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摘 要：为探究低温处理对玉米种子生长的影响，对低温5℃和10℃胁迫的玉米杂交种（郑单958）种子的各项生理生化指标进行了分析。结果表明：与对照常温相比，胁迫显著降低胚根长、芽长、胚鲜重，同时，胁迫处理增加了胚芽SOD、CAT、APX的活性，提高了胚芽的相对电导率和MDA的含量。
关键词：玉米；低温；胁迫
中图分类号 S513 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）11-17-03
黑龙江属高寒地区，早春播种、育苗常遇到低温的伤害，对其产量有极大的影响[1]。玉米是典型的低温敏感型作物，冷害对玉米的生长发育有明显的伤害，低温在一定程度上破坏细胞膜从而影响膜系统维持的生理功能。研究指出大部分植物在温度介于0～15℃时一系列生理功能被破坏，因此研究低温对玉米伤害意义重大[2]。
本试验以玉米种子（郑单958）为试验材料，对不同低温胁迫下种子的各项生理生化指标进行了研究，旨在探讨各处理下种子生长的抑制情况及细胞膜的伤害程度、抗氧化酶系统在防御活性氧对细胞伤害中的作用和差异，并为进一步研究玉米种子抗低温的生理机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料 玉米品种“郑单 958”，由河南农科院培育。
1.2 试验设计 挑选大小一致无破损的玉米种子，用1% 次氯酸钠消毒10min，蒸馏水冲洗干净，25℃浸种24h，均匀摆放在铺有3层滤纸的培养皿中（直径为9cm），每个培养皿均匀摆放20粒种子，再覆盖一层滤纸，加4mLNaCl盐处理液（0mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L）将其润湿，以正常生长条件下的玉米种子作对照（温度28℃，蒸馏水培养），低温处理为10℃和5℃，设置12个处理组合，每个处理重复6次。培养皿置于人工气候箱内，光周期为12h/12h，相对湿度为60%。每天更换处理液，并将培养皿内的滤纸用新处理液轻轻冲洗3遍，以保持试验期内每个培养皿中溶液的水势基本恒定，重新加入处理液处理3d，恢复生长3d，经过处理的种子分别用于芽期表型指标和胚芽测定各项生理指标分析。
1.3 测定方法
1.3.1 表型指标的测定 分别从每个培养皿中随机取10粒上述处理的发芽种子，测定胚鲜重、胚根及胚芽长度。
1.3.2 抗氧化酶活性的测定 称取样品0.5g左右，放入预冷的研钵中，用10mL预冷的提取缓冲液（K2HP04-KH2P04，pH7.0，1mmol/L EDTA，1% PVP，1mmol/L ASC）研磨匀浆，15 000rpm，4℃离心20min，上清液即为酶粗提液，以下各指标均采用上述酶液。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）参照Giannopolitis和Ries（1977）方法测定[3]。过氧化氢酶（Catalase，CAT）参照Aebi（1984）方法测定[4]。抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate Peroxidase，APX）参照Dalton等（1987）方法[5]，在290nm比色，测定其单位时间内吸光度的变化。
1.3.3 MDA含量的测定 参照Heath和Packer（1968）方法测定[6]，吸取上述酶提取液2mL，加2mL含0.5%硫代巴比妥酸的20%三氯乙酸溶液，混合液于沸水浴中加热15min，迅速用冰水冷却，以4 000rpm离心10min，上清液分别于450、532、600nm波长下测定光密度值。
1.3.4 浸出液电导率的测定 参照Lutts等（1996）方法并改进[7]。取1cm胚芽，用去离子水洗净，放入试管中，加10mL去离子水，25℃浸泡24h，用DDS-11 C电导仪测定各组浸液电导率A；然后将试管置于煮沸水中20min，再冷却至初始温度，测电导率B，相对电导率R=A/B×100%。
1.4 统计分析 采用Excel和SPSS17.0软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 低温处理对玉米芽期表型指标的影响 低温处理对玉米芽期表型指标的影响结果见图1，图中不同字母表示经dengken式新复极差法比较差异显著。由图1可知，在正常种子发芽温度28℃和低温10℃、5℃不同温度下，玉米种子胚根长度、芽长和鲜重均随低温胁迫程度的增加呈下降趋势。与对照相比各处理均显著抑制胚根的生长，抑制种子的芽长以及鲜重。
图1 不同处理对玉米胚根长、芽长及胚鲜重的影响
2.2 低温处理对玉米芽期膜透性的影响 由表1所示，随着胁迫程度的增加，MDA含量显著上升，其中以5℃处理最为显著，是对照值的2倍。电导率是衡量玉米植株体内细胞内容物扩散到细胞外的一项生理指标，由表1可知，5℃时相对电导率最高为44.58%，是对照ck（28℃）的2.2倍，同时也高于10℃的电导率值，且差异显著。
表1 低温处理对玉米种子膜透性的影响
[温度（℃）＼&相对电导率（%）＼&MDA（μmol/g FW）＼&28（ck）＼&20.05±0.95a＼&2.25±0.22a＼&10＼&35.25±2.12b＼&3.62±0.24b＼&5＼&44.58±2.94c＼&4.56±0.22c＼&]
2.3 低温处理对玉米芽期生理指标的影响 5℃和10℃的低温处理玉米种子，其芽期生理指标结果见表2。从表2可以看出，低温处理下玉米种子芽的SOD、CAT、APX等指标均随处理温度的降低而呈现增加的趋势，即低温5℃和10℃下种子芽酶的活性均显著高于对照28℃的活性，且5℃和10℃条件下SOD、CAT活性均差异显著。而5℃和10℃条件下玉米种子的APX活性差异不明显。 表2 低温处理对玉米种子芽期生理指标的影响（U/g FW）
[温度（℃）＼&SOD＼&APX）＼&CAT＼&28（ck）＼&22.86±1.62a＼&57.62±2.73a＼&70.45±2.17a＼&10＼&31.91±2.01b＼&68.69±0.77b＼&87.14±2.09b＼&5＼&39.30±2.55c＼&68.76±1.15b＼&104.70±2.39c＼&]
3 结论与讨论
本研究以郑单958为试验材料，模拟低温条件下种子生长、胚芽细胞膜透性以及活性氧代谢的变化进行了研究。结果表明，低温明显抑制种子生长，与对照相比，各处理均显著降低胚根长、胚芽长及胚鲜重。低温处理均导致胚芽细胞膜遭受不同程度的破坏，MDA是膜质过氧化的产物[8]，随胁迫程度的增加，MDA含量显著上升。电导率是衡量玉米植株体内细胞内容物扩散到细胞外的一项生理指标，也是衡量细胞组织的幼嫩程度和细胞质膜是否受到伤害的指标[9]，与对照相比，胁迫均不同程度地提高了胚芽的相对电导率，5℃条件下表现更为明显。
SOD是抵御活性氧自由基介导的氧化损伤的第一道防线，可通过Haber-weiss反应清除植物体内多余的超氧根阴离子（2O2·+2H+→H2O2+O2），是保护酶体系中的关键酶[10]。CAT可专一清除H2O2，但CAT定位于线粒体、过氧化物体与乙醛酸循环体中，叶绿体中H2O2的清除是通过Halliwell-Asada途径进行的，APX和GR在这一途径中起着重要作用。APX是植物AsA-GSH氧化还原途径的重要组分之一[11]。因此，CAT、APX、GPX被认为H2O2清除系统中重要的酶类[12]。与对照相比低温胁迫均不同程度地增加了胚芽SOD、CAT、APX的活性，低温胁迫对胚芽抗氧化物酶系统的影响较大，可能是由于低温导致机构受损严重，电子传递泄露严重，产生的大量活性氧不能迅速清除，进一步加剧伤害。使得叶绿体中主要负责清除H2O2的APX活性快速下降，倾向于依靠CAT来清除体内的H2O2。而关于低温冷害方面研究已经较早，具体的机制学者们正在进一步探索并揭示。
参考文献
[1]李霞，李连禄，王美云，等.玉米不同基因型对低温吸胀的响应及幼苗生长分析[J].玉米科学，2008，16（2）： 60-65.
[2]胡海军，王志斌，陈凤玉.玉米冷害生理机制研究进展[J].玉米科学，2009，17（2）： 149-152.
[3]Giannopolitis C N，Ries S K.Superoxide dismutase.I.Occurrence in higher plants[J].Plant Physiology，1998，59： 309-314.
[4]Aebi H.Catalase in vitro[J].Method Enzymol，1984，105：121-126.
[5]Dalton DA，Hanus FJ，Russell SA，Evans HJ.Purification，properties，and distribution of ascorbatepero xidase in legume root nodules[J].Plant Physiol，1987，83：789-794.
[6]Heath R L，Packer L.Photoperoxidation in isolated chloroplasts.I.Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation[J].Archives of Biochemistry and Biophysics，1968，125（1）： 189-198.
[7]S.Lutts，J.M.Kinet，J.Bouharmont. Effects of salt stress on growth，mineral nutrition and proline accumulation in relation to osmotic adjustment in rice（Oryza sativa L.）（下转82页）
cultivars differing in salinity resistance[J].Plant Growth Regulation，1996，19： 207-218.
[8]Alexieva V，Ivanov S，Sergiev I.Intreraction between stresses.Blug[J].Journal of Plant Physiology，2003：1-17.
[9]Allen D，Ort D R Impacts of chilling temperatures on photosynthesis in warm-climate plants[J].Trends Plant Science，2001，6： 36-41.
[10]周艳虹，喻景权，钱琼秋，等.低温弱光对黄瓜幼苗生长及抗氧化酶活性的影响[J].应用生态学报，2003，14（6）： 921-924.
[11]Gong M，Chen B O，Guo L.Heat-shock induced cross adaption to heat，chilling，drought and salt stress in maize seedlings and involvement of H2O2[J].Journal of Plant Physiology，2001，158（9）： 1 125-1 130.
[14]付艳，高树仁，杨克军.盐胁迫对玉米耐盐系与盐敏感系苗期几个生理生化指标的影响[J].植物生理学报，2011，47（5）： 459-462.
（责编：徐世红）
关键词：玉米；低温；胁迫
中图分类号 S513 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）11-17-03
黑龙江属高寒地区，早春播种、育苗常遇到低温的伤害，对其产量有极大的影响[1]。玉米是典型的低温敏感型作物，冷害对玉米的生长发育有明显的伤害，低温在一定程度上破坏细胞膜从而影响膜系统维持的生理功能。研究指出大部分植物在温度介于0～15℃时一系列生理功能被破坏，因此研究低温对玉米伤害意义重大[2]。
本试验以玉米种子（郑单958）为试验材料，对不同低温胁迫下种子的各项生理生化指标进行了研究，旨在探讨各处理下种子生长的抑制情况及细胞膜的伤害程度、抗氧化酶系统在防御活性氧对细胞伤害中的作用和差异，并为进一步研究玉米种子抗低温的生理机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料 玉米品种“郑单 958”，由河南农科院培育。
1.2 试验设计 挑选大小一致无破损的玉米种子，用1% 次氯酸钠消毒10min，蒸馏水冲洗干净，25℃浸种24h，均匀摆放在铺有3层滤纸的培养皿中（直径为9cm），每个培养皿均匀摆放20粒种子，再覆盖一层滤纸，加4mLNaCl盐处理液（0mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L）将其润湿，以正常生长条件下的玉米种子作对照（温度28℃，蒸馏水培养），低温处理为10℃和5℃，设置12个处理组合，每个处理重复6次。培养皿置于人工气候箱内，光周期为12h/12h，相对湿度为60%。每天更换处理液，并将培养皿内的滤纸用新处理液轻轻冲洗3遍，以保持试验期内每个培养皿中溶液的水势基本恒定，重新加入处理液处理3d，恢复生长3d，经过处理的种子分别用于芽期表型指标和胚芽测定各项生理指标分析。
1.3 测定方法
1.3.1 表型指标的测定 分别从每个培养皿中随机取10粒上述处理的发芽种子，测定胚鲜重、胚根及胚芽长度。
1.3.2 抗氧化酶活性的测定 称取样品0.5g左右，放入预冷的研钵中，用10mL预冷的提取缓冲液（K2HP04-KH2P04，pH7.0，1mmol/L EDTA，1% PVP，1mmol/L ASC）研磨匀浆，15 000rpm，4℃离心20min，上清液即为酶粗提液，以下各指标均采用上述酶液。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）参照Giannopolitis和Ries（1977）方法测定[3]。过氧化氢酶（Catalase，CAT）参照Aebi（1984）方法测定[4]。抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate Peroxidase，APX）参照Dalton等（1987）方法[5]，在290nm比色，测定其单位时间内吸光度的变化。
1.3.3 MDA含量的测定 参照Heath和Packer（1968）方法测定[6]，吸取上述酶提取液2mL，加2mL含0.5%硫代巴比妥酸的20%三氯乙酸溶液，混合液于沸水浴中加热15min，迅速用冰水冷却，以4 000rpm离心10min，上清液分别于450、532、600nm波长下测定光密度值。
1.3.4 浸出液电导率的测定 参照Lutts等（1996）方法并改进[7]。取1cm胚芽，用去离子水洗净，放入试管中，加10mL去离子水，25℃浸泡24h，用DDS-11 C电导仪测定各组浸液电导率A；然后将试管置于煮沸水中20min，再冷却至初始温度，测电导率B，相对电导率R=A/B×100%。
1.4 统计分析 采用Excel和SPSS17.0软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 低温处理对玉米芽期表型指标的影响 低温处理对玉米芽期表型指标的影响结果见图1，图中不同字母表示经dengken式新复极差法比较差异显著。由图1可知，在正常种子发芽温度28℃和低温10℃、5℃不同温度下，玉米种子胚根长度、芽长和鲜重均随低温胁迫程度的增加呈下降趋势。与对照相比各处理均显著抑制胚根的生长，抑制种子的芽长以及鲜重。
图1 不同处理对玉米胚根长、芽长及胚鲜重的影响
2.2 低温处理对玉米芽期膜透性的影响 由表1所示，随着胁迫程度的增加，MDA含量显著上升，其中以5℃处理最为显著，是对照值的2倍。电导率是衡量玉米植株体内细胞内容物扩散到细胞外的一项生理指标，由表1可知，5℃时相对电导率最高为44.58%，是对照ck（28℃）的2.2倍，同时也高于10℃的电导率值，且差异显著。
表1 低温处理对玉米种子膜透性的影响
[温度（℃）＼&相对电导率（%）＼&MDA（μmol/g FW）＼&28（ck）＼&20.05±0.95a＼&2.25±0.22a＼&10＼&35.25±2.12b＼&3.62±0.24b＼&5＼&44.58±2.94c＼&4.56±0.22c＼&]
2.3 低温处理对玉米芽期生理指标的影响 5℃和10℃的低温处理玉米种子，其芽期生理指标结果见表2。从表2可以看出，低温处理下玉米种子芽的SOD、CAT、APX等指标均随处理温度的降低而呈现增加的趋势，即低温5℃和10℃下种子芽酶的活性均显著高于对照28℃的活性，且5℃和10℃条件下SOD、CAT活性均差异显著。而5℃和10℃条件下玉米种子的APX活性差异不明显。 表2 低温处理对玉米种子芽期生理指标的影响（U/g FW）
[温度（℃）＼&SOD＼&APX）＼&CAT＼&28（ck）＼&22.86±1.62a＼&57.62±2.73a＼&70.45±2.17a＼&10＼&31.91±2.01b＼&68.69±0.77b＼&87.14±2.09b＼&5＼&39.30±2.55c＼&68.76±1.15b＼&104.70±2.39c＼&]
3 结论与讨论
本研究以郑单958为试验材料，模拟低温条件下种子生长、胚芽细胞膜透性以及活性氧代谢的变化进行了研究。结果表明，低温明显抑制种子生长，与对照相比，各处理均显著降低胚根长、胚芽长及胚鲜重。低温处理均导致胚芽细胞膜遭受不同程度的破坏，MDA是膜质过氧化的产物[8]，随胁迫程度的增加，MDA含量显著上升。电导率是衡量玉米植株体内细胞内容物扩散到细胞外的一项生理指标，也是衡量细胞组织的幼嫩程度和细胞质膜是否受到伤害的指标[9]，与对照相比，胁迫均不同程度地提高了胚芽的相对电导率，5℃条件下表现更为明显。
SOD是抵御活性氧自由基介导的氧化损伤的第一道防线，可通过Haber-weiss反应清除植物体内多余的超氧根阴离子（2O2·+2H+→H2O2+O2），是保护酶体系中的关键酶[10]。CAT可专一清除H2O2，但CAT定位于线粒体、过氧化物体与乙醛酸循环体中，叶绿体中H2O2的清除是通过Halliwell-Asada途径进行的，APX和GR在这一途径中起着重要作用。APX是植物AsA-GSH氧化还原途径的重要组分之一[11]。因此，CAT、APX、GPX被认为H2O2清除系统中重要的酶类[12]。与对照相比低温胁迫均不同程度地增加了胚芽SOD、CAT、APX的活性，低温胁迫对胚芽抗氧化物酶系统的影响较大，可能是由于低温导致机构受损严重，电子传递泄露严重，产生的大量活性氧不能迅速清除，进一步加剧伤害。使得叶绿体中主要负责清除H2O2的APX活性快速下降，倾向于依靠CAT来清除体内的H2O2。而关于低温冷害方面研究已经较早，具体的机制学者们正在进一步探索并揭示。
参考文献
[1]李霞，李连禄，王美云，等.玉米不同基因型对低温吸胀的响应及幼苗生长分析[J].玉米科学，2008，16（2）： 60-65.
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[7]S.Lutts，J.M.Kinet，J.Bouharmont. Effects of salt stress on growth，mineral nutrition and proline accumulation in relation to osmotic adjustment in rice（Oryza sativa L.）（下转82页）
cultivars differing in salinity resistance[J].Plant Growth Regulation，1996，19： 207-218.
[8]Alexieva V，Ivanov S，Sergiev I.Intreraction between stresses.Blug[J].Journal of Plant Physiology，2003：1-17.
[9]Allen D，Ort D R Impacts of chilling temperatures on photosynthesis in warm-climate plants[J].Trends Plant Science，2001，6： 36-41.
[10]周艳虹，喻景权，钱琼秋，等.低温弱光对黄瓜幼苗生长及抗氧化酶活性的影响[J].应用生态学报，2003，14（6）： 921-924.
[11]Gong M，Chen B O，Guo L.Heat-shock induced cross adaption to heat，chilling，drought and salt stress in maize seedlings and involvement of H2O2[J].Journal of Plant Physiology，2001，158（9）： 1 125-1 130.
[14]付艳，高树仁，杨克军.盐胁迫对玉米耐盐系与盐敏感系苗期几个生理生化指标的影响[J].植物生理学报，2011，47（5）： 459-462.
（责编：徐世红）