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基金项目：湖南省科技厅基金项目（06FJ3017）；湖南省中医药管理局基金项目（2008093）
作者单位：411102 湖南省湘潭职业技术学院（陈丹）；湖南省中医药研究院（李柯，李若存）
通讯作者：陈丹
【摘要】 目的 建立活血促愈胶囊的质量标准。方法 采用薄层色谱法对处方中的丹参、槐米、三七、积雪草进行鉴别；用高效液相色谱法对成品中人参皂苷Rg1进行含量测定。结果 薄层色谱中能检出丹参、槐米、三七、积雪草；人参皂苷Rg1在2.26～13.56 μg范围呈良好的线性关系，r0.9998，平均回收率为97.22%，RSD为1.42%。结论 所建立的方法能够用于本品的质量控制。
【关键词】 活血促愈胶囊； 薄层色谱法； 人参皂苷Rg1； 高效液相色谱法
Study on quality standard for Huoxue Cuyu Capsule CHEN Dan*，LI Ke，LI Ruo-cun.*Xiangtan Vocational Technical College,Xiangtan 411102,China
【Abstract】 Objective To establish quality standards for Huoxue Cuyu Capsule.Methods Radix et Rhizoma Salviae,Flos Sophorae,Radix et Rhizoma Notoginseng,Herba Centellae were identified by TLC;Ginsenoside Rg1 was determined by HPLC.Results Radix et Rhizoma Salviae,Flos Sophorae,Radix et Rhizoma Notoginseng,Herba Centellae were detected by TLC;Ginsenoside Rg1 in the range of 2.26-13.56 μg was a good linear relationship,r0.9998;The average recovery was 97.22%,and RSD was 1.42%.Conclusion The established methods can be used for the quality control of Huoxue Cuyu Capsule.
【Key words】 Huoxue Cuyu Capsule; Thin layer chromatography; Ginsenoside Rg1; High performance liquid chromatography
活血促愈膠囊是由丹参、槐米、三七、积雪草组方研制而成的中药6类新药，功能为活血化瘀、凉血消肿、通络止痛，用于急性软组织损伤，中医辨证属血瘀证者。为了有效地控制其质量，笔者采用薄层色谱法对制剂中的丹参、槐米、三七、积雪草进行了鉴别，采用高效液相色谱法对三七的人参皂苷Rg1进行了含量测定。现报道如下。
1 仪器与试剂
LC-10A高效液相色谱仪（日本岛津）；C18（Column 200×4.6 mm，5 μ）色谱柱（大连依利特分析仪器有限公司）；N2000数据处理软件（浙江大学智能信息工程研究所）。羟基积雪草苷（批号：1110893-200201）、积雪草苷（批号：110892-200403）、芦丁对照品（批号：0080-9504）、丹参酮ⅡA、（ 批号：0766-200010）、三七皂苷R1 （批号：110745-200415）、人参皂苷Rg1 （批号：110703-200726）、人参皂苷Rb1 （批号：704-200114）均为中国药品生物制品检定所提供。甲醇、乙腈（色谱纯试剂，天津科密欧化学试剂有限公司），水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯（为湖南汇虹试剂有限公司提供）。活血促愈胶囊（批号：20080401、20080405、20080409）由湖南省中医药研究院中药研究所制剂室提供。
2 薄层色谱鉴别
2.1 丹参鉴别 取三批样品各1.0 g，加甲醇25 ml，超声处理30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水15 ml使溶解，溶液置分液漏斗中，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次15 ml，分取乙酸乙酯层（水层备用），蒸干，残渣加乙酸乙酯1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取丹参酮ⅡA对照品，加乙酸乙酯制成每1 ml含2 mg的溶液，作为对照品溶液。取除丹参外的其余处方量药材，按制备工艺方法制备缺丹参的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成缺丹参的阴性溶液照。照薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述三种溶液各10 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯（19∶1）为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。
2.2 槐米的鉴别 取丹参鉴别项下的水层，加水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次15 ml，分取正丁醇层，加氨试液振摇提取2次，每次15 ml，合并氨试液层（正丁醇层备用），蒸干，残渣加甲醇5 ml使溶解，作为供试品溶液。另取芦丁对照品，加甲醇制成每1 ml含4 mg的溶液，作为对照品溶液。取除槐米外的其余处方量药材，按制备工艺方法制备缺槐米的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成缺槐米的阴性溶液。照薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述三种溶液各10 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，待乙醇挥干后，分别置日光及紫外光灯（365 nm）下检视，阴性无干扰。
2.3 三七、积雪草的鉴别 取槐米鉴别项下的正丁醇层，用正丁醇饱和的水洗涤二次，每次15 ml，分取正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇2 ml使溶解，摇匀，作为供试品溶液。另取人参皂苷Rg1对照品、三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的混合溶液，作为对照品溶液。再取积雪草苷对照品及羟基积雪草苷对照品，加甲醇制成1 ml含1 mg的混合溶液，作为对照品溶液。取除三七外的其余处方量药材，按制备工艺方法制备缺三七的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成缺三七的阴性溶液。取除积雪草外的其余处方量药材，按制备工艺方法制备缺积雪草的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成缺积雪草的阴性溶液。照薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述供品溶液3～6 μl，对照品溶液各10 μl，阴性溶液各3～6 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶3∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰［1～5］。
3 含量测定
3.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.5%磷酸溶液（20∶80）为流动相；检测波长为203 nm。理论板数按人参皂苷Rb1峰计不低于2000。
3.2 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Rg1对照品适量，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，即得。
3.3 供试品溶液的制备 取本品内容物，研细，取约0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇20ml，超声30分钟（功率250W，频率40kHz），滤过，容器及滤渣用甲醇10 ml洗涤，洗液与滤液合并，蒸干，残渣加水15 ml使溶解，用以水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15 ml，合并正丁醇液，用氨试液25 ml洗涤1次，取正丁醇液，用以正丁醇饱和的水50 ml分2次洗涤，取正丁醇液，分液漏斗用适量正丁醇洗涤，洗液与正丁醇液合并，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.4 阴性溶液的制备 取除三七外的其余处方量药材，按制备工艺方法制备缺三七的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成缺三七的阴性溶液。
3.5 干扰试验 分别精密吸取对照品溶液、阴性溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定，结果表明，阴性溶液在人参皂苷Rg1保留时间处无吸收。
3.6 线性关系考察 精密吸取人参皂苷Rg1（C1.13 mg/ml）对照品溶液2、4、6、8、10、12 μl进样，测定其峰面積积分值，以浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为：Y104623X+19645，r0.9998。结果表明人参皂苷Rg1在2.26～13.56 μg范围内具有良好的线性关系。
3.7 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液20 μl，重复进样5次，测定其峰面积积分值，计算RSD（%）为0.64%，说明精密度良好。
3.8 稳定性试验 分别精密吸取供试品溶液20 μl，于0、4、8、12、24 h进样，测定其峰面积积分值。计算结果RSD（%）为0.73%，说明24 h内供试液稳定性良好。
3.9 重复性试验 取同一批号样品（批号：20080401）按上述条件，测定5次，测定其峰面积积分值。结果RSD（%）为0.40%，说明方法重复性好。
3.10 回收率试验 精密称取已知含量为11.28 mg/g（批号：20080401）样品约0.18 g，共6份，分别精密加入人参皂苷Rg1对照品溶液（1.2 mg/ml）1.0 ml，即1.2 mg，按含量测定项下的方法测定含量，计算回收率，平均值为97.22%，RSD为1.42%。结果见表1。
表1 回收率测定结果表
3.11 样品含量测定 取三批样品，按上述方法测定。结果见表2。
4 讨论
4.1 薄层色谱鉴别 活血促愈胶囊既含有非极性成分，也含有极性性成分，所以先采用甲醇提取、浓缩，浓缩物用水溶解，水层分别用乙酸乙酯和正丁醇萃取出非极性成分与极性成分，然后利用槐米中芦丁易溶于碱性溶液的性质，用氨试液将芦丁从正丁醇层提取出来。分别制成供试品溶液，以化学对照品丹参酮ⅡA、芦丁、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、积雪草苷及羟基积雪草苷对照，用TLC法分别检出成品中丹参、三七、积雪草、槐米。本法取样量少，处理方法简便，经济，省时，且薄层分离效果好。
表2 样品含量测定结果表
4.2 含量测定 三七为方中君药，主要含三七皂苷类成分，因此笔者拟参照《中国药典》2005年版一部三七含量测定方法测定三七总皂苷，由于成品中其它成分的干扰，未能达到要求。人参皂苷Rg1在三七中的含量较高，药理研究表明,三七Rg1是活血化瘀和促进骨拆愈合的有效成分，同时中国药品生物制品检定所已提供用于含量测定的对照品，参照《中国药典》2005年版一部人参叶项下的含量测定方法建立了成品中人参皂苷Rg1的含量方法，经方法学考察和产品测定的结果表明，所建立的方法简便，重现性好，能够作为控制本品内在质量的指标。
参考文献
［1］ 吕武清.中成药中的药材薄层色谱鉴别.北京：人民卫生出版社，1997.
［2］ 王宝琴.中成药质量标准与标准物质的研究.北京：中国医药科技出版社，1994.
［3］ 陈发奎.常用中草药有效成分含量测定.北京：人民卫生出版社，1997.
［4］ 王喜军.高效液相色谱在中药研究中的应用.哈尔滨：黑龙江科学出版社，1994.
［5］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典.北京：化学工业出版社，2005.
（收稿日期：2011-04-25）
（本文编辑：梅宏伟）
作者单位：411102 湖南省湘潭职业技术学院（陈丹）；湖南省中医药研究院（李柯，李若存）
通讯作者：陈丹
【摘要】 目的 建立活血促愈胶囊的质量标准。方法 采用薄层色谱法对处方中的丹参、槐米、三七、积雪草进行鉴别；用高效液相色谱法对成品中人参皂苷Rg1进行含量测定。结果 薄层色谱中能检出丹参、槐米、三七、积雪草；人参皂苷Rg1在2.26～13.56 μg范围呈良好的线性关系，r0.9998，平均回收率为97.22%，RSD为1.42%。结论 所建立的方法能够用于本品的质量控制。
【关键词】 活血促愈胶囊； 薄层色谱法； 人参皂苷Rg1； 高效液相色谱法
Study on quality standard for Huoxue Cuyu Capsule CHEN Dan*，LI Ke，LI Ruo-cun.*Xiangtan Vocational Technical College,Xiangtan 411102,China
【Abstract】 Objective To establish quality standards for Huoxue Cuyu Capsule.Methods Radix et Rhizoma Salviae,Flos Sophorae,Radix et Rhizoma Notoginseng,Herba Centellae were identified by TLC;Ginsenoside Rg1 was determined by HPLC.Results Radix et Rhizoma Salviae,Flos Sophorae,Radix et Rhizoma Notoginseng,Herba Centellae were detected by TLC;Ginsenoside Rg1 in the range of 2.26-13.56 μg was a good linear relationship,r0.9998;The average recovery was 97.22%,and RSD was 1.42%.Conclusion The established methods can be used for the quality control of Huoxue Cuyu Capsule.
【Key words】 Huoxue Cuyu Capsule; Thin layer chromatography; Ginsenoside Rg1; High performance liquid chromatography
活血促愈膠囊是由丹参、槐米、三七、积雪草组方研制而成的中药6类新药，功能为活血化瘀、凉血消肿、通络止痛，用于急性软组织损伤，中医辨证属血瘀证者。为了有效地控制其质量，笔者采用薄层色谱法对制剂中的丹参、槐米、三七、积雪草进行了鉴别，采用高效液相色谱法对三七的人参皂苷Rg1进行了含量测定。现报道如下。
1 仪器与试剂
LC-10A高效液相色谱仪（日本岛津）；C18（Column 200×4.6 mm，5 μ）色谱柱（大连依利特分析仪器有限公司）；N2000数据处理软件（浙江大学智能信息工程研究所）。羟基积雪草苷（批号：1110893-200201）、积雪草苷（批号：110892-200403）、芦丁对照品（批号：0080-9504）、丹参酮ⅡA、（ 批号：0766-200010）、三七皂苷R1 （批号：110745-200415）、人参皂苷Rg1 （批号：110703-200726）、人参皂苷Rb1 （批号：704-200114）均为中国药品生物制品检定所提供。甲醇、乙腈（色谱纯试剂，天津科密欧化学试剂有限公司），水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯（为湖南汇虹试剂有限公司提供）。活血促愈胶囊（批号：20080401、20080405、20080409）由湖南省中医药研究院中药研究所制剂室提供。
2 薄层色谱鉴别
2.1 丹参鉴别 取三批样品各1.0 g，加甲醇25 ml，超声处理30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水15 ml使溶解，溶液置分液漏斗中，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次15 ml，分取乙酸乙酯层（水层备用），蒸干，残渣加乙酸乙酯1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取丹参酮ⅡA对照品，加乙酸乙酯制成每1 ml含2 mg的溶液，作为对照品溶液。取除丹参外的其余处方量药材，按制备工艺方法制备缺丹参的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成缺丹参的阴性溶液照。照薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述三种溶液各10 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯（19∶1）为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。
2.2 槐米的鉴别 取丹参鉴别项下的水层，加水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次15 ml，分取正丁醇层，加氨试液振摇提取2次，每次15 ml，合并氨试液层（正丁醇层备用），蒸干，残渣加甲醇5 ml使溶解，作为供试品溶液。另取芦丁对照品，加甲醇制成每1 ml含4 mg的溶液，作为对照品溶液。取除槐米外的其余处方量药材，按制备工艺方法制备缺槐米的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成缺槐米的阴性溶液。照薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述三种溶液各10 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，待乙醇挥干后，分别置日光及紫外光灯（365 nm）下检视，阴性无干扰。
2.3 三七、积雪草的鉴别 取槐米鉴别项下的正丁醇层，用正丁醇饱和的水洗涤二次，每次15 ml，分取正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇2 ml使溶解，摇匀，作为供试品溶液。另取人参皂苷Rg1对照品、三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的混合溶液，作为对照品溶液。再取积雪草苷对照品及羟基积雪草苷对照品，加甲醇制成1 ml含1 mg的混合溶液，作为对照品溶液。取除三七外的其余处方量药材，按制备工艺方法制备缺三七的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成缺三七的阴性溶液。取除积雪草外的其余处方量药材，按制备工艺方法制备缺积雪草的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成缺积雪草的阴性溶液。照薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述供品溶液3～6 μl，对照品溶液各10 μl，阴性溶液各3～6 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶3∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰［1～5］。
3 含量测定
3.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.5%磷酸溶液（20∶80）为流动相；检测波长为203 nm。理论板数按人参皂苷Rb1峰计不低于2000。
3.2 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Rg1对照品适量，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，即得。
3.3 供试品溶液的制备 取本品内容物，研细，取约0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇20ml，超声30分钟（功率250W，频率40kHz），滤过，容器及滤渣用甲醇10 ml洗涤，洗液与滤液合并，蒸干，残渣加水15 ml使溶解，用以水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15 ml，合并正丁醇液，用氨试液25 ml洗涤1次，取正丁醇液，用以正丁醇饱和的水50 ml分2次洗涤，取正丁醇液，分液漏斗用适量正丁醇洗涤，洗液与正丁醇液合并，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.4 阴性溶液的制备 取除三七外的其余处方量药材，按制备工艺方法制备缺三七的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成缺三七的阴性溶液。
3.5 干扰试验 分别精密吸取对照品溶液、阴性溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定，结果表明，阴性溶液在人参皂苷Rg1保留时间处无吸收。
3.6 线性关系考察 精密吸取人参皂苷Rg1（C1.13 mg/ml）对照品溶液2、4、6、8、10、12 μl进样，测定其峰面積积分值，以浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为：Y104623X+19645，r0.9998。结果表明人参皂苷Rg1在2.26～13.56 μg范围内具有良好的线性关系。
3.7 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液20 μl，重复进样5次，测定其峰面积积分值，计算RSD（%）为0.64%，说明精密度良好。
3.8 稳定性试验 分别精密吸取供试品溶液20 μl，于0、4、8、12、24 h进样，测定其峰面积积分值。计算结果RSD（%）为0.73%，说明24 h内供试液稳定性良好。
3.9 重复性试验 取同一批号样品（批号：20080401）按上述条件，测定5次，测定其峰面积积分值。结果RSD（%）为0.40%，说明方法重复性好。
3.10 回收率试验 精密称取已知含量为11.28 mg/g（批号：20080401）样品约0.18 g，共6份，分别精密加入人参皂苷Rg1对照品溶液（1.2 mg/ml）1.0 ml，即1.2 mg，按含量测定项下的方法测定含量，计算回收率，平均值为97.22%，RSD为1.42%。结果见表1。
表1 回收率测定结果表
3.11 样品含量测定 取三批样品，按上述方法测定。结果见表2。
4 讨论
4.1 薄层色谱鉴别 活血促愈胶囊既含有非极性成分，也含有极性性成分，所以先采用甲醇提取、浓缩，浓缩物用水溶解，水层分别用乙酸乙酯和正丁醇萃取出非极性成分与极性成分，然后利用槐米中芦丁易溶于碱性溶液的性质，用氨试液将芦丁从正丁醇层提取出来。分别制成供试品溶液，以化学对照品丹参酮ⅡA、芦丁、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、积雪草苷及羟基积雪草苷对照，用TLC法分别检出成品中丹参、三七、积雪草、槐米。本法取样量少，处理方法简便，经济，省时，且薄层分离效果好。
表2 样品含量测定结果表
4.2 含量测定 三七为方中君药，主要含三七皂苷类成分，因此笔者拟参照《中国药典》2005年版一部三七含量测定方法测定三七总皂苷，由于成品中其它成分的干扰，未能达到要求。人参皂苷Rg1在三七中的含量较高，药理研究表明,三七Rg1是活血化瘀和促进骨拆愈合的有效成分，同时中国药品生物制品检定所已提供用于含量测定的对照品，参照《中国药典》2005年版一部人参叶项下的含量测定方法建立了成品中人参皂苷Rg1的含量方法，经方法学考察和产品测定的结果表明，所建立的方法简便，重现性好，能够作为控制本品内在质量的指标。
参考文献
［1］ 吕武清.中成药中的药材薄层色谱鉴别.北京：人民卫生出版社，1997.
［2］ 王宝琴.中成药质量标准与标准物质的研究.北京：中国医药科技出版社，1994.
［3］ 陈发奎.常用中草药有效成分含量测定.北京：人民卫生出版社，1997.
［4］ 王喜军.高效液相色谱在中药研究中的应用.哈尔滨：黑龙江科学出版社，1994.
［5］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典.北京：化学工业出版社，2005.
（收稿日期：2011-04-25）
（本文编辑：梅宏伟）