库[4]。越来越多重要活性和（或）新型结构天然产物如紫杉醇[5]、脱氧鬼臼毒素[6]、喜树碱[7]、新色原烯[8]、新吡咯辛[9]相继从内生真菌被挖掘开发。海南粗榧内生真菌研究尚处于初步阶段，目前已从其分离获得了环二肽、棕榈酸、乙酰基细胞松弛素D1和D2等单体化合物，并见有对抑制胃癌细胞株SGC-7901的报道[10-11]。但海南粗榧内生真菌代谢产物对白血病等细胞株的抑制作用，还鲜有文章报道。 菌株F127是课题组从海南粗榧植株分离得到的一株强活性菌株，经摇瓶预发酵，发现其粗提物对白血病细胞具有强细胞毒活性。故此，笔者用发酵罐对其进行扩大培养，选择白血病细胞株为主要体外细胞毒活筛选细胞株，研究海南粗榧内生真菌F127次级代谢产物及其生物活性。以期从海南粗榧内生真菌中发掘抗肿瘤先导化合物，保护海南粗榧过度开采，并为从药用植物开发药用资源奠定研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与肿瘤细胞株
（1）内生菌菌株。内生真菌F127，由本实验室分离自霸王岭自然保护区海南粗榧茎干韧皮部，菌落呈棕黑色，种属暂未定。
（2）肿瘤细胞系。K562（人慢性髓原白血病细胞），NB4（急性早幼粒白血病细胞），购于中国典型培养物保藏中心；HL-60（人急性髓原白血病细胞），HepG-2（人肝癌细胞），LoVo（人结肠癌细胞）购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库。
1.1.2 试剂与仪器
（1）试剂。柱色谱200-300目硅胶和薄层色谱硅胶GF254，购自青岛市基亿达硅胶试剂厂。RPMI1640培养基购自北京索来宝；IMDM培养基购自Gibco；DMEM高糖培养基购自武汉博士德；F12K培养基购自Sigma；胎牛血清购自Hyclone，以上试剂均为细胞实验级。HHT、阿霉素标品购自中国药品生物制品检定所。
（2）仪器。100 L半自动发酵罐110380型，上海百仑有限公司；立式旋转蒸发仪RE-5203AA型，上海亚荣仪器设备有限公司；CO2培养箱MCO-175型，SANYO；全自动酶标仪Synergy HT型，Bio-Tek；倒置显微镜CKX41SF型，OLYMPUS；全自动细胞计数器TC10型，Bio-Rad；高速冷冻离心机Hettich32R型，德国ZENTRIFΜGEN；液质联用Waters XEV0 TQ-S型，美国生物应用公司；超导核磁共振仪Bruker AV400 MHz型，瑞士Bruker公司。
（3）培养基。发酵培养基PDB：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1 L，pH自然，121 ℃，灭菌20 min；种子培养基同PDB；活化培养基：琼脂20 g，其余同PDB。
1.2 方法
1.2.1 大罐发酵培养 将F127菌株在PDA平板上活化后，取5 mm菌饼转接到PDB培养基中，26 ℃，转速115 r/min，恒温摇床震荡培养5 d获得种子液，再以8%的接种量接种至含60 L发酵培养基的发酵罐中，26 ℃，转速为115 r/min，通气量为2 m3/h，pH自然，大罐发酵培养11 d。
1.2.2 代谢产物提取与分离 将全部发酵培养物于45 ℃减压浓缩至5 L，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得粗提物浸膏。采用硅胶柱层析法，以石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇（V∶V∶V）对粗提物进行梯度洗脱，结合薄层色谱分析，反复洗脱极性相似组分，直至获得单体化合物。
1.2.3 化合物结构鉴定 将分离得到的单体化合物测定LC-MS和ES-MS，并进行核磁共振（NMR）分析，根据波谱数据解析其化学结构。
1.2.4 化合物抗肿瘤活性测定 采用MTT法[12]测定化合物的抗肿瘤活性，以1% DMSO为空白对照，以HHT、阿霉素为阳性对照，570 nm波长下测定每孔的吸光值，按下式计算抑制率。
抑制率（IR）=（1-待测样品OD570值/空白对照OD570值）×100%。
所有待测样品每个浓度设置5个复孔，结果取其平均值。用SPSS软件分析，测得化合物IC50值[13]。
2 结果与分析
2.1 代谢产物提取与分离
经浓缩过后的培养物用乙酸乙酯多次提取，减压悬蒸获得粗提物浸膏15.6 g。对粗提物浸膏以石油醚-乙酸乙酯（V∶V，50∶1、30∶1、10∶1、1∶1、1∶10、1∶30、1∶50）等梯度洗脱得到9个流分（Fr.1～Fr.9）。在薄层色谱的分析下进一步對流分梯度洗脱，Fr.2经石油醚-乙酸乙酯（5∶1）洗脱得到化合物1（11 mg）；Fr.3经石油醚-乙酸乙酯（1∶1）洗脱得到化合物2（8 mg）；Fr.4经乙酸乙酯-甲醇（8∶1）和乙酸乙酯-甲醇（4∶1）洗脱分别得到化合物3（5 mg）和4（20 mg）；Fr.7经乙酸乙酯-甲醇（4∶1）洗脱得到化合物5（6 mg）。
2.2 化合物结构鉴定
化合物1：白色粉末，易溶于氯仿甲醇，分子式为C16H24O3，ESI-MS： m/z=265.17[M+H]+，波谱数据1H NMR和13C NMR见表1，与文献[14]数据对照可以鉴定化合物1为oblongolide T。
化合物2：黄色粉末，易溶于氯仿甲醇，分子式为C14H16O3，ESI-MS： m/z=233.58[M+H]+，波谱数据1H NMR和13C NMR见表2，与文献[15]数据对照可鉴定化合物2为sorbicillin。
化合物3：无色油状物，易溶于氯仿甲醇，分子式为C16H22O4，ESI-MS： m/z=279.14[M+H]+，波谱数据1H NMR和13C NMR见表3，与文献[16]数据对照可鉴定化合物3为邻苯二甲酸二丁酯（Dibutylphthalate）。
化合物4：无色油状物，易溶于氯仿甲醇，分子式为C15H20O6，ESI-MS： m/z=296.89[M+H]+，波谱数据1H NMR和13C NMR见表4，与文献[17]数据对照可鉴定化合物4为phomopsolide B。
化合物5：白色针晶，易溶于氯仿甲醇，分子式为C10H10O4，ESI-MS： m/z=195.04[M+H]+，波谱数据1H NMR和13C NMR见表5，与文献[18，19]数据对照可鉴定化合物为6，8-二羟基-3-甲基-3，4-二氢异香豆素。 以上5種化合物的化学结构式如图1所示。
2.3 抗肿瘤活性测试
以MTT法对5个化合物进行抗肿瘤活性测试，结果IC50（μg/mL）如表6所示。化合物4对5株测试肿瘤细胞均表现出抑制作用，对K562、NB4、HL-60具有强细胞毒活性，IC50值均小于10 μg/mL；化合物1对3株白血病细胞均具有良好细胞毒活性，对HL-60细胞具有较强细胞毒活性，IC50值达到29.31 μg/mL；化合物5则对NB4、HepG-2表现出温和细胞毒活性；化合物2和3对这5株肿瘤细胞则未展现出细胞毒活性。
3 讨论
本研究成功从F127发酵液中分离得到5个单体化合物，以波谱技术对其进行结构解析，依次鉴定为：oblongolide T（1）、sorbicillin（2）、邻苯二甲酸二丁酯（3）、phomopsolide B（4）、6，8-二羟基-3-甲基-3，4-二氢异香豆素（5）。进一步肿瘤细胞毒活性测定，发现phomopsolide B对5株肿瘤细胞均表现出抑制活性，对K562、NB4、HL-60抑制效果显著，IC50值分别为3.35、0.014和0.16 μg/mL，对HepG-2和LoVo抑制温和，IC50值分别为92.94和87.34 μg/mL；oblongolide T对K562、NB4、HL-60均具有较好抑制活性，IC50值分别为51.82、54.25和29.31 μg/mL；6，8-二羟基-3-甲基-3，4-二氢异香豆素对NB4和HepG-2具有温和抑制活性，IC50值为87.08和96.57 μg/mL；Sorbicillin和邻苯二甲酸二丁酯对这5株测试肿瘤细胞则未表现出抑制活性。故此，首次从海南粗榧内生真菌获得的化合物1和化合物4 具有较强白血病毒活性，进一步研究，有望成为抗白血病药物的先导化合物。
Oblongolide为六缩酮γ-内酯（hexaketide γ-lactone），从榆树（elm tree）树皮韧皮部的Phomopsis oblonga次级代谢物中首次分离得到。Oblongolide T属于洛伐他汀类似物，由Lin等[14]首次从Phomopsis sp. XZ-26中分离得到，该文首次发现此物质对K562、NB4、HL-60具有良好抑制活性。Phomopsolide B从多种植物包括榆柳、喜树、白栎树、法国梧桐、木兰的Phomopsis sp.都曾分离得到过[20]，推测该次生代谢物的生物合成与Phomopsis sp.宿主植物不相关；此外，除本研究报道了该物质对K562、NB4、HL-60的强细胞毒活性外，Lin等[21]还发现该物质对HeLa细胞也具有强细胞毒活性（IC50=5.7 μg/mL）。化合物5属于二氢异香豆素类物质，这是一类植物体内比较常见天然物质，具有抗菌、抗虫、抗炎等多重活性[22]。Sorbicillin和邻苯二甲酸二丁酯虽然在本研究的抗肿瘤活性筛选中未表现出活性。但Bringmann等[23]从Penicillium chrysogenum代谢产物分离得的Sorbicillin类似物具有抗HIV活性且对 L5178y表现出强抑制作用。赵瑞等[24]从海洋青霉属分离得邻苯二甲酸二丁酯具有较强抗MRSA活性；曲新颜等[16]还报道了邻苯二甲酸二丁酯对小鼠乳腺癌温敏型tsFT210细胞具有G0/G1期细胞周期抑制作用。综上，本研究所分离化合物表现出较好且多样的生物活性，对相关药物的研发具有一定参考价值。
通过对海南粗榧内生真菌F127代谢产物的分离纯化、结构鉴定和活性测试，发现海南粗榧内生真菌F127能产多种抗肿瘤活性物质。目前正进一步研究该高活性菌株，采用不同发酵方式对其发酵，以期获得更多活性优良、结构新颖的化合物，为最终实现从药用植物内生真菌开发新颖药效成分提供科学依据。
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