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摘要 目的：运用网络药理学理念和技术研究“川芎-延胡索”药对的主要活性成分、靶点和药理学作用机制。方法：通过检索中药系统药理学分析平台（TCMSP）数据库，结合口服生物利用度和类药性分析，筛选出川芎和延胡索的主要成分、靶点信息，采用Cytoscape软件构建活性成分-作用靶点网络，获取的靶点信息，筛选核心靶点。利用DAVID在线分析工具对靶点进行基因本体（GO）功能富集分析和KEGG通路分析。结果：从“川芎-延胡索”药对中筛选得到58个主要活性成分，相关作用于靶点220个，主要涉及在癌症、信号传导、免疫、细胞通讯及凋亡等生物学过程中的多条信号通路。结论：本研究初步揭示了“川芎-延胡索”药对的主要活性成分、靶点及协同作用机制，为进一步深入探讨其药理学作用提供了参考。
关键词 网络药理学;川芎;延胡索;作用机制
Abstract Objective：To study the main active ingredients，targets and pharmacological mechanism of “Rhizoma Ligustici Chuanxiong-Rhizoma Corydalis” drug pair based on network pharmacology.Methods：The chemical components and targets related to Rhizoma Ligustici Chuanxiong-Rhizoma Corydalis were researched from the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP）according to oral bioavailability（OB）and drug likeness（DL）.Cytoscape 3.6.0 software was used to build the active ingredient-target network model and screen for core targets.The GO and KEGG pathways in the targets were analyzed by DAVID.Results：58 active components were screened from “Rhizoma Ligustici Chuanxiong-Rhizoma Corydalis” drug pair，involving 220 related action targets.It mainly involved multiple signaling pathways such as cancer，signal transduction，immunity，cell communication and apoptosis signaling pathways.Conclusion：This paper preliminarily revealed the main active ingredients，targets and synergistic mechanism of the herbal pair of “Rhizoma Ligustici Chuanxiong-Rhizoma Corydalis”，providing a reference for further exploration of its pharmacological effects.
Key Words Network pharmacology; Rhizoma Ligustici Chuanxiong; Rhizoma Corydalis; Action mechanism
中圖分类号：R285 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.10.009
“川芎-延胡索”为经典的临床搭配使用药物组合。川芎性属辛温，具有活血化瘀，行气开郁，祛风止痛的作用。临床上妇科主要用于月经不调、经闭痛经、产后瘀血疼痛;内科常用于胸胁疼痛、头痛眩晕;骨科常用于寒湿痹痛、跌打损伤。延胡索性温，味辛、苦;具有活血散瘀、理气止痛功效。临床常用于胸胁、腕腹疼痛，经闭痛经，产后瘀阻，跌扑肿痛。目前有关川芎和延胡索两味药材与疾病的关系，多从单一通路或靶点研究。对于二者搭配后出现的多通路、多靶点对疾病影响的研究较少。网络药理学（Network Pharmacology）是近年来较为热门的一种研究方法，它使用网络分析计算后，将“疾病-基因-靶点-药物”相互作用关系，以直观图形呈现，更好的揭示多成分药物协同作用的特点[1]。网络药理学的前瞻性、整体性特点还在指导新药研发[2]，复方方剂的配伍规律探寻方面发挥了作用[3]。本研究基于网络药理学方法，结合基因功能注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG），预测“川芎-延胡索”药对的活性成分、作用靶点、相关通路，以期更好的阐明“川芎-延胡索”配伍作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料 中药系统药理学技术平台TCMSP（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）;UniProt蛋白数据库（http：//www.uniprot.org）;David 6.8生物信息学分析数据库（https：//david.ncifcrf.gov）;Cytoscape软件（版本：3.6.0）;GraphPad Prism 7.0统计软件。
1.2 “川芎-延胡索”药对活性成分的筛选 通过TCMSP平台和文献检索2种方法收集川芎、延胡索两味药物中所含的化学成分。然后根据各个成分的吸收、分布、代谢与排泄（ADME）性质选出川芎、延胡索可能的活性成分，再查阅文献补充被淘汰或遗漏的有效成分，以增加预测结果的可信度。 1.3 “活性成分-靶点”相互作用网络的构建与分析 再次通过TCMSP平台检索“1.2”中筛选出的活性成分的潜在靶点，使用Uniprot数据库，将潜在靶点蛋白名称校正为物种为人的官方名称（Officical Symbol）。利用Cytoscape3.6.0统计软件构建“活性成分-靶点”相互作用网络模型并使用Network Analyzer插件对网络进行分析，查明网络中化合物和靶点的权重。
1.4 “川芎-延胡索”药对蛋白相互作用网络构建与分析 String数据库（https：//string-db.org，Version 10.5）[4]是一个收集了大量蛋白相互作用关系的数据库，其中包含了经过实验验证和通过生物信息学方法预测得到的数据，共涉及9 643 763个蛋白，1 380 838 440个相互作用。将“川芎-延胡索”药对活性成分作用的蛋白靶点导入String数据库，限定物种为人，获取蛋白相互作用关系，结果保存成TSV格式，导入Cytoscape3.6.0统计软件绘制相互作用网路。首先对此蛋白互作网络进行总体分析，然后使用Cytoscape3.6.0统计软件中的cytohubba插件确定最重要的10个蛋白互作关系，计算方法的选择最大团中心性（Maximal Clique Centrality，MCC）[5]。
1.5 基因功能和信号通路分析 使用DAVID数据库，对“川芎-延胡索”药对作用靶点进行GO和KEGG Pathways分析，GO分析中选择生物学过程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）、细胞组分（Cellular Component，CC）3个内容。保存结果后，阈值设置为Pvalue<0.05，PDF<0.05进行筛选，并按照涉及的靶点数目多少进行排序，GO分析结果用GraphPad Prism 7.0统计软件绘制条形图，KEGG Pathway，用R语言绘制气泡图。
2 结果
2.1 “川芎-延胡索”药对中活性成分的筛选 在TCMSP数据库中，以“川芎”“延胡索”为关键词分别进行查询，结果显示（截止到2018年10月），与川芎有关的化学成分有189个，与延胡索有关的化学成分有77个。本研究根据化学成分的ADME性质，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和类药性（druglikeness，DL）≥0.18为条件对有关化合物进行筛选[6]，结果川芎得到7个，延胡索得到49个。为了确保结果的全面性及可靠性，再次通過文献查找川芎及延胡索有效化合物。文献记载川芎的化学成分包含苯酞及其二聚体、生物碱、有机酸、多糖以及脑苷脂和神经酰胺等类成分[7-8]，其中藁本内酯（ligustilide）被认为是苯酞类化合物中主要的活性化合物，具有镇痛、抗炎等作用;阿魏酸（Ferulic Acid）是有机酚酸类代表化合物，在阿尔茨海默病、细胞凋亡、氧化应激等方面研究较多;川芎嗪（tetramethylpyrazine）属于生物碱，其研究主要集中在缺血再灌注损伤、细胞凋亡等领域[9];因此，川芎有效化合物共计10个。查阅文献发现延胡索化学成分包含生物碱、淀粉、树脂、挥发油、多糖等，经TCMSP筛选后包括了经过验证有效成分，因此川芎-延胡索药对筛选后共得到58个（含有一个共同成分）活性成分。见表1。
2.2 “活性成分-靶点”相互作用网络分析 使用TCMSP数据库查找“表1”中活性成分的潜在靶点。通过Cytoscape 3.6.0统计软件绘制“川芎-延胡索”药对的“活性成分-靶点”相互作用网络图。见图1。图中三角形代表活性成分，圆形代表作用靶点。蓝色代表川芎活性成分及靶点，红色代表延胡索活性成分及靶点，紫色代表二者共同活性成分及作用靶点，且具有互作关系的节点间用直线连接。一个节点的度值（degree）代表与该节点相连接的边的条数，度值的大小即代表着与对应节点的连接程度，亦即在网络中的关键度，图中节点的大小与度值相对应。此网络结构中包含了277个节点和1 161条边，277个节点中包括57个化学成分和220个作用靶点。化学成分中延胡索49个，川芎9个（senkyunone在TCMSP数据库中无靶点蛋白因此未在图中显示），及1个共有成分（sitosterol）。作用靶点中，延胡索有167个单独潜在作用靶点，川芎有8个单独潜在作用靶点，“川芎-延胡索”药对共有成分潜在作用靶点3个，非共有成分共同潜在作用靶点42个”。川芎-延胡索”药对每个活性成分平均作用于20.37（1 161/57）个靶点，每个靶点平均接受5.3（1 161/220）个药物作用，反映了药物和靶点多重互作的复杂网络关系。从图1可以看出，MOL000098槲皮素（quercetin）拥有最多的潜在靶点151个，其次是MOL000790异紫堇杷明（Isocorypalmine）和MOL000217（S）-斯氏紫堇碱[（S）-Scoulerine]都有36个潜在靶点。这些靶点高的化合物可能在“川芎-延胡索”药对的药理功能中发挥着相对重要的作用。另外，在220个潜在靶标中，有73个靶点与2个及以上化合物分子相连接，说明同一个靶点也能同时接受多个化合物对其调控，同样呈现出中药多成分、多靶点、整合调节的作用特点。在所有靶点中，PTGS2（前列腺素过氧化物合酶2）、PTGS1（前列腺素过氧化物合酶1）、SCN5A（5型钠通道α亚基）拥有最多的配体，分别为48、44、44个。
2.3 “川芎-延胡索”药对蛋白相互作用网络构建与分析 蛋白互作网络结果详见图2，图中节点表示蛋白，边表示蛋白之间的关联，蓝色代表川芎相关靶点，红色代表延胡索相关靶点，紫色代表二者共同作用靶点，且图中节点的大小与其连接度成正比。图中共涉及212个节点，3 762条边（其中F10a、GYRB、IGHG1、PRXC1A、TOP2、、CDKN2未在数据库中找到，DIO1、DCAF与其他蛋白没有相互作用，这8个蛋白不在相互作用网络中体现）。使用cytohubba插件中MCC方法计算后，确定最重要的10个蛋白互作关系，结果如图3所示。 2.4 靶点的GO富集分析及信号通路分析 使用DAVID数据库，对相关靶点进行GO和KEGG pathway富集分析，阈值设置为Pvalue<0.05，FDR<0.05。通过GO分析发现，“川芎-延胡索”作用的靶点基因主要富集在412个BP、28种MF和20类CC中。图4～6分别列出了显著性较高的前10种。图4显示，药对的靶点主要富集在调控细胞增殖、有机物应答、细胞内信号级联、调调控细胞凋亡、控细胞死亡、正向调控分子功能、正向调控催化活性、内源性刺激应答、伤害应答、激素刺激应答等;在分子功能方面见图5，主要富集在相同的蛋白结合、脂质结合、蛋白二聚活性、酶结合、序列特异性DNA结合、转录因子结合、胺结合、胺受体活性、药物结合、配体依赖性核受体活性等方面;在细胞组分中细胞膜、细胞外区域、细胞质基质所占比例最大。见图6。
此外，KEEG分析共得到24條信号通路。见图7。图7中圆点的颜色与大小由相关联的基因数量和P值决定。通过图7分析可知“川芎-延胡索”药对主要涉及癌症信号通路、信号传导相关通路、免疫相关信号通路、细胞通讯相关通路及细胞生长和死亡相关通路。
3 讨论
中药具有多成分、多靶点、调节方式多样性的特点，以往单一成分或靶标的研究方法难以反映中药的系统性[10]，并且按照中医理论开具的中药处方可能不是简单的各自药效的叠加，还会产生复杂的协同或衰减作用[11]，网络药理学从相互连接的角度研究问题，并整合中药、蛋白、基因、疾病等多种数据库，采用生物信息学手段分析问题，探索药物作用机制，其整体性、系统性的特点与中药的特点不谋而合。川芎和延胡索是经典的临床搭配使用药物组合，尤其在妇科和骨科搭配使用，二者协同可起到活血行气、散瘀止痛的功效，尤其在月经不调、痛经、跌打损伤、脊柱退行性相关疾病中使用广泛，如七制香附丸、杜仲壮骨丸、跌打损伤丸等成药或方剂中都含有这2种药物的搭配组合。本研究通过网络药理学相关理念和技术，从“川芎-延胡索”药对中筛选出58个活性成分，预测相应靶点220个。通过分析以这些活性成分和靶点构建的网络模型，发现连接度前3名的化合物为槲皮素（quercetin）、异紫堇杷明（Isocorypalmine）、（S）-金黄紫堇碱[（S）-Scoulerine]。其中槲皮素作为属于一种天然的黄酮类化合物，在我们日常食物中来源非常丰富，大量研究表明具有广泛的药理学作用，如抗氧化、抗病毒、抗炎作用，在基础研究中可疗血管、呼吸、泌尿、代谢、骨骼及神经系统疾病等[12]。异紫堇杷明（Isocorypalmine）为一种较新发现的生物碱[13]，它与多巴胺D1受体有很高的亲和力[K（i）=83 nM][14]，能作为D1部分激动剂和D2拮抗剂产生体内效应，可能是治疗可卡因成瘾的一种有前途的药物[15-16]。（S）-金黄紫堇碱属于异喹啉类生物碱，有研究表明，它对NMDA受体拮抗剂地卓西平马来酸盐（MK-801）诱发的精神分裂症的阳性症状、阴性症状以及认知障碍均有改善作用，而且在抗精神分裂症的有效剂量下并不引起木僵等锥体外系不良反应，提示金黄紫堇碱具有成为新型抗精神病药的潜力，值得进一步深入研究[17]。网络中连接度排名前三的靶点为PTGS2、PTGS1和SCN5A。PTGS中文名为前列腺素过氧化物合酶，又称环氧化酶，是前列腺素生物合成的关键酶，PTGS有2种同工酶：一种是组成型PTGS1，另一种是诱导型PTGS2，其中靶点PTGS2被报道参与炎性反应、细胞凋亡[18]、癌症[19]等多种病理过程。PGTS1蛋白可促进肿瘤进展过程中的细胞增殖，它的选择性剪接可导致多种转录变异[20]。SCN5A是一个完整的膜蛋白和抗四环素电压门控钠通道亚基。这种蛋白主要存在于心肌中，负责心电图中动作电位的初始上升。该基因缺陷是长QT综合征3型（LQT3）的病因之一，该基因还与心力衰竭有密切的关系[21]。上述活性成分和靶点可能在“川芎-延胡索”药对中发挥比较关键的作用。
蛋白相互作用网络结果显示“川芎-延胡索”药对的靶点间存在着复杂的交互关系，而不是独立的发挥作用，网络中共有212个节点，3 762条边，经过计算后发现VEGFA、TP53、TNF、PTGS2、MMP9、MAPK1、JUN、IL6、CASP3、AKT1等可能是“川芎-延胡索”药对发挥作用的主要靶蛋白靶点。
通过GO富集分析可知，“川芎-延胡索”药对的靶基因主要富集在调控细胞增殖、有机物应答、细胞内信号级联、调调控细胞凋亡、控细胞死亡、正向调控分子功能、正向调控催化活性、内源性刺激应答、伤害应答、激素刺激应答等，这与文献报道较为吻合说明预测靶点的准确性，为进一步深入阐释“川芎-延胡索”药理作用机制提供依据。此外，“川芎-延胡索”药对富集较多的靶点还有调控传递神经冲动、突触传导、神经系统、循环系统等，这些相似的生物学过程可能是“川芎-延胡索”药对治疗痛经及脊柱相关疾病的有关因素，值得进一步的研究。
KEGG通路分析筛选后共得到了24条信号通路，其中涉及癌症相关信号通路的共12条，分别是癌症相关通路、前列腺癌、胰腺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、慢性粒细胞白血病、结直肠癌、神经胶质瘤、子宫内膜癌、黑色素瘤、急性骨髓性白血病。郭秀伟等报道川芎联合顺铂组可以通过抑制HIF-1α的表达从而抑制肺癌干细胞样细胞荷瘤裸鼠肿瘤组织的增殖和复发[22]。汝涛等发现川芎可以通过阻滞胰腺癌HS766T细胞G0/G1期，抑制细胞增殖并通过增加合成期细胞百分比促进细胞凋亡的产生，在体外产生抑制胰腺癌HS 766T细胞的增殖的作用[23]。Xu D等[24]发现川芎嗪通过上调miR-211从而进一步调控PI3K/AKT和mTOR信号通路的激活，抑制成髓细胞瘤生长、迁移和侵袭。Gao JL等[25]研究发现延胡索和莪术组方可明显降低肿瘤活性。因此推断从中医活血化瘀方向研究肿瘤的治疗具有一定的前景。涉及信号传导相关的通路有5条，分别是神经活性配体-受体相互作用通路、钙离子信号通路、MAPK信号通路、ErbB信号通路、VEGF信号通路，这些信号通路参与细胞的增殖、分化、细胞运动、迁移等多种生物功能，还与神经信号传导、血管的生成有关。涉及免疫相关信号通路有3条分别是TOLL样受体信号通路、T细胞受体信号通路、NOD样受体信号通路，参与机体的免疫调节功能。涉及细胞通讯相关通路有2条分别是黏着斑通路、间隙连接通路。涉及细胞生长和死亡相关通路有2条分别是凋亡相关通路、p53信号通路。 综上所述，本研究以临床常用药对“川芎-延胡索”药对为研究对象，通过网络药理学相关理念和方法分析“川芎-延胡索”药对所含的有效成分、作用靶点、生物学过程及相关通路，并构建了化合物靶点网络及通路气泡图以解释二者的协同作用机制。研究表明此药对涉及多种信号通路和生物过程，体现了“多成分-多靶点-多途径”的作用特点，上述研究结果与文献报道基本一致，为进一步深入研究“川芎-延胡索”药理作用奠定基础。
参考文献
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（2019-05-07收稿 责任编辑：王明）
关键词 网络药理学;川芎;延胡索;作用机制
Abstract Objective：To study the main active ingredients，targets and pharmacological mechanism of “Rhizoma Ligustici Chuanxiong-Rhizoma Corydalis” drug pair based on network pharmacology.Methods：The chemical components and targets related to Rhizoma Ligustici Chuanxiong-Rhizoma Corydalis were researched from the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP）according to oral bioavailability（OB）and drug likeness（DL）.Cytoscape 3.6.0 software was used to build the active ingredient-target network model and screen for core targets.The GO and KEGG pathways in the targets were analyzed by DAVID.Results：58 active components were screened from “Rhizoma Ligustici Chuanxiong-Rhizoma Corydalis” drug pair，involving 220 related action targets.It mainly involved multiple signaling pathways such as cancer，signal transduction，immunity，cell communication and apoptosis signaling pathways.Conclusion：This paper preliminarily revealed the main active ingredients，targets and synergistic mechanism of the herbal pair of “Rhizoma Ligustici Chuanxiong-Rhizoma Corydalis”，providing a reference for further exploration of its pharmacological effects.
Key Words Network pharmacology; Rhizoma Ligustici Chuanxiong; Rhizoma Corydalis; Action mechanism
中圖分类号：R285 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.10.009
“川芎-延胡索”为经典的临床搭配使用药物组合。川芎性属辛温，具有活血化瘀，行气开郁，祛风止痛的作用。临床上妇科主要用于月经不调、经闭痛经、产后瘀血疼痛;内科常用于胸胁疼痛、头痛眩晕;骨科常用于寒湿痹痛、跌打损伤。延胡索性温，味辛、苦;具有活血散瘀、理气止痛功效。临床常用于胸胁、腕腹疼痛，经闭痛经，产后瘀阻，跌扑肿痛。目前有关川芎和延胡索两味药材与疾病的关系，多从单一通路或靶点研究。对于二者搭配后出现的多通路、多靶点对疾病影响的研究较少。网络药理学（Network Pharmacology）是近年来较为热门的一种研究方法，它使用网络分析计算后，将“疾病-基因-靶点-药物”相互作用关系，以直观图形呈现，更好的揭示多成分药物协同作用的特点[1]。网络药理学的前瞻性、整体性特点还在指导新药研发[2]，复方方剂的配伍规律探寻方面发挥了作用[3]。本研究基于网络药理学方法，结合基因功能注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG），预测“川芎-延胡索”药对的活性成分、作用靶点、相关通路，以期更好的阐明“川芎-延胡索”配伍作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料 中药系统药理学技术平台TCMSP（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）;UniProt蛋白数据库（http：//www.uniprot.org）;David 6.8生物信息学分析数据库（https：//david.ncifcrf.gov）;Cytoscape软件（版本：3.6.0）;GraphPad Prism 7.0统计软件。
1.2 “川芎-延胡索”药对活性成分的筛选 通过TCMSP平台和文献检索2种方法收集川芎、延胡索两味药物中所含的化学成分。然后根据各个成分的吸收、分布、代谢与排泄（ADME）性质选出川芎、延胡索可能的活性成分，再查阅文献补充被淘汰或遗漏的有效成分，以增加预测结果的可信度。 1.3 “活性成分-靶点”相互作用网络的构建与分析 再次通过TCMSP平台检索“1.2”中筛选出的活性成分的潜在靶点，使用Uniprot数据库，将潜在靶点蛋白名称校正为物种为人的官方名称（Officical Symbol）。利用Cytoscape3.6.0统计软件构建“活性成分-靶点”相互作用网络模型并使用Network Analyzer插件对网络进行分析，查明网络中化合物和靶点的权重。
1.4 “川芎-延胡索”药对蛋白相互作用网络构建与分析 String数据库（https：//string-db.org，Version 10.5）[4]是一个收集了大量蛋白相互作用关系的数据库，其中包含了经过实验验证和通过生物信息学方法预测得到的数据，共涉及9 643 763个蛋白，1 380 838 440个相互作用。将“川芎-延胡索”药对活性成分作用的蛋白靶点导入String数据库，限定物种为人，获取蛋白相互作用关系，结果保存成TSV格式，导入Cytoscape3.6.0统计软件绘制相互作用网路。首先对此蛋白互作网络进行总体分析，然后使用Cytoscape3.6.0统计软件中的cytohubba插件确定最重要的10个蛋白互作关系，计算方法的选择最大团中心性（Maximal Clique Centrality，MCC）[5]。
1.5 基因功能和信号通路分析 使用DAVID数据库，对“川芎-延胡索”药对作用靶点进行GO和KEGG Pathways分析，GO分析中选择生物学过程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）、细胞组分（Cellular Component，CC）3个内容。保存结果后，阈值设置为Pvalue<0.05，PDF<0.05进行筛选，并按照涉及的靶点数目多少进行排序，GO分析结果用GraphPad Prism 7.0统计软件绘制条形图，KEGG Pathway，用R语言绘制气泡图。
2 结果
2.1 “川芎-延胡索”药对中活性成分的筛选 在TCMSP数据库中，以“川芎”“延胡索”为关键词分别进行查询，结果显示（截止到2018年10月），与川芎有关的化学成分有189个，与延胡索有关的化学成分有77个。本研究根据化学成分的ADME性质，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和类药性（druglikeness，DL）≥0.18为条件对有关化合物进行筛选[6]，结果川芎得到7个，延胡索得到49个。为了确保结果的全面性及可靠性，再次通過文献查找川芎及延胡索有效化合物。文献记载川芎的化学成分包含苯酞及其二聚体、生物碱、有机酸、多糖以及脑苷脂和神经酰胺等类成分[7-8]，其中藁本内酯（ligustilide）被认为是苯酞类化合物中主要的活性化合物，具有镇痛、抗炎等作用;阿魏酸（Ferulic Acid）是有机酚酸类代表化合物，在阿尔茨海默病、细胞凋亡、氧化应激等方面研究较多;川芎嗪（tetramethylpyrazine）属于生物碱，其研究主要集中在缺血再灌注损伤、细胞凋亡等领域[9];因此，川芎有效化合物共计10个。查阅文献发现延胡索化学成分包含生物碱、淀粉、树脂、挥发油、多糖等，经TCMSP筛选后包括了经过验证有效成分，因此川芎-延胡索药对筛选后共得到58个（含有一个共同成分）活性成分。见表1。
2.2 “活性成分-靶点”相互作用网络分析 使用TCMSP数据库查找“表1”中活性成分的潜在靶点。通过Cytoscape 3.6.0统计软件绘制“川芎-延胡索”药对的“活性成分-靶点”相互作用网络图。见图1。图中三角形代表活性成分，圆形代表作用靶点。蓝色代表川芎活性成分及靶点，红色代表延胡索活性成分及靶点，紫色代表二者共同活性成分及作用靶点，且具有互作关系的节点间用直线连接。一个节点的度值（degree）代表与该节点相连接的边的条数，度值的大小即代表着与对应节点的连接程度，亦即在网络中的关键度，图中节点的大小与度值相对应。此网络结构中包含了277个节点和1 161条边，277个节点中包括57个化学成分和220个作用靶点。化学成分中延胡索49个，川芎9个（senkyunone在TCMSP数据库中无靶点蛋白因此未在图中显示），及1个共有成分（sitosterol）。作用靶点中，延胡索有167个单独潜在作用靶点，川芎有8个单独潜在作用靶点，“川芎-延胡索”药对共有成分潜在作用靶点3个，非共有成分共同潜在作用靶点42个”。川芎-延胡索”药对每个活性成分平均作用于20.37（1 161/57）个靶点，每个靶点平均接受5.3（1 161/220）个药物作用，反映了药物和靶点多重互作的复杂网络关系。从图1可以看出，MOL000098槲皮素（quercetin）拥有最多的潜在靶点151个，其次是MOL000790异紫堇杷明（Isocorypalmine）和MOL000217（S）-斯氏紫堇碱[（S）-Scoulerine]都有36个潜在靶点。这些靶点高的化合物可能在“川芎-延胡索”药对的药理功能中发挥着相对重要的作用。另外，在220个潜在靶标中，有73个靶点与2个及以上化合物分子相连接，说明同一个靶点也能同时接受多个化合物对其调控，同样呈现出中药多成分、多靶点、整合调节的作用特点。在所有靶点中，PTGS2（前列腺素过氧化物合酶2）、PTGS1（前列腺素过氧化物合酶1）、SCN5A（5型钠通道α亚基）拥有最多的配体，分别为48、44、44个。
2.3 “川芎-延胡索”药对蛋白相互作用网络构建与分析 蛋白互作网络结果详见图2，图中节点表示蛋白，边表示蛋白之间的关联，蓝色代表川芎相关靶点，红色代表延胡索相关靶点，紫色代表二者共同作用靶点，且图中节点的大小与其连接度成正比。图中共涉及212个节点，3 762条边（其中F10a、GYRB、IGHG1、PRXC1A、TOP2、、CDKN2未在数据库中找到，DIO1、DCAF与其他蛋白没有相互作用，这8个蛋白不在相互作用网络中体现）。使用cytohubba插件中MCC方法计算后，确定最重要的10个蛋白互作关系，结果如图3所示。 2.4 靶点的GO富集分析及信号通路分析 使用DAVID数据库，对相关靶点进行GO和KEGG pathway富集分析，阈值设置为Pvalue<0.05，FDR<0.05。通过GO分析发现，“川芎-延胡索”作用的靶点基因主要富集在412个BP、28种MF和20类CC中。图4～6分别列出了显著性较高的前10种。图4显示，药对的靶点主要富集在调控细胞增殖、有机物应答、细胞内信号级联、调调控细胞凋亡、控细胞死亡、正向调控分子功能、正向调控催化活性、内源性刺激应答、伤害应答、激素刺激应答等;在分子功能方面见图5，主要富集在相同的蛋白结合、脂质结合、蛋白二聚活性、酶结合、序列特异性DNA结合、转录因子结合、胺结合、胺受体活性、药物结合、配体依赖性核受体活性等方面;在细胞组分中细胞膜、细胞外区域、细胞质基质所占比例最大。见图6。
此外，KEEG分析共得到24條信号通路。见图7。图7中圆点的颜色与大小由相关联的基因数量和P值决定。通过图7分析可知“川芎-延胡索”药对主要涉及癌症信号通路、信号传导相关通路、免疫相关信号通路、细胞通讯相关通路及细胞生长和死亡相关通路。
3 讨论
中药具有多成分、多靶点、调节方式多样性的特点，以往单一成分或靶标的研究方法难以反映中药的系统性[10]，并且按照中医理论开具的中药处方可能不是简单的各自药效的叠加，还会产生复杂的协同或衰减作用[11]，网络药理学从相互连接的角度研究问题，并整合中药、蛋白、基因、疾病等多种数据库，采用生物信息学手段分析问题，探索药物作用机制，其整体性、系统性的特点与中药的特点不谋而合。川芎和延胡索是经典的临床搭配使用药物组合，尤其在妇科和骨科搭配使用，二者协同可起到活血行气、散瘀止痛的功效，尤其在月经不调、痛经、跌打损伤、脊柱退行性相关疾病中使用广泛，如七制香附丸、杜仲壮骨丸、跌打损伤丸等成药或方剂中都含有这2种药物的搭配组合。本研究通过网络药理学相关理念和技术，从“川芎-延胡索”药对中筛选出58个活性成分，预测相应靶点220个。通过分析以这些活性成分和靶点构建的网络模型，发现连接度前3名的化合物为槲皮素（quercetin）、异紫堇杷明（Isocorypalmine）、（S）-金黄紫堇碱[（S）-Scoulerine]。其中槲皮素作为属于一种天然的黄酮类化合物，在我们日常食物中来源非常丰富，大量研究表明具有广泛的药理学作用，如抗氧化、抗病毒、抗炎作用，在基础研究中可疗血管、呼吸、泌尿、代谢、骨骼及神经系统疾病等[12]。异紫堇杷明（Isocorypalmine）为一种较新发现的生物碱[13]，它与多巴胺D1受体有很高的亲和力[K（i）=83 nM][14]，能作为D1部分激动剂和D2拮抗剂产生体内效应，可能是治疗可卡因成瘾的一种有前途的药物[15-16]。（S）-金黄紫堇碱属于异喹啉类生物碱，有研究表明，它对NMDA受体拮抗剂地卓西平马来酸盐（MK-801）诱发的精神分裂症的阳性症状、阴性症状以及认知障碍均有改善作用，而且在抗精神分裂症的有效剂量下并不引起木僵等锥体外系不良反应，提示金黄紫堇碱具有成为新型抗精神病药的潜力，值得进一步深入研究[17]。网络中连接度排名前三的靶点为PTGS2、PTGS1和SCN5A。PTGS中文名为前列腺素过氧化物合酶，又称环氧化酶，是前列腺素生物合成的关键酶，PTGS有2种同工酶：一种是组成型PTGS1，另一种是诱导型PTGS2，其中靶点PTGS2被报道参与炎性反应、细胞凋亡[18]、癌症[19]等多种病理过程。PGTS1蛋白可促进肿瘤进展过程中的细胞增殖，它的选择性剪接可导致多种转录变异[20]。SCN5A是一个完整的膜蛋白和抗四环素电压门控钠通道亚基。这种蛋白主要存在于心肌中，负责心电图中动作电位的初始上升。该基因缺陷是长QT综合征3型（LQT3）的病因之一，该基因还与心力衰竭有密切的关系[21]。上述活性成分和靶点可能在“川芎-延胡索”药对中发挥比较关键的作用。
蛋白相互作用网络结果显示“川芎-延胡索”药对的靶点间存在着复杂的交互关系，而不是独立的发挥作用，网络中共有212个节点，3 762条边，经过计算后发现VEGFA、TP53、TNF、PTGS2、MMP9、MAPK1、JUN、IL6、CASP3、AKT1等可能是“川芎-延胡索”药对发挥作用的主要靶蛋白靶点。
通过GO富集分析可知，“川芎-延胡索”药对的靶基因主要富集在调控细胞增殖、有机物应答、细胞内信号级联、调调控细胞凋亡、控细胞死亡、正向调控分子功能、正向调控催化活性、内源性刺激应答、伤害应答、激素刺激应答等，这与文献报道较为吻合说明预测靶点的准确性，为进一步深入阐释“川芎-延胡索”药理作用机制提供依据。此外，“川芎-延胡索”药对富集较多的靶点还有调控传递神经冲动、突触传导、神经系统、循环系统等，这些相似的生物学过程可能是“川芎-延胡索”药对治疗痛经及脊柱相关疾病的有关因素，值得进一步的研究。
KEGG通路分析筛选后共得到了24条信号通路，其中涉及癌症相关信号通路的共12条，分别是癌症相关通路、前列腺癌、胰腺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、慢性粒细胞白血病、结直肠癌、神经胶质瘤、子宫内膜癌、黑色素瘤、急性骨髓性白血病。郭秀伟等报道川芎联合顺铂组可以通过抑制HIF-1α的表达从而抑制肺癌干细胞样细胞荷瘤裸鼠肿瘤组织的增殖和复发[22]。汝涛等发现川芎可以通过阻滞胰腺癌HS766T细胞G0/G1期，抑制细胞增殖并通过增加合成期细胞百分比促进细胞凋亡的产生，在体外产生抑制胰腺癌HS 766T细胞的增殖的作用[23]。Xu D等[24]发现川芎嗪通过上调miR-211从而进一步调控PI3K/AKT和mTOR信号通路的激活，抑制成髓细胞瘤生长、迁移和侵袭。Gao JL等[25]研究发现延胡索和莪术组方可明显降低肿瘤活性。因此推断从中医活血化瘀方向研究肿瘤的治疗具有一定的前景。涉及信号传导相关的通路有5条，分别是神经活性配体-受体相互作用通路、钙离子信号通路、MAPK信号通路、ErbB信号通路、VEGF信号通路，这些信号通路参与细胞的增殖、分化、细胞运动、迁移等多种生物功能，还与神经信号传导、血管的生成有关。涉及免疫相关信号通路有3条分别是TOLL样受体信号通路、T细胞受体信号通路、NOD样受体信号通路，参与机体的免疫调节功能。涉及细胞通讯相关通路有2条分别是黏着斑通路、间隙连接通路。涉及细胞生长和死亡相关通路有2条分别是凋亡相关通路、p53信号通路。 综上所述，本研究以临床常用药对“川芎-延胡索”药对为研究对象，通过网络药理学相关理念和方法分析“川芎-延胡索”药对所含的有效成分、作用靶点、生物学过程及相关通路，并构建了化合物靶点网络及通路气泡图以解释二者的协同作用机制。研究表明此药对涉及多种信号通路和生物过程，体现了“多成分-多靶点-多途径”的作用特点，上述研究结果与文献报道基本一致，为进一步深入研究“川芎-延胡索”药理作用奠定基础。
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（2019-05-07收稿 责任编辑：王明）