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摘要：目的：研究核桃低聚肽（walnut oligopeptides，WOPs）干预对db/db糖尿病模型小鼠血糖的影响作用。方法：选择db/db糖尿病小鼠模型，将其随机分为3个核桃低聚肽组（220、440、880mg/kg·BW）、糖尿病模型对照组、二甲双胍对照组、乳清蛋白对照组;并选用db/m小鼠作为非糖尿病小鼠空白对照。经过为期6周的干预，检测小鼠空腹血糖、餐后血糖以及糖耐量实验血糖曲线下面积。结果：核桃低聚肽（880mg/kg·BW）可降低db/db糖尿病小鼠空腹血糖水平和餐后血糖水平，同时能有效改善糖耐量（P<005）。结论：核桃低聚肽干预可有效降低糖尿病小鼠的血糖水平，改善糖耐量，具有辅助降血糖功能。
关键词：核桃低聚肽;降血糖;糖耐量;db/db糖尿病小鼠
2017年全球糖尿病相关医疗支出高达8 500亿美元[1]，防治糖尿病及其并发症已成为科学工作者研究的重点，而控制血糖水平则是重中之重。研究发现，许多植物来源的生物活性肽可具有降血糖的功效，如燕麦低聚肽、人参低聚肽和苦瓜多肽等[25]。核桃含有丰富的蛋白质以及人体所需的不饱和脂肪酸、维生素、矿物质、纤维素等。核桃中蛋白质含量最高可达到297%，有着丰富的营养价值及资源开发前景[67]。目前已有关于核桃及核桃多肽的研究显示其具有一定的降血糖作用[810]，而低聚肽具有更短小的氨基酸组成，理论上应比多肽更易吸收且活性更强，但目前尚未有关于核桃低聚肽（walnut oligopeptides，WOPs）降血糖的研究。因此，本研究探讨WOPs对血糖调节的作用。
1材料与方法
11受试物
WOPs，淡黄色固体粉末，是利用酶解技术从核桃仁中得到的小分子生物活性肽的混合物，其中相对分子质量小于1 000D的小分子低聚肽占875%。
12实验动物
选择12周龄SPF级雄性db/db型糖尿病小鼠（空腹血糖水平≥111mmol/L）48只及与之周龄、性别匹配的非糖尿病健康同窝出生仔畜db/m小鼠（lepr/m）10只。db/db小鼠及正常健康小鼠db/m均由常州卡文斯实验动物有限公司提供。动物饲养在北京大学医学部实验动物科学部，动物实验环境设施（屏障环境）合格证书：医动字第 012055。动物分笼饲养，每笼2只，均给予普通饲料，饲养环境符合屏障环境，温度为（25±1）℃，相对湿度为50%～60%RH，室内照明控制在12 h/12 h光暗周期节律。动物喂养及实验操作严格按照《北京市实验动物管理条例》执行，动物合格证号：SCXK（京）2016—0010。
13主要试剂和仪器
葡萄糖，纯度：998%，北京金汇太亚化学试剂有限公司;浓缩乳清蛋白Lacprodan 80，纯度：792%，北京中柏创业化工产品有限公司;格华止盐酸二甲双胍片国药准字H20023370，中美上海施贵宝制药有限公司;三诺安稳血糖试条，三诺生物传感股份有限公司;三诺安稳血糖仪，长沙三诺生物传感技术有限公司。
14分组、剂量及干预方式
将48只db/db小鼠按空腹血糖水平随机分为6组：1个模型对照组、1个阳性对照组（220 mg/kg·BW盐酸二甲双胍肠溶片水溶液）、1个乳清蛋白对照组（440mg/kg·BW乳清蛋白水溶液）和3个核桃低聚肽剂量组（220、440、880 mg/kg·BW），每组8只。10只db/m小鼠作为空白对照组。各组干预方式均为每日经口灌胃，持续6周，实验期间动物自由进食、饮水。分组及干预剂量见表1。
15检测指标及方法
151一般情况每日观察各组小鼠状态，定期记录摄食和体重等情况。
152血糖及口服糖耐量实验于干预第2周、第4周和第6周时禁食5h后取小鼠尾静脉血，用微量血糖仪检测空腹血糖。于干预第6周时进行口服糖耐量实验，具体操作方法为：小鼠禁食6h 后，给予004mL/kg 50%葡萄糖溶液灌胃，于灌胃后第0、05、1、2h 取尾静脉血测其血糖水平记录并计算血糖曲线下面积（area under the curve，AUC）。根据近似梯形面积公式计算，AUC=（0h血糖+05h血糖）×05h/2+（05h血糖+1h血糖）× 05h/2+（1h血糖+2h血糖）× 1h/2。
16数据处理与统计分析
正态分布数据以均数±标准差（±s）表示，非正态分布数据采用中位数（四分位间距）表示。采用SPSS 240软件进行单因素方差分析或独立样本非参数检验，以P<005表示差异有统计学意义。
2结果与分析
21一般情况
在干预期间，空白对照组小鼠（db/m）毛色黑亮有光泽，精神状态良好。模型对照组皮毛松散，体表潮湿，精神状态较差，活动量明显少于空白对照组。而WOPs干预后的小鼠毛色及精神状况逐渐有所好转，活动量有所增加，干预时期内极少出现感染症状（如尿道感染等）。干预期间，各糖尿病组（db/db）小鼠体重及摄食量均高于空白对照组（db/m）小鼠（图1），这与2型糖尿病“三多”症状相吻合，但糖尿病小鼠各组间差异无统计学意义。
22WOPs对糖尿病小鼠空腹血糖的影响
干预前，空白对照组小鼠空腹血糖均值为754mmol/L，而db/db 2型糖尿病模型小鼠空腹血糖值均大于111mmol/L，符合2型糖尿病的標准，在干预期间，模型对照组小鼠空腹血糖也并无明显变化，这说明该试验所采用的db/db 2型糖尿病模型小鼠血糖较为稳定，符合后续研究的需要。由图2可见，干预期间db/db糖尿病小鼠空腹血糖均明显高于正常组小鼠，具有统计学差异（P<005）;而相比模型对照组小鼠，WOPs干预的3组小鼠空腹血糖均有所降低，特别是WOPsHG组小鼠空腹血糖的降低具有统计学意义（P<005）。从数值上来看，干预2、4、6周时WOPsHG组小鼠空腹血糖较模型对照组血糖下降率分别为294%、401%、350%，说明WOPs对糖尿病小鼠有较好的降低空腹血糖作用。 23WOPs对糖尿病小鼠餐后血糖及血糖曲线下面积的影响
干预后（6周）进行糖耐量实验，以给予葡萄糖后2h的血糖值作为餐后血糖指标;同时通过糖耐量实验得到的给予葡萄糖后0、05、1、2h的血糖值计算曲线下面积（表2）。空白对照组及WOPsHG组餐后血糖及血糖曲线下面積均显著低于糖尿病模型对照组，差异有统计学意义（P<005）;阳性对照组的血糖曲线下面积也显著低于糖尿病模型对照组（P<005）。
3讨论
研究WOPs的血糖调节作用首先需要依赖于糖尿病动物模型。目前国内外主要使用的糖尿病模型动物主要分为自发性模型动物、转基因模型动物和诱发性模型动物等。在诸多动物模型中，db/db小鼠是属于自发性模型动物中比较优质的用来研究2型糖尿病的模型小鼠，价格也比较昂贵，它是由C57BL/KsJ近亲交配株常染色体隐性遗传衍化而来。纯合的自发突变小鼠在3～4周龄时产生可以辨认的肥胖表型;出生后10～14d，血浆胰岛素和血糖开始升高，并出现多饮、多食、多尿的“三多”症状，其存活寿命为10个月左右。db/db小鼠的糖尿病发生发展近似人类糖尿病病理改变过程，适合用于外物干预下的糖尿病降糖作用研究，模型持续时间长，可为后续的研究奠定稳固的基础[11]。
糖尿病患者糖调节受损（IGR）可分为两种状态，即空腹血糖受损（IFG）和糖耐量受损（IGT）[12]。控制空腹血糖的平稳降低对于防治糖尿病及其并发症有着重要的意义，本研究发现，最高剂量WOPs干预后的小鼠空腹血糖显著低于模型对照组，说明WOPs可以有效降低空腹血糖;同时鉴于WOPsHG组血糖也低于阳性对照组和乳清蛋白对照组，由此对比说明此剂量下的降糖作用与额外添加的氨基酸无关，体现出了生物活性肽比蛋白质具有更强的功能优势。而针对IGT，本研究关注了WOPs干预后的小鼠餐后血糖和血糖曲线下面积变化，发现WOPsHG组餐后血糖显著低于模型对照组及乳清蛋白对照组，鉴于餐后血糖反映的是机体糖负荷后的耐受，此结果也说明了WOPs干预可以有效改善胰岛β细胞的储备功能。血糖曲线下面积也是一种反映血糖水平的指标，相较于单点的血糖值，血糖曲线下面积能更全面地分析血糖变化的时间和程度，体现了动态波动的情况。而从结果来看，WOPsHG组的曲线下面积显著低于糖尿病模型组，说明WOPs可以有效控制短时间内的血糖波动，促进血糖快速回归较低水平。虽然结果中WOPsHG组血糖曲线下面积低于阳性药物对照组，但数值上较为接近，仍可以说明WOPs的干预对于改善IGT具有重要的作用。
近年来研究发现，越来越多的生物活性肽都具有降血糖的作用[23，1314]，并且低聚肽比蛋白质和多肽更易消化，吸收速度甚至高于氨基酸，耗能低，可减轻肾脏代谢负担，具有独特的生理功能和理化性质，这是蛋白质或氨基酸所不具备的，且低聚肽分子量越小其功能特性越明显。本研究已经证明了WOPs具有辅助降血糖作用，具有重要的科学意义和临床应用价值，但目前有关WOPs对于血糖影响的机制研究暂无，通过本研究得到的结果以及前人关于核桃蛋白及核桃多肽降血糖的研究，推测WOPs的降血糖机制可能与抑制α葡萄糖苷酶、提高葡萄糖消耗能力等机制有关[89]，需要今后开展更深入的探究讨论其降糖机制。
4结论
本研究以db/db小鼠为糖尿病模型小鼠，设立不同剂量的WOPs干预组和多种对照组，探讨WOPs对糖尿病小鼠的血糖调节作用。结果显示，WOPs具有降低糖尿病小鼠空腹血糖、餐后血糖及血糖曲线下面积的作用，这对于降低糖尿病患者血糖以及防治糖尿病有着重要意义。◇
参考文献
[1]Cho N H，Shaw J E，Karuranga S，et alIDF diabetes atlas：global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045[J].Diabetes Research and Clinical Practice，2018，138：271281
[2]李勇生物活性肽研究现况和进展[J].食品与发酵工业，2007（1）：39
[3]刘欣然，刘思奇，侯超，等燕麦低聚肽对糖尿病大鼠血糖的影响[J].中国食物与营养，2018，24（4）：4650
[4]盛清凯，姚惠源苦瓜多肽P的分离及其降糖活性[J].无锡轻工大学学报（食品与生物技术），2005（1）：4951
[5]Xu M，Sun B，Li D，et alBeneficial effects of small molecule oligopeptides isolated from panax ginseng meyer on pancreatic betacell dysfunction and death in diabetic rats[J].Nutrients，2017，9（10）：1061
[6]孙树杰，王兆华，宋康，等核桃营养价值及功能活性研究进展[J].中国食物与营养，2013，19（5）：7274
[7]李照，孙磊，高飞，等核桃仁营养成分及活性研究进展[J].药物生物技术，2016，23（5）：467470
[8]李丽，黄雪梦，杨璐嘉，等采用2种降糖模型考察核桃蛋白及多肽的降糖作用[J].食品科技，2017，42（4）：218221
[9]杜侃莹核桃多肽降血糖功能效果研究[D].长春：吉林农业大学，2017
[10]Pan A，Sun Q，Manson J E，et alWalnut consumption is associated with lower risk of type 2 diabetes in women[J].Journal of Nutrition，2013，143（4）：512518
[11]朱超，朱莹莹2型糖尿病动物模型的构建[J].中国实验动物学报，2013，21（2）：8488
[12]Yoon U，Kwok L L，Magkidis AEfficacy of lifestyle interventions in reducing diabetes incidence in patients with impaired glucose tolerance：A systematic review of randomized controlled trials[J].Metabolismclinical and Experimental，2013，62（2）：303314
[13]王莹，徐秀林，朱乃硕生物活性肽降血糖功能的研究进展[J].食品科学2012，33（9）：341344
[14]Patil P，Mandal S，Tomar S K，et alFood proteinderived bioactive peptides in management of type 2 diabetes[J].European Journal of Nutrition，2015，54（6）：863880
关键词：核桃低聚肽;降血糖;糖耐量;db/db糖尿病小鼠
2017年全球糖尿病相关医疗支出高达8 500亿美元[1]，防治糖尿病及其并发症已成为科学工作者研究的重点，而控制血糖水平则是重中之重。研究发现，许多植物来源的生物活性肽可具有降血糖的功效，如燕麦低聚肽、人参低聚肽和苦瓜多肽等[25]。核桃含有丰富的蛋白质以及人体所需的不饱和脂肪酸、维生素、矿物质、纤维素等。核桃中蛋白质含量最高可达到297%，有着丰富的营养价值及资源开发前景[67]。目前已有关于核桃及核桃多肽的研究显示其具有一定的降血糖作用[810]，而低聚肽具有更短小的氨基酸组成，理论上应比多肽更易吸收且活性更强，但目前尚未有关于核桃低聚肽（walnut oligopeptides，WOPs）降血糖的研究。因此，本研究探讨WOPs对血糖调节的作用。
1材料与方法
11受试物
WOPs，淡黄色固体粉末，是利用酶解技术从核桃仁中得到的小分子生物活性肽的混合物，其中相对分子质量小于1 000D的小分子低聚肽占875%。
12实验动物
选择12周龄SPF级雄性db/db型糖尿病小鼠（空腹血糖水平≥111mmol/L）48只及与之周龄、性别匹配的非糖尿病健康同窝出生仔畜db/m小鼠（lepr/m）10只。db/db小鼠及正常健康小鼠db/m均由常州卡文斯实验动物有限公司提供。动物饲养在北京大学医学部实验动物科学部，动物实验环境设施（屏障环境）合格证书：医动字第 012055。动物分笼饲养，每笼2只，均给予普通饲料，饲养环境符合屏障环境，温度为（25±1）℃，相对湿度为50%～60%RH，室内照明控制在12 h/12 h光暗周期节律。动物喂养及实验操作严格按照《北京市实验动物管理条例》执行，动物合格证号：SCXK（京）2016—0010。
13主要试剂和仪器
葡萄糖，纯度：998%，北京金汇太亚化学试剂有限公司;浓缩乳清蛋白Lacprodan 80，纯度：792%，北京中柏创业化工产品有限公司;格华止盐酸二甲双胍片国药准字H20023370，中美上海施贵宝制药有限公司;三诺安稳血糖试条，三诺生物传感股份有限公司;三诺安稳血糖仪，长沙三诺生物传感技术有限公司。
14分组、剂量及干预方式
将48只db/db小鼠按空腹血糖水平随机分为6组：1个模型对照组、1个阳性对照组（220 mg/kg·BW盐酸二甲双胍肠溶片水溶液）、1个乳清蛋白对照组（440mg/kg·BW乳清蛋白水溶液）和3个核桃低聚肽剂量组（220、440、880 mg/kg·BW），每组8只。10只db/m小鼠作为空白对照组。各组干预方式均为每日经口灌胃，持续6周，实验期间动物自由进食、饮水。分组及干预剂量见表1。
15检测指标及方法
151一般情况每日观察各组小鼠状态，定期记录摄食和体重等情况。
152血糖及口服糖耐量实验于干预第2周、第4周和第6周时禁食5h后取小鼠尾静脉血，用微量血糖仪检测空腹血糖。于干预第6周时进行口服糖耐量实验，具体操作方法为：小鼠禁食6h 后，给予004mL/kg 50%葡萄糖溶液灌胃，于灌胃后第0、05、1、2h 取尾静脉血测其血糖水平记录并计算血糖曲线下面积（area under the curve，AUC）。根据近似梯形面积公式计算，AUC=（0h血糖+05h血糖）×05h/2+（05h血糖+1h血糖）× 05h/2+（1h血糖+2h血糖）× 1h/2。
16数据处理与统计分析
正态分布数据以均数±标准差（±s）表示，非正态分布数据采用中位数（四分位间距）表示。采用SPSS 240软件进行单因素方差分析或独立样本非参数检验，以P<005表示差异有统计学意义。
2结果与分析
21一般情况
在干预期间，空白对照组小鼠（db/m）毛色黑亮有光泽，精神状态良好。模型对照组皮毛松散，体表潮湿，精神状态较差，活动量明显少于空白对照组。而WOPs干预后的小鼠毛色及精神状况逐渐有所好转，活动量有所增加，干预时期内极少出现感染症状（如尿道感染等）。干预期间，各糖尿病组（db/db）小鼠体重及摄食量均高于空白对照组（db/m）小鼠（图1），这与2型糖尿病“三多”症状相吻合，但糖尿病小鼠各组间差异无统计学意义。
22WOPs对糖尿病小鼠空腹血糖的影响
干预前，空白对照组小鼠空腹血糖均值为754mmol/L，而db/db 2型糖尿病模型小鼠空腹血糖值均大于111mmol/L，符合2型糖尿病的標准，在干预期间，模型对照组小鼠空腹血糖也并无明显变化，这说明该试验所采用的db/db 2型糖尿病模型小鼠血糖较为稳定，符合后续研究的需要。由图2可见，干预期间db/db糖尿病小鼠空腹血糖均明显高于正常组小鼠，具有统计学差异（P<005）;而相比模型对照组小鼠，WOPs干预的3组小鼠空腹血糖均有所降低，特别是WOPsHG组小鼠空腹血糖的降低具有统计学意义（P<005）。从数值上来看，干预2、4、6周时WOPsHG组小鼠空腹血糖较模型对照组血糖下降率分别为294%、401%、350%，说明WOPs对糖尿病小鼠有较好的降低空腹血糖作用。 23WOPs对糖尿病小鼠餐后血糖及血糖曲线下面积的影响
干预后（6周）进行糖耐量实验，以给予葡萄糖后2h的血糖值作为餐后血糖指标;同时通过糖耐量实验得到的给予葡萄糖后0、05、1、2h的血糖值计算曲线下面积（表2）。空白对照组及WOPsHG组餐后血糖及血糖曲线下面積均显著低于糖尿病模型对照组，差异有统计学意义（P<005）;阳性对照组的血糖曲线下面积也显著低于糖尿病模型对照组（P<005）。
3讨论
研究WOPs的血糖调节作用首先需要依赖于糖尿病动物模型。目前国内外主要使用的糖尿病模型动物主要分为自发性模型动物、转基因模型动物和诱发性模型动物等。在诸多动物模型中，db/db小鼠是属于自发性模型动物中比较优质的用来研究2型糖尿病的模型小鼠，价格也比较昂贵，它是由C57BL/KsJ近亲交配株常染色体隐性遗传衍化而来。纯合的自发突变小鼠在3～4周龄时产生可以辨认的肥胖表型;出生后10～14d，血浆胰岛素和血糖开始升高，并出现多饮、多食、多尿的“三多”症状，其存活寿命为10个月左右。db/db小鼠的糖尿病发生发展近似人类糖尿病病理改变过程，适合用于外物干预下的糖尿病降糖作用研究，模型持续时间长，可为后续的研究奠定稳固的基础[11]。
糖尿病患者糖调节受损（IGR）可分为两种状态，即空腹血糖受损（IFG）和糖耐量受损（IGT）[12]。控制空腹血糖的平稳降低对于防治糖尿病及其并发症有着重要的意义，本研究发现，最高剂量WOPs干预后的小鼠空腹血糖显著低于模型对照组，说明WOPs可以有效降低空腹血糖;同时鉴于WOPsHG组血糖也低于阳性对照组和乳清蛋白对照组，由此对比说明此剂量下的降糖作用与额外添加的氨基酸无关，体现出了生物活性肽比蛋白质具有更强的功能优势。而针对IGT，本研究关注了WOPs干预后的小鼠餐后血糖和血糖曲线下面积变化，发现WOPsHG组餐后血糖显著低于模型对照组及乳清蛋白对照组，鉴于餐后血糖反映的是机体糖负荷后的耐受，此结果也说明了WOPs干预可以有效改善胰岛β细胞的储备功能。血糖曲线下面积也是一种反映血糖水平的指标，相较于单点的血糖值，血糖曲线下面积能更全面地分析血糖变化的时间和程度，体现了动态波动的情况。而从结果来看，WOPsHG组的曲线下面积显著低于糖尿病模型组，说明WOPs可以有效控制短时间内的血糖波动，促进血糖快速回归较低水平。虽然结果中WOPsHG组血糖曲线下面积低于阳性药物对照组，但数值上较为接近，仍可以说明WOPs的干预对于改善IGT具有重要的作用。
近年来研究发现，越来越多的生物活性肽都具有降血糖的作用[23，1314]，并且低聚肽比蛋白质和多肽更易消化，吸收速度甚至高于氨基酸，耗能低，可减轻肾脏代谢负担，具有独特的生理功能和理化性质，这是蛋白质或氨基酸所不具备的，且低聚肽分子量越小其功能特性越明显。本研究已经证明了WOPs具有辅助降血糖作用，具有重要的科学意义和临床应用价值，但目前有关WOPs对于血糖影响的机制研究暂无，通过本研究得到的结果以及前人关于核桃蛋白及核桃多肽降血糖的研究，推测WOPs的降血糖机制可能与抑制α葡萄糖苷酶、提高葡萄糖消耗能力等机制有关[89]，需要今后开展更深入的探究讨论其降糖机制。
4结论
本研究以db/db小鼠为糖尿病模型小鼠，设立不同剂量的WOPs干预组和多种对照组，探讨WOPs对糖尿病小鼠的血糖调节作用。结果显示，WOPs具有降低糖尿病小鼠空腹血糖、餐后血糖及血糖曲线下面积的作用，这对于降低糖尿病患者血糖以及防治糖尿病有着重要意义。◇
参考文献
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