[目的]得到表达多个基因的重组大肠杆菌,以期实现葡萄糖为碳源生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。[方法]以菌液为模板,PCR得到不同来源的proB、proA、proC、p4h基因,重叠PCR串联相邻基因,所得片段通过无缝组装与p ET-28a载体连接,并在大肠杆菌BL21中表达,筛选阳性表达菌株,电泳及测序验证,重组菌在30 ml MCG培养基摇瓶中发酵,分光光度法和HPLC检测产量。[结果]0.5 mmol/L IPTG诱导24 h,5组串联基因成功在大肠杆菌中表达,并以葡萄糖为碳源,获得产物反式-4-羟基-L-脯氨酸,培养基不添加L-脯氨酸时E.coli BL21/p ET-28a-BAHHbs、E.coli BL21/p ET-28a-HBACkp和E.coli BL21/p ET-28a-HBAmg产量达到0.28 g/L、0.16 g/L和0.29 g/L,添加4 mmol/L的L-脯氨酸时,分别为0.64 g/L、0.55 g/L和0.74 g/L。[结论]proB、proA、proC及p4h基因成功在大肠杆菌中表达,5株重组菌在30℃摇瓶中诱导表达24 h得到产物反式-4-羟基-L-脯氨酸,其中E.coli BL21/p ET-28a-HBAmg产量达到0.74 g/L,为今后在发酵罐中生产奠定基础。