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摘 要：本文采用酶解法对核桃青皮多酚进行提取，研究了不同酶添加量、酶解温度、酶解时间、酶解pH对核桃青皮多酚提取的最佳提取条件及其抗油脂酸败的作用。结果表明，核桃青皮多酚的最佳提取温度为60 ℃、最佳提取时间为
120 min、最佳提取酶浓度为30 U/mL、最佳提取pH为5.5。核桃青皮对抑制油脂酸败有一定的积极作用。
关键词：核桃青皮;多酚;油脂;抗氧化
我国是全世界核桃产量最大的国家，截止2015年，占世界总量的51.49%[1]。核桃青皮别名青龙衣，是核桃外部没有食用价值的一层很厚的果皮。作为核桃的副产物，核桃青皮长期以来被大量随意丢弃在田间地头，不仅非常不美观，还会造成极大的环境污染[2-3]。植物的各个部位都含有丰富的果胶和纤维素，在提取植物多酚时，这些纤维素和果胶会限制多酚的溢出，影响多酚的提取效率。很多研究者采用酶对果胶和纤维素进行酶解，增加植物多酚的提取得率[4]。
油脂是人体所必需的3种营养物质之一，是人体最主要的储能物质，其参与人体的各项生理活动。油脂氧化是指油脂受到酶、微生物、空气等外界因素影响，或是自发性的将油脂氧化成氧化物质的过程[6]。这些物质中通常含有大量的醛类、酮类物质，其使油脂散发出酸臭的气味，所以油脂的氧化又通常被称为油脂酸败。已有研究表明，多酚类物质可以与油脂中游离的氢原子相结合，抑制油脂腐败菌，能够达到延缓油脂氧化酸败的效果[7]。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
将市场上购买的核桃青皮晒干粉碎后过40目筛。
纤维素酶（成都科隆化学品有限公司）;果胶酶（成都科隆化学品有限公司）;碳酸钠（成都科隆化学品有限公司）;无水乙醇（成都科隆化学品有限公司）;没食子酸标液（成都科隆化学品有限公司）;福林酚标液（成都科隆化学品有限公司）。
旋转蒸发仪（郑州亚荣生仪器厂）;紫外光度仪（成都双嘉仪器有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 没食子酸标准曲线的建立
（1）称取没食子酸标品，分别将没食子酸溶液加入无水乙醇，容量瓶中配比成0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL、0.06 mg/mL和0.07 mg/mL的沒食子酸溶液。
（2）称取福林酚溶液标品1 mL，加入无水乙醇9 mL，在容量瓶中配比成10%的福林酚溶液。
（3）称取各阶梯浓度没食子酸1 mL，加入10%福林酚溶液5 mL，再加入碳酸钠溶液4 mL，混合后摇匀，静置
40 min后，在紫外光度仪中观察在765 mm的吸光度，以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.2 核桃青皮多酚得率的计算方法
核桃青皮多酚的得率计算采用福林酚法。将酶解后的核桃青皮多酚残液抽滤后，加入无水乙醇50 mL，充分混合后，用旋转蒸发仪除去多余液体，再用紫外光度计测量余液在765 mm处吸光度确定余液浓度，进行计算。核桃青皮多酚得率的计算如下：
其中：Y为核桃青皮多酚的得率，mg/g;C为根据福林酚法测定的样液的浓度，mg/mL;V为余液的体积，mL。
1.3 单因素试验
1.3.1 酶添加量对核桃青皮多酚得率的影响
称取核桃青皮粉末5 g，与果胶酶∶纤维素（1∶1）混合，其中设置酶浓度梯度为10 U/mL、20 U/mL、30 U/mL、40 U/mL和50 U/mL的溶液50 mL，在50 ℃进行酶解100 min后，再加入无水乙醇50 mL，充分混合后进行抽滤，得到的混合溶液进行旋转蒸发除去多余液体，采用沈碧寒等人[5]的福林酚法，测量多酚得率。
1.3.2 酶解温度对核桃青皮多酚得率的影响
提取条件同1.3.1，提取温度设置为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃，研究酶解温度对核桃青皮多酚得率的影响。
1.3.3 酶解时间对核桃青皮多酚得率的影响
提取条件同1.3.1，将提取时间设置为60 min、80 min、100 min、120 min和140 min，研究提取时间对核桃青皮多酚得率的影响。
1.3.4 酶解pH对核桃青皮多酚得率的影响
其他提取条件同1.3.1，将酶解的pH设置为4、4.5、5、5.5和6，研究酶解pH对核桃青皮多酚得率的影响。
1.4 核桃青皮多酚对油脂酸败的影响。
1.4.1 核桃青皮多酚对猪油储存过程中过氧化值的影响
取提取得到的核桃青皮多酚0.1 mg，加入猪油中混合均匀，并设置空白对照组，为了加速猪油酸败，将猪油置于37 ℃恒温箱中保存，观察猪油在第5 d、10 d、15 d、20 d和25 d的过氧化值的变化。
1.4.2 核桃青皮多酚对猪油储存过程中酸值的影响
取提取得到的核桃青皮多酚0.1 mg，加入猪油中混合均匀，并设置空白对照组，为了加速猪油酸败，将猪油置于37 ℃恒温箱中保存，观察猪油在第5 d、10 d、15 d、20 d和25 d的酸值的变化。
2 结果与分析
2.1 没食子酸标准曲线的建立
没食子酸标准曲线的建立见图1。
图1 没食子酸标准曲线
2.2 酶添加量对核桃青皮多酚得率的影响
由图2可知，在10～30 U/mL的酶浓度范围内，多酚得率随着酶添加量的增加，具有良好的线性关系。在酶添加量为30 U/mL时，多酚的酶解效果达到最好，后随着酶添加量的增加多酚得率显著降低，这可能是随着酶添加量的增加，过多的酶之间产生拮抗作用，抑制果胶与纤维素的分解。 图2 酶添加量对核桃青皮多酚得率的影响
2.3 酶解温度对核桃青皮多酚得率的影响
如图3所示，多酚得率随着酶解温度升高而增加，在酶解温度达到60 ℃时，多酚得率达到最大。这可能是因为双酶活性的最佳酶解温度为60 ℃，在60 ℃后，随着酶解温度的增加，酶活性降低，导致多酚得率降低。
图3 酶解温度对核桃青皮多酚得率的影响
2.4 酶解时间对核桃青皮多酚得率的影响
如图4所示，核桃青皮多酚余液在酶解时间120 min时，多酚得率达到最大，这可能是当酶解时间小于120 min时，酶解不完全，随着酶解时间的增加，纤维素与果胶逐渐溶解，释放更多的核桃青皮多酚，在120 min以后，由于部分多酚氧化，使多酚得率降低。
图4 酶解时间对核桃青皮多酚得率的影响
2.5 酶解pH对核桃青皮多酚得率的影响
由图5可知，当pH达到5.5时，多酚得率达到最大，这可能是因为在此pH时，果胶酶和纤维素酶的活性最高。当pH高过5.5时，可能因为酶活性随着pH的继续增高而活性降低，核桃青皮多酚得率逐渐降低。
2.6 核桃青皮多酚对猪油储存过程中过氧化值的影响
由图6可知，在猪油储存过程中，核桃青皮多酚添加组与未添加组相比较，前者猪油的过氧化值明显降低，并且当猪油储存时间在15 d时，油脂氧化速度明显减缓，对油脂的氧化酸败有较好效果。
图5 酶解pH对核桃青皮多酚得率的影响
图6 核桃青皮多酚对大豆储藏过程中过氧化值的影响
2.7 核桃青皮多酚对猪油储存过程中酸值的影响
如图7所示，添加核桃青皮多酚组对比未添加组，前者猪油酸值明显降低，在猪油储存20 d时，猪油酸值增加速率明显降低，对抑制猪油酸败有明显效果。
3 結论
本文探究了酶解核桃青皮多酚提取的最佳外界条件，并将核桃青皮多酚添加进猪油中，经试验后发现，核桃青皮多酚的最佳提取温度为60 ℃、最佳提取时间为120 min、
最佳提取酶浓度为30 U/mL、最佳提取pH为5.5。核桃青皮多酚对猪油储存具有良好的抑制酸败的效果，为作为农业垃圾丢弃的核桃青皮多酚提供了一条新的资源化利
用方式。
参考文献
[1]傅本重，邹路路，朱洁倩，等.中国核桃生产现状与发展思路[J].江苏农业科学，2018，46（18）：5-8.
[2]娄丽，杨霞，朱佳敏.核桃青皮主要活性物质及提取工艺研究进展[J].贵州科学，2020，38（2）：17-20.
[3]左瑞庭，王西彬.胡桃醌对类风湿关节炎关节成纤维样滑膜细胞增殖和凋亡的影响[J].中成药，2019，41（10）：2334-2339.
[4]刘昕皓，魏粉菊，王学顺，等.多酚类化合物的生物活性研究进展[J].中国医药工业杂志，2021，52（4）：471-483.
[5]沈碧寒，陈嘉颖，李治康，等.响应面法优化核桃青皮多酚提取工艺及其自由基清除活力的研究[J].粮食与油脂，2020，33（10）：117-120.
[6]谷利伟，翁新楚.食用天然抗氧化剂研究进展[J].中国油脂，1997，22（3）：37-40.
[7]GIOVANNA CV，JOSHUA S，JULI?N V，et al.Insights from combining techno-economic and life cycle assessment–a case study of polyphenol extraction from red wine pomace[J].Resources，Conservation and Recycling，2021，167：105318.
120 min、最佳提取酶浓度为30 U/mL、最佳提取pH为5.5。核桃青皮对抑制油脂酸败有一定的积极作用。
关键词：核桃青皮;多酚;油脂;抗氧化
我国是全世界核桃产量最大的国家，截止2015年，占世界总量的51.49%[1]。核桃青皮别名青龙衣，是核桃外部没有食用价值的一层很厚的果皮。作为核桃的副产物，核桃青皮长期以来被大量随意丢弃在田间地头，不仅非常不美观，还会造成极大的环境污染[2-3]。植物的各个部位都含有丰富的果胶和纤维素，在提取植物多酚时，这些纤维素和果胶会限制多酚的溢出，影响多酚的提取效率。很多研究者采用酶对果胶和纤维素进行酶解，增加植物多酚的提取得率[4]。
油脂是人体所必需的3种营养物质之一，是人体最主要的储能物质，其参与人体的各项生理活动。油脂氧化是指油脂受到酶、微生物、空气等外界因素影响，或是自发性的将油脂氧化成氧化物质的过程[6]。这些物质中通常含有大量的醛类、酮类物质，其使油脂散发出酸臭的气味，所以油脂的氧化又通常被称为油脂酸败。已有研究表明，多酚类物质可以与油脂中游离的氢原子相结合，抑制油脂腐败菌，能够达到延缓油脂氧化酸败的效果[7]。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
将市场上购买的核桃青皮晒干粉碎后过40目筛。
纤维素酶（成都科隆化学品有限公司）;果胶酶（成都科隆化学品有限公司）;碳酸钠（成都科隆化学品有限公司）;无水乙醇（成都科隆化学品有限公司）;没食子酸标液（成都科隆化学品有限公司）;福林酚标液（成都科隆化学品有限公司）。
旋转蒸发仪（郑州亚荣生仪器厂）;紫外光度仪（成都双嘉仪器有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 没食子酸标准曲线的建立
（1）称取没食子酸标品，分别将没食子酸溶液加入无水乙醇，容量瓶中配比成0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL、0.06 mg/mL和0.07 mg/mL的沒食子酸溶液。
（2）称取福林酚溶液标品1 mL，加入无水乙醇9 mL，在容量瓶中配比成10%的福林酚溶液。
（3）称取各阶梯浓度没食子酸1 mL，加入10%福林酚溶液5 mL，再加入碳酸钠溶液4 mL，混合后摇匀，静置
40 min后，在紫外光度仪中观察在765 mm的吸光度，以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.2 核桃青皮多酚得率的计算方法
核桃青皮多酚的得率计算采用福林酚法。将酶解后的核桃青皮多酚残液抽滤后，加入无水乙醇50 mL，充分混合后，用旋转蒸发仪除去多余液体，再用紫外光度计测量余液在765 mm处吸光度确定余液浓度，进行计算。核桃青皮多酚得率的计算如下：
其中：Y为核桃青皮多酚的得率，mg/g;C为根据福林酚法测定的样液的浓度，mg/mL;V为余液的体积，mL。
1.3 单因素试验
1.3.1 酶添加量对核桃青皮多酚得率的影响
称取核桃青皮粉末5 g，与果胶酶∶纤维素（1∶1）混合，其中设置酶浓度梯度为10 U/mL、20 U/mL、30 U/mL、40 U/mL和50 U/mL的溶液50 mL，在50 ℃进行酶解100 min后，再加入无水乙醇50 mL，充分混合后进行抽滤，得到的混合溶液进行旋转蒸发除去多余液体，采用沈碧寒等人[5]的福林酚法，测量多酚得率。
1.3.2 酶解温度对核桃青皮多酚得率的影响
提取条件同1.3.1，提取温度设置为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃，研究酶解温度对核桃青皮多酚得率的影响。
1.3.3 酶解时间对核桃青皮多酚得率的影响
提取条件同1.3.1，将提取时间设置为60 min、80 min、100 min、120 min和140 min，研究提取时间对核桃青皮多酚得率的影响。
1.3.4 酶解pH对核桃青皮多酚得率的影响
其他提取条件同1.3.1，将酶解的pH设置为4、4.5、5、5.5和6，研究酶解pH对核桃青皮多酚得率的影响。
1.4 核桃青皮多酚对油脂酸败的影响。
1.4.1 核桃青皮多酚对猪油储存过程中过氧化值的影响
取提取得到的核桃青皮多酚0.1 mg，加入猪油中混合均匀，并设置空白对照组，为了加速猪油酸败，将猪油置于37 ℃恒温箱中保存，观察猪油在第5 d、10 d、15 d、20 d和25 d的过氧化值的变化。
1.4.2 核桃青皮多酚对猪油储存过程中酸值的影响
取提取得到的核桃青皮多酚0.1 mg，加入猪油中混合均匀，并设置空白对照组，为了加速猪油酸败，将猪油置于37 ℃恒温箱中保存，观察猪油在第5 d、10 d、15 d、20 d和25 d的酸值的变化。
2 结果与分析
2.1 没食子酸标准曲线的建立
没食子酸标准曲线的建立见图1。
图1 没食子酸标准曲线
2.2 酶添加量对核桃青皮多酚得率的影响
由图2可知，在10～30 U/mL的酶浓度范围内，多酚得率随着酶添加量的增加，具有良好的线性关系。在酶添加量为30 U/mL时，多酚的酶解效果达到最好，后随着酶添加量的增加多酚得率显著降低，这可能是随着酶添加量的增加，过多的酶之间产生拮抗作用，抑制果胶与纤维素的分解。 图2 酶添加量对核桃青皮多酚得率的影响
2.3 酶解温度对核桃青皮多酚得率的影响
如图3所示，多酚得率随着酶解温度升高而增加，在酶解温度达到60 ℃时，多酚得率达到最大。这可能是因为双酶活性的最佳酶解温度为60 ℃，在60 ℃后，随着酶解温度的增加，酶活性降低，导致多酚得率降低。
图3 酶解温度对核桃青皮多酚得率的影响
2.4 酶解时间对核桃青皮多酚得率的影响
如图4所示，核桃青皮多酚余液在酶解时间120 min时，多酚得率达到最大，这可能是当酶解时间小于120 min时，酶解不完全，随着酶解时间的增加，纤维素与果胶逐渐溶解，释放更多的核桃青皮多酚，在120 min以后，由于部分多酚氧化，使多酚得率降低。
图4 酶解时间对核桃青皮多酚得率的影响
2.5 酶解pH对核桃青皮多酚得率的影响
由图5可知，当pH达到5.5时，多酚得率达到最大，这可能是因为在此pH时，果胶酶和纤维素酶的活性最高。当pH高过5.5时，可能因为酶活性随着pH的继续增高而活性降低，核桃青皮多酚得率逐渐降低。
2.6 核桃青皮多酚对猪油储存过程中过氧化值的影响
由图6可知，在猪油储存过程中，核桃青皮多酚添加组与未添加组相比较，前者猪油的过氧化值明显降低，并且当猪油储存时间在15 d时，油脂氧化速度明显减缓，对油脂的氧化酸败有较好效果。
图5 酶解pH对核桃青皮多酚得率的影响
图6 核桃青皮多酚对大豆储藏过程中过氧化值的影响
2.7 核桃青皮多酚对猪油储存过程中酸值的影响
如图7所示，添加核桃青皮多酚组对比未添加组，前者猪油酸值明显降低，在猪油储存20 d时，猪油酸值增加速率明显降低，对抑制猪油酸败有明显效果。
3 結论
本文探究了酶解核桃青皮多酚提取的最佳外界条件，并将核桃青皮多酚添加进猪油中，经试验后发现，核桃青皮多酚的最佳提取温度为60 ℃、最佳提取时间为120 min、
最佳提取酶浓度为30 U/mL、最佳提取pH为5.5。核桃青皮多酚对猪油储存具有良好的抑制酸败的效果，为作为农业垃圾丢弃的核桃青皮多酚提供了一条新的资源化利
用方式。
参考文献
[1]傅本重，邹路路，朱洁倩，等.中国核桃生产现状与发展思路[J].江苏农业科学，2018，46（18）：5-8.
[2]娄丽，杨霞，朱佳敏.核桃青皮主要活性物质及提取工艺研究进展[J].贵州科学，2020，38（2）：17-20.
[3]左瑞庭，王西彬.胡桃醌对类风湿关节炎关节成纤维样滑膜细胞增殖和凋亡的影响[J].中成药，2019，41（10）：2334-2339.
[4]刘昕皓，魏粉菊，王学顺，等.多酚类化合物的生物活性研究进展[J].中国医药工业杂志，2021，52（4）：471-483.
[5]沈碧寒，陈嘉颖，李治康，等.响应面法优化核桃青皮多酚提取工艺及其自由基清除活力的研究[J].粮食与油脂，2020，33（10）：117-120.
[6]谷利伟，翁新楚.食用天然抗氧化剂研究进展[J].中国油脂，1997，22（3）：37-40.
[7]GIOVANNA CV，JOSHUA S，JULI?N V，et al.Insights from combining techno-economic and life cycle assessment–a case study of polyphenol extraction from red wine pomace[J].Resources，Conservation and Recycling，2021，167：105318.