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摘要 目的：探讨消渴痹通胶囊对高糖诱导的RSC96雪旺细胞损伤的保护作用及其机制。方法：将RSC96雪旺细胞复苏及培养，采用免疫细胞化学法检测RSC96细胞的特异性蛋白S-100的表达情况，进行雪旺细胞鉴定;以高糖诱导造成RSC96雪旺细胞损伤，梯度高糖浓度比较，确定后续研究所采用的高糖浓度;通过MTT法检测消渴痹痛胶囊对高糖诱导的RSC96雪旺细胞的保护作用，采用免疫组织化学检测NGF蛋白水平和蛋白质印迹法检测P-AKT/AKT通路及caspase-3的蛋白水平。结果：1）RSC96雪旺细胞存活率随着消渴痹痛胶囊药物浓度的升高而增加（P<0.05）。2）NGF蛋白表达量随着消渴痹痛胶囊药物浓度增加（P<0.05）。3）p-AKT/t-AKT和caspase-3蛋白表达下调，且随着消渴痹痛胶囊药物浓度增加而减少（P<0.05）。结论：消渴痹痛胶囊可能通过抑制PI3K/AKT信号转导通路的激活，从而下调caspase-3蛋白的表达水平，抑制雪旺细胞的细胞凋亡，同时又上调NGF的表达水平，为周围神经的髓鞘细胞提供神经营养物质，从而对高糖诱导的RSC96雪旺细胞起到保护作用。
关键词 消渴痹通胶囊;高糖;RSC96雪旺细胞;损伤;保护作用;机制;NGF;AKT
Protective Effects of Xiaoke Bitong Capsules on High Glucose-Induced Injury of RSC96 Schwann Cells and Its Mechanism
Zhang Wenjing，Sun Yake
Abstract Objective：To investigate the protective effects of Xiaoke Bitong Capsules on RSC96 Schwann cell injury induced by high glucose and its mechanism.Methods：RSC96 Schwann cells were resuscitated and cultured.The expression of specific protein S100 in RSC96 cells was detected by immunocytochemistry and identified by Schwann cells.The damage of RSC96 Schwann cells induced by high glucose was compared with the gradient high glucose concentration，and the high glucose concentration used in the follow-up study was determined.The protective effects of Xiaoke Bitong Capsule on RSC96 Schwann cells induced by high glucose was detected by MTT method.The level of NGF protein was detected by immunohistochemistry and the protein level of P-AKT/AKT pathway and caspase-3 was detected by Western blot.Results：1）The survival rate of RSC96 Schwann cells increased with the increase of Xiaoke Bitong Capsules concentration.2）The expression of NGF protein increased with the concentration of Xiaoke Bitong Capsules.3）The expression of p-AKT/t-AKT and caspase-3 protein was down-regulated and decreased with the increase of the concentration of Xiaoke Bitong Capsules（P<0.05）.Conclusion：Xiaoke Bitong Capsules may down-regulate the expression of caspase-3 protein，inhibit the apoptosis of Schwann cells and up-regulate the expression of NGF by inhibiting the activation of PI3K/AKT signal transduction pathway.The myelin sheath cells of peripheral nerves are provided with neuronutrients，which can protect RSC96 Schwann cells induced by high glucose.
Key Words Xiaoke Bitong Capsules; High glucose; RSC96 Schwann cell; Injury; Protective effects; Mechanism; NGF; AKT
中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.013
糖尿病是临床上常见的慢性疾病之一，其发生不同程度的糖尿病周围神经病变的概率达60%以上[1]，患者出现以远端对称性感觉和运动性多发性神经病变等临床症状[2]，主要由神经元的损伤和血管病变等病理因素所致[3]。然而复杂的发病机制使得糖尿病周围神经病变的治疗相当棘手，尽管控制血糖可以缓解糖尿病周围神经病变的临床症状，但是却不能遏制该疾病的进一步发展。本团队在临床上除控制患者血糖外，采用院内制剂消渴痹痛胶囊治疗患者，经益气活血，化瘀通络进一步延缓糖尿病周围神经病变的进展[4]。目前关于消渴痹痛胶囊对糖尿病周围神经病变的机制研究报道较少，基于雪旺细胞是周围神经的髓鞘细胞[5]，对周围神经损伤的修复和再生具有重要的作用[6]，因此本研究采用高糖诱导RSC96雪旺细胞模拟糖尿病周围神经病变，并以消渴痹痛胶囊进行干预探究其保护作用及机制，现报道如下。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 所用的RSC96雪旺细胞购买于ATCC细胞库（批号：CRL-2765）。RSC96雪旺细胞复苏及培养：从液氮罐中快速取出RSC96细胞，37 ℃水浴快速解冻约1 min，将细胞悬浮液（1 mL）吸入15 mL离心管内并加入1 mL DMEM完全培养基，混匀后1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入5 mL含10%FBS、1%双抗、5 mmol/L葡萄糖的完全DMEM培养基;置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。显微镜下观察复苏的RSC96细胞生长状态，当细胞生长状态良好且铺满T25培养瓶的90%时进行细胞传代。1～2 d换液1次，2～4 d传代。取对数生长期的RSC96细胞进行后续实验。
1.1.2 药物 消渴痹痛胶囊（黄芪30 g、桑枝10 g、威灵仙10 g、牛膝10 g、鸡血藤15 g、豨莶草15 g、全蝎3 g等）为本院院内制剂，取1.5 mL EP管，每个EP管分装消渴痹痛胶囊内容物50 mg，-20 ℃冰箱保存待用。
1.1.3 试剂与仪器
1.1.3.1 试剂 1640培养基购买于Hyclone公司;胎牛血清（FBS）购买于Gibco公司;MTT检测试剂盒购买于美国Amresco公司;二甲基亚砜（DMSO）和多聚左旋赖氨酸购买于Sigma公司;Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody购买于CST公司;Anti-mouse IgG、HRP-linked Antibody购买于CST公司，兔抗鼠NGF抗体购买于Eptomics公司;鼠抗GAPDH抗体、Caspase-3 Antibody、p-Akt1/2/3 Antibody（Ser473）-R和Akt1/2/3Antibody（H-136）购买于Santa公司;免疫组化试剂盒购买于碧云天生物技术公司。
1.1.3.2 仪器 CO2细胞培养箱（日本SANYO公司，型号：MCO-170AICUVL）、96孔板（CORNING公司，型号：Costar 3897）;荧光显微镜购买于日本Nikon公司，型号：E200;全波长酶标仪购买于美国ThermoFisher公司，型号：multiskan-go;超声波细胞破碎仪购买于南京凡帝朗信息科技有限公司，型号：FDL-1000D;垂直电泳仪和转膜仪购买于美国Bio-Rad公司，型号：165-8001，170-3940;凝胶成像系统购买于美国Bio-Rad公司，型号：Gel-Doc XR+。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 用96孔板接种细胞，每孔加入200 μL培养液，设置空白对照、control对照组和高糖处理组，于正常培养24 h后，在高糖处理在中用不同浓度（50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/L）的高糖对细胞进行处理，在培养24 h后行MTT实验。测定并记录各孔的OD值，计算细胞存活率。结果显示，随着高糖浓度的增加，RSC96雪旺细胞的存活率下降（P<0.05），其中400 mmol/L的存活率约21%，太低，不适宜后续试验的开展，因此高糖浓度确定为200 mmol/L，其细胞存活率约53%，处于中线水平，即通过高糖诱导出RSC96雪旺细胞损伤模型，又适宜后续试验的开展。见表1。
1.2.2 给药方法
1.2.2.1 对照组 含糖0 mmol/L、10%FBS、1%双抗的DMEM培养基、200 μL RSC96雪旺细胞细胞悬液。
1.2.2.2 高糖组 含糖200 mmol/L、10%FBS、1%双抗的DMEM培养基、200 μL RSC96雪旺细胞细胞悬液。
1.2.2.3 干预组 10%FBS、1%双抗的DMEM培养基、200 μL RSC96雪旺细胞细胞悬液，在用高糖处理之前，我们先用不同浓度（0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、1 mmol/L）的消渴痹痛胶囊对RSC96细胞预干预处理3 h，然后再加入200 mmol/L的高糖共培养24 h。
1.2.3 检测指标与方法
1.2.3.1 RSC96雪旺细胞的鉴定方法 采用免疫细胞化学法对RSC96雪旺细胞进行鉴定，首先取经多聚赖氨酸处理后的六孔板上铺好玻片，做细胞爬片，将第4代细胞接种到六孔板上（5×104），培养24 h后采用免疫细胞化学法检测RSC96细胞的特异性蛋白S-100的表达情况，进行鉴定，试验中设置阴性对照组（正常培养的细胞），每组设置3个复孔。
1.2.3.2 MTT法检测消渴痹痛胶囊对高糖诱导的RSC96雪旺细胞的保护作用 取生长状态良好的3～5代细胞接种于96孔培养板中，用血球计数板计数后，按照2×104个/mL密度的接种，实验分为空白对照组、正常对照组和葛根素干预组3个组，空白对照组中每孔仅加入200 μL的1640基础培养基，其余各组中每孔均加入200 μL的细胞混悬液，各组分别设置5个复孔。于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h后，将葛根素干预组的各孔内的培养基吸出，换为含不同浓度葛根素的1640培养基，其中葛根素的浓度设置为0.01、0.1、1、10、100 mmol/L，放回培养箱继续培养。3 h后，每孔各加入20 μL MTT液（5 mg/mL），继续孵育4 h后终止培养。小心吸弃孔内上清液，每孔加入150 μL DMSO，室温下震荡5～10 min，操作需避光。在酶标仪上选择570 nm波长，测定OD值，重复3次实验，记录并分析结果。
1.2.3.3 免疫组织化学检测NGF蛋白的表达情况 各组细胞以磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗5次后，在含有4%福尔马林中固定约10 min，PBS冲洗后在细胞上滴加0.3%的H2O2覆盖盖玻片，室温孵育10 min;再以pH值7.4 0.2 mol/L PBS清洗后，滴加BSA于细胞中，室温封闭孵育20 min，仅用吸水纸从细胞邊吸去多余液体，注意不要碰到细胞以免造成破坏。滴加鼠抗兔NGF一抗（1∶500），4 ℃冰箱中过夜。第2天将切片拿出后以pH值7.4 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液清洗3次×3 min后，滴加生物素化山羊抗兔IgG并于室温下孵育30 min。以pH值7.4 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液清洗后滴加试剂SABC，室温孵育30 min，然后滴加DAB显色液，室温下孵育30 min，双蒸水多次洗涤，经上行梯度乙醇脱水;再经二甲苯透明;中性树胶封片。室温晾干后，光学显微镜下观察、摄片。每只大鼠分别随机选取10个切片，分别计数每张切片3个视野的细胞中NGF阳性细胞表达数目，确平均值纳入统计分析。 1.2.3.4 蛋白质印迹法检测P-AKT/AKT通路及caspase-3的蛋白表达情况 收集各组细胞，充分裂解并用超声波细胞破碎仪进行破碎处理，放置样品细胞间的粘连;随即在100 ℃恒温水浴中进行蛋白变性，并用BCA法测定样品蛋白浓度，-20 ℃保存待用。将标记蛋白的masker和各组样品加样到已经装好电泳液的电泳胶槽后，进行蛋白分离电泳，随即根据目标蛋白切胶，进行转膜电泳，将电泳胶上的目标蛋白转到相对稳定不易碎的PVDF膜上，将PVDF膜放入5%脱脂奶粉的封闭液中30 min，TBST洗膜后孵育P-AKT/AKT、caspase-3和GAPDH一抗，4 ℃孵育过夜TBST洗膜后孵育各指标相应的二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜后ECL发光，在凝胶成像系统上查看各组蛋白条带及其灰度值。
1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。首先对各组数据进行正态性及方差齐性检验，若呈正态性分布且方差齐，则采用单因素方差分析（one-way ANOVA）同时选择最小显著性差异检验（Least Significant Difference，LSD）进行组间和组内的统计;若呈正态性分布且方差不齐，则采用单因素方差分析（one-way ANOVA）同时选择非参数检验（Tamhane′s T2）进行组间和组内的统计;若不满足正态性和方差齐性，采用多样本秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RSC96雪旺细胞的鉴定结果 正常培养的RSC96细胞在经免疫细胞化学方法处理后，其结果显示，对照组中的细胞胞体和轴突呈现棕色，说明RSC96雪旺细胞的特异性抗体S-100表达为阳性;而相应的阴性对照组中细胞胞体不显色，细胞核为蓝色。见图1。
2.2 消渴痹痛胶囊对高糖诱导的RSC96雪旺细胞的保护作用 对照组比较，高糖组和干预组明显RSC96雪旺细胞存活率降低（P<0.05），与高糖组比较，干预组中RSC96雪旺细胞存活率增高（P<0.05），且RSC96雪旺细胞存活率随着消渴痹痛胶囊药物浓度的升高而增加（P<0.05）。见表2。
2.3 消渴痹痛胶囊对高糖诱导的RSC96雪旺细胞中NGF蛋白表达的影响 对照组中RSC96雪旺细胞、轴突上NGF蛋白表达均呈棕色，即为阳性表达，与之比较，高糖组和干预组均减少（P<0.05），而与高糖组比较，干预组中NGF蛋白表达量增加，且随着消渴痹痛胶囊药物浓度增加（P<0.05）。见图2。
2.4 各组细胞p-AKT/t-AKT和caspase-3比值的比较 与对照组比较，高糖组和干预组中RSC96雪旺细胞p-AKT/t-AKT和caspase-3比值正高（P<0.05），而与高糖组比较，干预组中p-AKT/t-AKT和caspase-3蛋白表达下调，且随着消渴痹痛胶囊药物浓度增加而减少（P<0.05）。见表3。
3 讨论
糖尿病周围神经病变在中医学中属于“消渴痹症”，由于机体正气亏虚，内外感邪气在体内瘀滞而化热化燥，伤阴耗液，发为消渴;消渴病况日久，气血阴阳受损，其病机虚实夹杂，多见阴阳两虚，以虚为本而以邪实为标，进而痰浊瘀血，阻滞经络[7];正如叶天士所说：“病久气血推行不利，血络之中，必有瘀凝……久存脉道，络中气血阻滞不通，必猝然而痛”。消渴痹症病久伤络，故主张治疗时多将“祛瘀通络”贯穿始终，故多以“扶正祛邪通络”进行治疗[8-10]。而消渴痹痛胶囊中以黄芪为君药，益气健脾，固本之时亦能敛疮生肌;臣以桑枝祛风通络，鸡血藤补血行血，舒经活络;豨莶草和牛膝，同归肝肾经，共奏补肝肾，强筋骨之功，威灵仙祛风除湿，通络止痛，同为佐药;全蝎息风止痉，通经止痛，引诸药到肢体末端，为佐使药[11]。全方补血活血，补益肝肾以治本，化瘀通络以治标。本研究结果显示消渴痹痛胶囊干预后增加了RSC96雪旺细胞的存活率，提示消渴痹痛胶囊对高糖诱导的RSC96雪旺细胞的损伤具有保护作用。
为进一步探讨其保护机制，由于在糖尿病周围神经病变病理演变进程中，判定糖尿病周圍神经受损的重要标志是神经传导速度的异常，相应的周围神经再生也存在着缺陷。而在神经营养因子家族中，神经生长因子（NGF）是最具活力的能够营养神经的生物活性因子之一，存在于周围神经的雪旺氏细胞及神经节等部位[12]。当糖尿病周围性神经病变患者胰岛素缺乏或雪旺细胞受损均能够减少NGF合成，而NGF通过逆向轴浆运输障碍进一步引起神经营养缺乏、神经再生障碍[13-14]。有研究显示[15]，采用不同浓度NGF对RSC96大鼠雪旺细胞株进行干预，发现NGF对高糖所引起的雪旺细胞损伤和生长抑制有明显的改善作用。本研究结果显示，消渴痹痛胶囊对高糖诱导的RSC96雪旺细胞干预后可上调NGF的蛋白表达，保护受损雪旺细胞。有实验研究显示[16-18]NGF能够调控PI3K/Akt和ERK1/2以及GSK3β等3条信号转导通路，抑制由高糖诱导的RSC96雪旺细胞内ERS的过度激活，降低雪旺细胞的细胞凋亡水平，从而达到治疗糖尿病周围性神经病变的目的。本研究进一步探讨研究发现，消渴痹痛胶囊对高糖诱导的RSC96雪旺细胞干预后，降低p-AKT和caspase-3的蛋白表达水平;提示消渴痹痛胶囊可能通过抑制PI3K/AKT信号转导通路的激活，从而下调caspase-3蛋白的表达水平，抑制雪旺细胞的细胞凋亡，同时又上调NGF的表达水平，为周围神经的髓鞘细胞提供神经营养物质，从而对高糖诱导的RSC96雪旺细胞起到保护作用。
参考文献
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（2019-05-31收稿 责任编辑：王明）
基金项目：国家自然科学基金项目（81070641）作者简介：张文静（1983.01—），女，硕士，主管药师，研究方向：中医药药理学研究，E-mail：zhangwenjing0123@163.com通信作者：孙亚克（1990.04—），女，本科，初级药师，研究方向：中医药药理学研究，E-mail：984453858@qq.com
关键词 消渴痹通胶囊;高糖;RSC96雪旺细胞;损伤;保护作用;机制;NGF;AKT
Protective Effects of Xiaoke Bitong Capsules on High Glucose-Induced Injury of RSC96 Schwann Cells and Its Mechanism
Zhang Wenjing，Sun Yake
Abstract Objective：To investigate the protective effects of Xiaoke Bitong Capsules on RSC96 Schwann cell injury induced by high glucose and its mechanism.Methods：RSC96 Schwann cells were resuscitated and cultured.The expression of specific protein S100 in RSC96 cells was detected by immunocytochemistry and identified by Schwann cells.The damage of RSC96 Schwann cells induced by high glucose was compared with the gradient high glucose concentration，and the high glucose concentration used in the follow-up study was determined.The protective effects of Xiaoke Bitong Capsule on RSC96 Schwann cells induced by high glucose was detected by MTT method.The level of NGF protein was detected by immunohistochemistry and the protein level of P-AKT/AKT pathway and caspase-3 was detected by Western blot.Results：1）The survival rate of RSC96 Schwann cells increased with the increase of Xiaoke Bitong Capsules concentration.2）The expression of NGF protein increased with the concentration of Xiaoke Bitong Capsules.3）The expression of p-AKT/t-AKT and caspase-3 protein was down-regulated and decreased with the increase of the concentration of Xiaoke Bitong Capsules（P<0.05）.Conclusion：Xiaoke Bitong Capsules may down-regulate the expression of caspase-3 protein，inhibit the apoptosis of Schwann cells and up-regulate the expression of NGF by inhibiting the activation of PI3K/AKT signal transduction pathway.The myelin sheath cells of peripheral nerves are provided with neuronutrients，which can protect RSC96 Schwann cells induced by high glucose.
Key Words Xiaoke Bitong Capsules; High glucose; RSC96 Schwann cell; Injury; Protective effects; Mechanism; NGF; AKT
中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.013
糖尿病是临床上常见的慢性疾病之一，其发生不同程度的糖尿病周围神经病变的概率达60%以上[1]，患者出现以远端对称性感觉和运动性多发性神经病变等临床症状[2]，主要由神经元的损伤和血管病变等病理因素所致[3]。然而复杂的发病机制使得糖尿病周围神经病变的治疗相当棘手，尽管控制血糖可以缓解糖尿病周围神经病变的临床症状，但是却不能遏制该疾病的进一步发展。本团队在临床上除控制患者血糖外，采用院内制剂消渴痹痛胶囊治疗患者，经益气活血，化瘀通络进一步延缓糖尿病周围神经病变的进展[4]。目前关于消渴痹痛胶囊对糖尿病周围神经病变的机制研究报道较少，基于雪旺细胞是周围神经的髓鞘细胞[5]，对周围神经损伤的修复和再生具有重要的作用[6]，因此本研究采用高糖诱导RSC96雪旺细胞模拟糖尿病周围神经病变，并以消渴痹痛胶囊进行干预探究其保护作用及机制，现报道如下。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 所用的RSC96雪旺细胞购买于ATCC细胞库（批号：CRL-2765）。RSC96雪旺细胞复苏及培养：从液氮罐中快速取出RSC96细胞，37 ℃水浴快速解冻约1 min，将细胞悬浮液（1 mL）吸入15 mL离心管内并加入1 mL DMEM完全培养基，混匀后1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入5 mL含10%FBS、1%双抗、5 mmol/L葡萄糖的完全DMEM培养基;置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。显微镜下观察复苏的RSC96细胞生长状态，当细胞生长状态良好且铺满T25培养瓶的90%时进行细胞传代。1～2 d换液1次，2～4 d传代。取对数生长期的RSC96细胞进行后续实验。
1.1.2 药物 消渴痹痛胶囊（黄芪30 g、桑枝10 g、威灵仙10 g、牛膝10 g、鸡血藤15 g、豨莶草15 g、全蝎3 g等）为本院院内制剂，取1.5 mL EP管，每个EP管分装消渴痹痛胶囊内容物50 mg，-20 ℃冰箱保存待用。
1.1.3 试剂与仪器
1.1.3.1 试剂 1640培养基购买于Hyclone公司;胎牛血清（FBS）购买于Gibco公司;MTT检测试剂盒购买于美国Amresco公司;二甲基亚砜（DMSO）和多聚左旋赖氨酸购买于Sigma公司;Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody购买于CST公司;Anti-mouse IgG、HRP-linked Antibody购买于CST公司，兔抗鼠NGF抗体购买于Eptomics公司;鼠抗GAPDH抗体、Caspase-3 Antibody、p-Akt1/2/3 Antibody（Ser473）-R和Akt1/2/3Antibody（H-136）购买于Santa公司;免疫组化试剂盒购买于碧云天生物技术公司。
1.1.3.2 仪器 CO2细胞培养箱（日本SANYO公司，型号：MCO-170AICUVL）、96孔板（CORNING公司，型号：Costar 3897）;荧光显微镜购买于日本Nikon公司，型号：E200;全波长酶标仪购买于美国ThermoFisher公司，型号：multiskan-go;超声波细胞破碎仪购买于南京凡帝朗信息科技有限公司，型号：FDL-1000D;垂直电泳仪和转膜仪购买于美国Bio-Rad公司，型号：165-8001，170-3940;凝胶成像系统购买于美国Bio-Rad公司，型号：Gel-Doc XR+。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 用96孔板接种细胞，每孔加入200 μL培养液，设置空白对照、control对照组和高糖处理组，于正常培养24 h后，在高糖处理在中用不同浓度（50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/L）的高糖对细胞进行处理，在培养24 h后行MTT实验。测定并记录各孔的OD值，计算细胞存活率。结果显示，随着高糖浓度的增加，RSC96雪旺细胞的存活率下降（P<0.05），其中400 mmol/L的存活率约21%，太低，不适宜后续试验的开展，因此高糖浓度确定为200 mmol/L，其细胞存活率约53%，处于中线水平，即通过高糖诱导出RSC96雪旺细胞损伤模型，又适宜后续试验的开展。见表1。
1.2.2 给药方法
1.2.2.1 对照组 含糖0 mmol/L、10%FBS、1%双抗的DMEM培养基、200 μL RSC96雪旺细胞细胞悬液。
1.2.2.2 高糖组 含糖200 mmol/L、10%FBS、1%双抗的DMEM培养基、200 μL RSC96雪旺细胞细胞悬液。
1.2.2.3 干预组 10%FBS、1%双抗的DMEM培养基、200 μL RSC96雪旺细胞细胞悬液，在用高糖处理之前，我们先用不同浓度（0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、1 mmol/L）的消渴痹痛胶囊对RSC96细胞预干预处理3 h，然后再加入200 mmol/L的高糖共培养24 h。
1.2.3 检测指标与方法
1.2.3.1 RSC96雪旺细胞的鉴定方法 采用免疫细胞化学法对RSC96雪旺细胞进行鉴定，首先取经多聚赖氨酸处理后的六孔板上铺好玻片，做细胞爬片，将第4代细胞接种到六孔板上（5×104），培养24 h后采用免疫细胞化学法检测RSC96细胞的特异性蛋白S-100的表达情况，进行鉴定，试验中设置阴性对照组（正常培养的细胞），每组设置3个复孔。
1.2.3.2 MTT法检测消渴痹痛胶囊对高糖诱导的RSC96雪旺细胞的保护作用 取生长状态良好的3～5代细胞接种于96孔培养板中，用血球计数板计数后，按照2×104个/mL密度的接种，实验分为空白对照组、正常对照组和葛根素干预组3个组，空白对照组中每孔仅加入200 μL的1640基础培养基，其余各组中每孔均加入200 μL的细胞混悬液，各组分别设置5个复孔。于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h后，将葛根素干预组的各孔内的培养基吸出，换为含不同浓度葛根素的1640培养基，其中葛根素的浓度设置为0.01、0.1、1、10、100 mmol/L，放回培养箱继续培养。3 h后，每孔各加入20 μL MTT液（5 mg/mL），继续孵育4 h后终止培养。小心吸弃孔内上清液，每孔加入150 μL DMSO，室温下震荡5～10 min，操作需避光。在酶标仪上选择570 nm波长，测定OD值，重复3次实验，记录并分析结果。
1.2.3.3 免疫组织化学检测NGF蛋白的表达情况 各组细胞以磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗5次后，在含有4%福尔马林中固定约10 min，PBS冲洗后在细胞上滴加0.3%的H2O2覆盖盖玻片，室温孵育10 min;再以pH值7.4 0.2 mol/L PBS清洗后，滴加BSA于细胞中，室温封闭孵育20 min，仅用吸水纸从细胞邊吸去多余液体，注意不要碰到细胞以免造成破坏。滴加鼠抗兔NGF一抗（1∶500），4 ℃冰箱中过夜。第2天将切片拿出后以pH值7.4 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液清洗3次×3 min后，滴加生物素化山羊抗兔IgG并于室温下孵育30 min。以pH值7.4 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液清洗后滴加试剂SABC，室温孵育30 min，然后滴加DAB显色液，室温下孵育30 min，双蒸水多次洗涤，经上行梯度乙醇脱水;再经二甲苯透明;中性树胶封片。室温晾干后，光学显微镜下观察、摄片。每只大鼠分别随机选取10个切片，分别计数每张切片3个视野的细胞中NGF阳性细胞表达数目，确平均值纳入统计分析。 1.2.3.4 蛋白质印迹法检测P-AKT/AKT通路及caspase-3的蛋白表达情况 收集各组细胞，充分裂解并用超声波细胞破碎仪进行破碎处理，放置样品细胞间的粘连;随即在100 ℃恒温水浴中进行蛋白变性，并用BCA法测定样品蛋白浓度，-20 ℃保存待用。将标记蛋白的masker和各组样品加样到已经装好电泳液的电泳胶槽后，进行蛋白分离电泳，随即根据目标蛋白切胶，进行转膜电泳，将电泳胶上的目标蛋白转到相对稳定不易碎的PVDF膜上，将PVDF膜放入5%脱脂奶粉的封闭液中30 min，TBST洗膜后孵育P-AKT/AKT、caspase-3和GAPDH一抗，4 ℃孵育过夜TBST洗膜后孵育各指标相应的二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜后ECL发光，在凝胶成像系统上查看各组蛋白条带及其灰度值。
1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。首先对各组数据进行正态性及方差齐性检验，若呈正态性分布且方差齐，则采用单因素方差分析（one-way ANOVA）同时选择最小显著性差异检验（Least Significant Difference，LSD）进行组间和组内的统计;若呈正态性分布且方差不齐，则采用单因素方差分析（one-way ANOVA）同时选择非参数检验（Tamhane′s T2）进行组间和组内的统计;若不满足正态性和方差齐性，采用多样本秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RSC96雪旺细胞的鉴定结果 正常培养的RSC96细胞在经免疫细胞化学方法处理后，其结果显示，对照组中的细胞胞体和轴突呈现棕色，说明RSC96雪旺细胞的特异性抗体S-100表达为阳性;而相应的阴性对照组中细胞胞体不显色，细胞核为蓝色。见图1。
2.2 消渴痹痛胶囊对高糖诱导的RSC96雪旺细胞的保护作用 对照组比较，高糖组和干预组明显RSC96雪旺细胞存活率降低（P<0.05），与高糖组比较，干预组中RSC96雪旺细胞存活率增高（P<0.05），且RSC96雪旺细胞存活率随着消渴痹痛胶囊药物浓度的升高而增加（P<0.05）。见表2。
2.3 消渴痹痛胶囊对高糖诱导的RSC96雪旺细胞中NGF蛋白表达的影响 对照组中RSC96雪旺细胞、轴突上NGF蛋白表达均呈棕色，即为阳性表达，与之比较，高糖组和干预组均减少（P<0.05），而与高糖组比较，干预组中NGF蛋白表达量增加，且随着消渴痹痛胶囊药物浓度增加（P<0.05）。见图2。
2.4 各组细胞p-AKT/t-AKT和caspase-3比值的比较 与对照组比较，高糖组和干预组中RSC96雪旺细胞p-AKT/t-AKT和caspase-3比值正高（P<0.05），而与高糖组比较，干预组中p-AKT/t-AKT和caspase-3蛋白表达下调，且随着消渴痹痛胶囊药物浓度增加而减少（P<0.05）。见表3。
3 讨论
糖尿病周围神经病变在中医学中属于“消渴痹症”，由于机体正气亏虚，内外感邪气在体内瘀滞而化热化燥，伤阴耗液，发为消渴;消渴病况日久，气血阴阳受损，其病机虚实夹杂，多见阴阳两虚，以虚为本而以邪实为标，进而痰浊瘀血，阻滞经络[7];正如叶天士所说：“病久气血推行不利，血络之中，必有瘀凝……久存脉道，络中气血阻滞不通，必猝然而痛”。消渴痹症病久伤络，故主张治疗时多将“祛瘀通络”贯穿始终，故多以“扶正祛邪通络”进行治疗[8-10]。而消渴痹痛胶囊中以黄芪为君药，益气健脾，固本之时亦能敛疮生肌;臣以桑枝祛风通络，鸡血藤补血行血，舒经活络;豨莶草和牛膝，同归肝肾经，共奏补肝肾，强筋骨之功，威灵仙祛风除湿，通络止痛，同为佐药;全蝎息风止痉，通经止痛，引诸药到肢体末端，为佐使药[11]。全方补血活血，补益肝肾以治本，化瘀通络以治标。本研究结果显示消渴痹痛胶囊干预后增加了RSC96雪旺细胞的存活率，提示消渴痹痛胶囊对高糖诱导的RSC96雪旺细胞的损伤具有保护作用。
为进一步探讨其保护机制，由于在糖尿病周围神经病变病理演变进程中，判定糖尿病周圍神经受损的重要标志是神经传导速度的异常，相应的周围神经再生也存在着缺陷。而在神经营养因子家族中，神经生长因子（NGF）是最具活力的能够营养神经的生物活性因子之一，存在于周围神经的雪旺氏细胞及神经节等部位[12]。当糖尿病周围性神经病变患者胰岛素缺乏或雪旺细胞受损均能够减少NGF合成，而NGF通过逆向轴浆运输障碍进一步引起神经营养缺乏、神经再生障碍[13-14]。有研究显示[15]，采用不同浓度NGF对RSC96大鼠雪旺细胞株进行干预，发现NGF对高糖所引起的雪旺细胞损伤和生长抑制有明显的改善作用。本研究结果显示，消渴痹痛胶囊对高糖诱导的RSC96雪旺细胞干预后可上调NGF的蛋白表达，保护受损雪旺细胞。有实验研究显示[16-18]NGF能够调控PI3K/Akt和ERK1/2以及GSK3β等3条信号转导通路，抑制由高糖诱导的RSC96雪旺细胞内ERS的过度激活，降低雪旺细胞的细胞凋亡水平，从而达到治疗糖尿病周围性神经病变的目的。本研究进一步探讨研究发现，消渴痹痛胶囊对高糖诱导的RSC96雪旺细胞干预后，降低p-AKT和caspase-3的蛋白表达水平;提示消渴痹痛胶囊可能通过抑制PI3K/AKT信号转导通路的激活，从而下调caspase-3蛋白的表达水平，抑制雪旺细胞的细胞凋亡，同时又上调NGF的表达水平，为周围神经的髓鞘细胞提供神经营养物质，从而对高糖诱导的RSC96雪旺细胞起到保护作用。
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（2019-05-31收稿 责任编辑：王明）
基金项目：国家自然科学基金项目（81070641）作者简介：张文静（1983.01—），女，硕士，主管药师，研究方向：中医药药理学研究，E-mail：zhangwenjing0123@163.com通信作者：孙亚克（1990.04—），女，本科，初级药师，研究方向：中医药药理学研究，E-mail：984453858@qq.com