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摘要：【目的】挖掘七彩神仙鱼（Symphysodon haraldi）脑组织性别差异基因，为揭示脑组织性别相关基因调控繁殖生理机制打下基础。【方法】利用Illumina HiSeq 6000测序平台对七彩神仙鱼雌、雄脑组织样本进行转录组测序分析，经过滤和Trinity组装获得基因，采用DIAMOND进行功能注释;并选取NR、GO、KEGG、Pfam、Swiss-Prot和eggNOG等數据库进行比对，筛选出差异表达候选基因;随机选取6个差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证。【结果】从构建的七彩神仙鱼脑组织cDNA文库测序获得337190200条原始数据（Raw reads），经质量筛选后获得34109个基因（平均长度1007.00 bp）和67488个转录本（平均长度694.00 bp）。经生物信息学分析方法筛选，最终获得85个差异表达基因（61个在雄鱼脑组织中高表达，24个在雌鱼脑组织中高表达），包括黑色素浓集激素（MCH）、催乳素释放激素（Prlh）、垂体同源结构域转录因子2（pitx2）、免疫球蛋白家族成员（DSCAM和IGDCC3）、溶质载体（UNC93B1）及醛糖还原酶（AKR1B1）等功能基因。与雌鱼脑组织相比，雄鱼脑组织中涉及细胞突触传递、激素调控、信号传导、黑色素浓集激素、催乳素释放激素、生长激素和G蛋白偶联受体的基因呈下调趋势，而涉及离子运输和免疫反应的基因呈上调趋势。随机选取6个差异表达基因（Prlh、pitx2、MCH、LMX1A、KBP和CRP）进行实时荧光定量PCR验证，结果显示，Prlh、pitx2、MCH、LMX1A和KBP基因在雌鱼脑组织的相对表达量较高，而CRP基因在雄鱼脑组织的相对表达量较高。【结论】MCH、Prlh、pitx2、DSCAM、IGDCC3、UNC93B1、AKR1B1和Nid1等基因在七彩神仙鱼脑组织中呈性别差异表达，可能在调节脑组织类固醇激素形成及配子发生的过程中发挥重要作用，可作为候选基因应用于七彩神仙鱼脑组织性别相关基因调控繁殖生理机制研究。
关键词： 七彩神仙鱼;转录组;脑组织;性别差异基因
中图分类号： S965.82 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）11-2827-09
Differential expression analysis of mRNAs based on brain transcriptome in the discus fish（Symphysodon haraldi）
LIU Yi-nan1，2，3， WEN Bin1，2，3， CHEN Zai-zhong1，2，3*
（1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education（Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China; 2Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture（Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China; 3Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources， Ministry of Agriculture and
Rural Affairs（Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China）
Abstract：【Objective】Exploring the sex-biased genes in brain tissue of discus fish（Symphysodon haraldi） could lay the foundation for revealing the physiological mechanism of sex-related genes in discus brain that regulated reproduction.【Method】The Illumina HiSeq 6000 sequencing platform was used to perform transcriptome sequencing analysis on the brain tissue of female and male discus fish.The genes were obtained after filtration and assembled by Trinity， and DIAMOND was used for functional annotation. The NR， GO， KEGG， Pfam， Swiss-Prot， and eggNOG database were selec-ted for comparison and filtered out the differential candidate genes.Randomly selected six differentially expressed genes for qRT-PCR validation. 【Result】From the constructed discusbrain cDNA library， 337190200 raw reads were sequenced. After quality screening， 34109 genes（average length 1007.00 bp） and 67488 transcripts（average length 694.00 bp） were obtained. Screened by bioinformatics analysis，obtained total of 85 differentially expressed genes（61 were highly expressed in male fish brain， 24 were highly expressed in female fish brain） were obtained， including melanin-concentrating hormone（MCH）， prolactin release Hormone（Prlh）， pituitary homeodomain transcription factor 2（pitx2）， immunoglobulin family members（DSCAM and IGDCC3）， solute carrier（UNC93B1） and aldose reductase（AKR1B1）. Compared with female fish， among these genesinmale fish brain tissues，which involved in cell synaptic transmission， hormone regulation， signal transduction， melanin-concentrating hormone， prolactin releasing hormone， growth hormone and G protein-coupled receptors were down-regulated; which involved in ion transport and immune response were up-regulated. Randomly selected six differentially expressed genes（Prlh， pitx2， MCH， LMX1A， KBP and CRP） for validated by qRT-PCR. The results showed that the relative expression levels of Prlh， pitx2， MCH， LMX1A and KBP in female fish brain were high， and the relative expression of CRP in male brain tissue was high. 【Conclusion】Genes such as MCH， Prlh， pitx2， DSCAM， IGDCC3， UNC93B1， AKR1B1 and Nid1 were differentially expressed in the brain tissue of discusfish， which might play an important role in regulating the formation of steroid hormones and gametogenesis， and can be used as candidate genes in the research of discus fish brain tissue sex-biased gene regulating reproduction physiological mechanism. Key words： discus fish; transcriptome; brain tissue; sex-biased gene
Foundation items： Shanghai Natural Science Foundation（20ZR1423600）; Shanghai Sailing Program（19YF1419400）
0 引言
【研究意義】七彩神仙鱼（Symphysodon haraldi）原产于南美洲亚马逊流域，因其鲜艳的色彩及优雅的游姿，被誉为热带观赏鱼之王，在淡水观赏鱼贸易中占据重要地位（刘晓东和陈再忠，2008;李浩然等，2015）。七彩神仙鱼对水环境要求苛刻，雌、雄鱼完全性成熟需要12个月，成年雄性个体较成年雌性个体大，因此更具观赏价值。目前，七彩神仙鱼的繁殖仍然依靠自然配对，但配对时间和繁殖周期较长，极大限制了七彩神仙鱼的规模化人工繁育（林睿涓，2017）。在脊椎动物的繁殖过程中，大脑通过下丘脑—垂体—性腺轴（BPG）调控和维持动物机体的生殖发育及其性行为（Weltzien et al.，2004）。BPG轴包含促性腺激素释放激素（GnRH）和促性腺激素（GTH）等神经激素，而这些神经激素受大量基因调控，因此，挖掘七彩神仙鱼脑组织中的性别差异基因，对探究脑组织性别相关基因在两性繁殖生理中的作用机理具有重要意义。【前人研究进展】目前，已在动物机体脑组织中发现一些与性别差异相关的基因，其作为转录因子在影响性别发育的过程中发挥重要作用。SRY基因是雄性性别决定基因，在脑黑质的形成过程中发挥关键作用（Natàlia et al.，2009）;Cbln1基因在雄性小鼠（Mus musculus）中高表达，且在雄性小鼠性别发育过程中不可或缺（Ikeda et al.，2012）;LOC101160739基因与雄性个体的性行为有关（Pauletto et al.，2018）。在硬骨鱼类中，Tcf12基因在雄性鲦鱼（Pimephales promelas）个体中参与抗雌性激素反应，在其性别发育及繁殖过程中发挥重要作用（Garcia-Reyero et al.，2009）;PSCA基因在雄性黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）脑组织中特异表达（Lu et al.，2015）;同样，在雌性鱼类脑组织中也存在一些与性别相关的基因，如fzd10基因参与斑马鱼（Danio rerio）的Wnt信号通路，与雌性个体的性别发育相关，而spry4基因通过抑制受体酪氨酸激酶（RPTKs）信号，对维持雌性脑组织的正常发育起关键作用（Santos et al.，2008）;Cyp19a1b基因则参与黑鲷（Acanthopagrus schlegeli）雌激素的合成（Wu et al.，2010）。此外，诸多配子基因对存在性别差异表达方式，如chd1z/chd1w（Agate et al.，2004）、Utx/Uty（Xu et al.，2005）和Usp9x/Usp9y（Xu et al.，2008）等，其在两性发育过程中均发挥重要作用。【本研究切入点】本课题组前期已从七彩神仙鱼性腺转录组中鉴定出与性别相关的基因，并分析其相关功能（徐哲，2018），但针对七彩神仙鱼脑组织中与性别差异表达相关的基因尚无研究报道。【拟解决的关键问题】利用Illumina HiSeq 6000测序平台对七彩神仙鱼转录组进行测序分析，筛选出雌、雄鱼脑组织差异表达基因，为揭示脑组织性别相关基因调控繁殖生理机制打下基础。
1 材料与方法
1. 1 样品采集
从上海海洋大学滨海养殖基地七彩神仙鱼养殖车间选取12月龄性成熟七彩神仙鱼雄鱼3条（99.0±15.8 g/尾）、雌鱼3条（90.0±13.2 g/尾）。供试验七彩神仙鱼经100 mg/L MS-222麻醉后，分别采集其脑组织立即冷冻，-80 ℃液氮保存备用。
1. 2 RNA提取与cDNA文库构建及测序
按miRNeasy试剂盒（美国QIAGEN公司）说明提取样本总RNA，经质检合格后使用连接有Oligo（dT）的磁珠富集mRNAs。使用六碱基随机引物（Random hexamers）合成cDNA第一链，随后加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNA Polymerase I合成cDNA第二链;经修复、筛选后进行PCR扩增并构建cDNA文库。文库质检合格后采用Illumina HiSeq 6000进行测序分析。
1. 3 mRNAs转录组数据生物信息学分析
测序获得的原始数据（Raw reads）经预处理，使用Cutadapt去除测序接头，以fqtrim过滤掉不合格序列即得到有效数据，然后通过Trinity组装获得基因并进行质量评判，包括基因长度、GC含量和N50等。采用DIAMOND进行功能注释，并选取NR、GO、KEGG、Pfam、Swiss-Prot和eggNOG等数据库进行比对;同时对比雌、雄鱼脑组织中显著差异表达的基因[表达量差异倍数（log2绝对值）≥1，P≤0.05]，并结合其在NR、GO、KEGG、Pfam、Swiss-Prot和eggNOG等数据库中的注释信息，筛选出雌、雄鱼脑组织间的差异表达基因。
1. 4 实时荧光定量PCR验证
为了验证测序筛选结果的准确性和可靠性，采用实时荧光定量PCR随机在mRNAs转录组中选择6个差异表达基因进行验证。扩增引物（表1）采用Primer 5.0进行设计，并委托南京建成科技有限公司合成。实时荧光定量PCR扩增程序：95 ℃预变性2 min;95 ℃ 10 s;60 ℃ 20 s;进行40个循环;72 ℃延伸60 s。经SYBR通道检测荧光信号，发现18S rRNA在七彩神仙鱼雌、雄鱼脑组织中无差别且稳定表达，因此将其作为本研究的管家基因。管家基因和目的基因的扩增效率相同，采用2-ΔΔCt法换算目的基因相对表达量。 2 结果与分析
2. 1 mRNAs转录组组装及功能注释结果
利用Illumina HiSeq 6000平台对构建的七彩神仙鱼脑组织cDNA文库进行测序分析，结果在6个cDNA文库中共获得337190200条Raw reads;经质量筛选后获得34109个基因（平均长度1007.00 bp）和67488个转录本（平均长度694.00 bp）。将34109个基因输入NR、GO、KEGG、Pfam、Swiss-Prot和eggNOG等数据库中进行比对，结果（表2）显示，在NR数据库中共比对出16220个基因（占47.55%），比对得到序列最多的是尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）（占30.04%），其次是斑马拟丽鱼（Maylandia zebra）（占9.61%）和新亮丽鲷（Neolamprologus brichardi）（占7.34%），说明七彩神仙鱼转录组测序比对得到亲缘关系最近的物种是罗非鱼。在eggNOG数据库中共比对出15242个基因（占44.69%），发现大量基因参与细胞运输、囊泡运输、信号转导、蛋白质翻译及转录等过程。在GO数据库中共比对出13624个基因（占39.94%），分别包含在25个生物过程（Biological process）、15个细胞组成（Cellular component）和10个分子功能（Molecular function）中（图1）。在生物过程中，以参与生化过程、DNA模板转录调节、发育过程及信号传导过程的基因最多;在细胞组成中，以参与细胞膜及膜组成的基因最多;在分子功能中，则以参与金属离子结合、分子功能及ATP结合过程的基因最多。
在生物体中，不同基因产物会通过有序的相互协调而行使其生物学功能。在KEGG数据库中有12746个基因（占37.37%）被富集到3274个KEGG信号通路，可划分为有机系统、新陈代谢、人类疾病、遗传信息加工、环境信息处理和细胞过程等六大类（图2）。其中，以参与细胞过程的基因最多（占18.29%），主要参与细胞运输、分解代谢及生长调节过程;有11.86%的基因参与有机系统，包括内分泌系统、循环系统和免疫系统;有15.35%的基因参与新陈代谢，包括氨基酸代谢、脂质代谢和碳水化合物代谢;有5.60%的基因参与人类疾病，主要涉及内分泌代谢疾病和传染疾病;有12.21%的基因参与遗传信息加工，包括翻译、折叠、分类和降解;有15.07%的基因参与环境信息处理，主要涉及信号传导和信号分子相互作用。
2. 2 七彩神仙魚雌、雄鱼脑组织间的差异表达基因
依据雌、雄鱼脑组织表达量差异倍数（log2绝对值）≥1且P≤0.05的标准，筛选七彩神仙鱼雌、雄鱼脑组织间的差异表达基因，结果获得85个差异表达基因。85个差异表达基因在6个样品中的具体表达情况详见图3。与雌鱼相比，有61个差异表达基因在雄鱼脑组织中呈上调表达、24个差异表达基因呈下调表达。将部分差异表达基因的GO功能注释结果与KEGG信号通路富集分析结果进行对比，结果（表3）发现：（1）涉及细胞突触传递、激素调控及信号传导的基因呈差异表达，且呈下调趋势;（2）涉及黑色素浓集激素、催乳素释放激素、生长激素和G蛋白偶联受体的基因呈差异表达，也呈下调趋势;（3）涉及离子运输和免疫反应的基因也呈差异表达，但呈上调趋势。
2. 3 实时荧光定量PCR验证结果
随机选取6个差异表达基因（Prlh、pitx2、MCH、LMX1A、KBP和CRP），采用实时荧光定量PCR检测其在七彩神仙鱼雌、雄鱼脑组织中的表达情况，结果（图4）显示，Prlh、pitx2、MCH、LMX1A和KBP基因在雌鱼脑组织中的相对表达量较高，而CRP基因在雄鱼脑组织中的相对表达量较高。可见，实时荧光定量PCR验证结果与Illumina HiSeq 6000测序结果基本一致，说明Illumina HiSeq 6000测序结果准确可靠。
3 讨论
本研究对七彩神仙鱼雌、雄鱼脑组织转录组进行测序、组装和注释，结果获得85个差异表达基因;与雌鱼相比，有61个差异表达基因在雄鱼脑组织中呈上调表达、24个差异表达基因呈下调表达。这些差异表达基因主要涉及到激素合成、细胞组成、信号传导和免疫反应等方面。MCH是一种由下丘脑外侧神经元产生的高效增强食物摄取的调节因子（Tritos and Maratos-Flier，1999），已有研究证实GnRH神经元所在区域存在MCH神经纤维，且在GnRH神经元活动的视前区高表达，对GnRH神经元有直接或间接的调节作用，而影响GnRH和促黄体素的分泌（Williamson et al.，2005）。GnRH通过调节MCH而调控鱼类的摄食情况（Amiya et al.，2008），即MCH可作为能量调节与生殖调节间的另一种潜在整合信号，通过下丘脑的食欲调节因子影响神经系统的生殖功能（Smith and Grove，2002）。因此，MCH基因在七彩神仙鱼雌鱼脑组织中高表达可能与其生殖功能存在密切联系。Prlh神经纤维可投射到垂体中，促使垂体前叶细胞分泌催乳素并广泛参与神经分泌及自主神经调节（Wang et al.，2012），在下丘脑—垂体—卵巢轴中发挥重要作用（Kataoka et al.，2001），或通过大脑视前区中的GnRH神经元介导促黄体生成激素分泌（Watanobe，2001）;此外，Prlh可刺激人类垂体腺分泌生长激素。pitx2是POU1F-PROP1通路的成员之一（Davis et al.，2010），在脑和垂体等器官的发育过程中发挥重要作用（Rodríguez-León et al.，2008;Liu et al.，2013）。pitx2通过调节POU1F1、LHX3及PROP1等垂体转录因子，而影响催乳素、促黄体生成激素、促卵泡激素和生长激素的分泌。此外，pitx2基因在胚胎、成体体细胞及生殖细胞中均有表达，在生物体胚胎至性成熟阶段发挥着性别调控作用（Nandi et al.，2011）。本研究发现MCH、Prlh和pitx2基因在七彩神仙鱼雌鱼脑组织中高表达，推测这些基因在调节七彩神仙鱼脑组织性别相关激素的合成与释放过程中发挥重要作用。 在七彩神仙鱼雄鱼脑组织中也存在一些高表达的差异表达基因，包括DSCAM、IGDCC3、UNC93B1、AKR1B1和Nid1等基因。DSCAM是细胞答黏附分子（Ig-CAM）免疫球蛋白家族的成员之一，在果蝇、小鼠及人类的神经系统中广泛表达，具有较高的表达水平，可能在神经系统的发育及神经网络的形成过程中发挥重要作用（Schmucker et al.，2000）。刘聪辉（2016）研究表明，DSCAM基因除了在哺乳动物的脑组织中高表达外，还在精巢中特异性表达，且参与精子的形成及精卵识别过程，但在卵巢中几乎不表达。IGDCC3是免疫球蛋白家族的DCC类成员，在脑组织中大量表达，且在精巢中的表达量是在卵巢中的5倍（Fagerberg et al.，2014）。UNC93B1是一种Toll样受体（TLRs）信号调节剂，在TLRs从内质网向内溶酶体的运输过程中扮演重要角色（Lee et al.，2013）。在大脑皮质、海马体和小脑中均发现有UNC93A基因表达，且在许多神经元包括GnRH神经元中也有表达（Ceder et al.，2017）。AKR1B1是多元醇形成途径的成员，是一种利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）作为电子供体将葡萄糖还原成山梨醇的生物酶，而山梨醇是精子的能量来源（Oates，2012），因此AKR1B1与精子的运动存在密切联系，其在精子、附睾上皮和附睾小体细胞中均有表达，且以在附睾近端和中段的表达活性最高（Frenette et al.，2003）。在小鼠的相关研究中还发现，Nid1与精巢的正常生理代谢有关，在精巢雄性激素受体及睾丸支持细胞中均有表达（Tainaka et al.，2012）。上述差异表达基因在七彩神仙鱼雄鱼脑组织中高表达，故推测其在七彩神仙鱼雄性生殖系统中发挥重要作用。
本研究基于Illumina HiSeq高通量测序技术分析七彩神仙鱼雌、雄鱼脑组织性别差异基因的表达情况，并通过生物信息学分析方法进行筛选，最终获得85个差异表达基因（61个在雄鱼脑组织中高表达，24个在雌鱼脑组织中高表达），其中MCH、Prlh、pitx2、DSCAM、IGDCC3、UNC93B1、AKR1B1和Nid1等基因可能在调节大脑类固醇激素形成及配子发生的过程中发挥重要作用，可作为候选基因应用于七彩神仙鱼脑组织性别相关基因调控繁殖生理机制研究。
4 结论
MCH、Prlh、pitx2、DSCAM、IGDCC3、UNC-93B1、AKR1B1和Nid1等基因在七彩神仙魚雌、雄鱼脑组织中呈明显的差异表达，可能在调节大脑类固醇激素形成及配子发生的过程中发挥重要作用，可作为候选基因应用于七彩神仙鱼脑组织性别相关基因调控繁殖生理机制研究。
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（責任编辑 兰宗宝）
收稿日期：2020-02-18
基金项目：上海市自然科学基金项目（20ZR1423600）;上海市扬帆人才计划项目（19YF1419400）
作者简介：*为通讯作者，陈再忠（1972-），博士，教授，主要从事观赏鱼繁殖遗传育种生物学研究工作，E-mail：chenzz@shou.edu.cn。刘怡南（1994-），研究方向为观赏鱼繁殖生物学，E-mail：liuyinan941024@163.com
关键词： 七彩神仙鱼;转录组;脑组织;性别差异基因
中图分类号： S965.82 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）11-2827-09
Differential expression analysis of mRNAs based on brain transcriptome in the discus fish（Symphysodon haraldi）
LIU Yi-nan1，2，3， WEN Bin1，2，3， CHEN Zai-zhong1，2，3*
（1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education（Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China; 2Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture（Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China; 3Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources， Ministry of Agriculture and
Rural Affairs（Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China）
Abstract：【Objective】Exploring the sex-biased genes in brain tissue of discus fish（Symphysodon haraldi） could lay the foundation for revealing the physiological mechanism of sex-related genes in discus brain that regulated reproduction.【Method】The Illumina HiSeq 6000 sequencing platform was used to perform transcriptome sequencing analysis on the brain tissue of female and male discus fish.The genes were obtained after filtration and assembled by Trinity， and DIAMOND was used for functional annotation. The NR， GO， KEGG， Pfam， Swiss-Prot， and eggNOG database were selec-ted for comparison and filtered out the differential candidate genes.Randomly selected six differentially expressed genes for qRT-PCR validation. 【Result】From the constructed discusbrain cDNA library， 337190200 raw reads were sequenced. After quality screening， 34109 genes（average length 1007.00 bp） and 67488 transcripts（average length 694.00 bp） were obtained. Screened by bioinformatics analysis，obtained total of 85 differentially expressed genes（61 were highly expressed in male fish brain， 24 were highly expressed in female fish brain） were obtained， including melanin-concentrating hormone（MCH）， prolactin release Hormone（Prlh）， pituitary homeodomain transcription factor 2（pitx2）， immunoglobulin family members（DSCAM and IGDCC3）， solute carrier（UNC93B1） and aldose reductase（AKR1B1）. Compared with female fish， among these genesinmale fish brain tissues，which involved in cell synaptic transmission， hormone regulation， signal transduction， melanin-concentrating hormone， prolactin releasing hormone， growth hormone and G protein-coupled receptors were down-regulated; which involved in ion transport and immune response were up-regulated. Randomly selected six differentially expressed genes（Prlh， pitx2， MCH， LMX1A， KBP and CRP） for validated by qRT-PCR. The results showed that the relative expression levels of Prlh， pitx2， MCH， LMX1A and KBP in female fish brain were high， and the relative expression of CRP in male brain tissue was high. 【Conclusion】Genes such as MCH， Prlh， pitx2， DSCAM， IGDCC3， UNC93B1， AKR1B1 and Nid1 were differentially expressed in the brain tissue of discusfish， which might play an important role in regulating the formation of steroid hormones and gametogenesis， and can be used as candidate genes in the research of discus fish brain tissue sex-biased gene regulating reproduction physiological mechanism. Key words： discus fish; transcriptome; brain tissue; sex-biased gene
Foundation items： Shanghai Natural Science Foundation（20ZR1423600）; Shanghai Sailing Program（19YF1419400）
0 引言
【研究意義】七彩神仙鱼（Symphysodon haraldi）原产于南美洲亚马逊流域，因其鲜艳的色彩及优雅的游姿，被誉为热带观赏鱼之王，在淡水观赏鱼贸易中占据重要地位（刘晓东和陈再忠，2008;李浩然等，2015）。七彩神仙鱼对水环境要求苛刻，雌、雄鱼完全性成熟需要12个月，成年雄性个体较成年雌性个体大，因此更具观赏价值。目前，七彩神仙鱼的繁殖仍然依靠自然配对，但配对时间和繁殖周期较长，极大限制了七彩神仙鱼的规模化人工繁育（林睿涓，2017）。在脊椎动物的繁殖过程中，大脑通过下丘脑—垂体—性腺轴（BPG）调控和维持动物机体的生殖发育及其性行为（Weltzien et al.，2004）。BPG轴包含促性腺激素释放激素（GnRH）和促性腺激素（GTH）等神经激素，而这些神经激素受大量基因调控，因此，挖掘七彩神仙鱼脑组织中的性别差异基因，对探究脑组织性别相关基因在两性繁殖生理中的作用机理具有重要意义。【前人研究进展】目前，已在动物机体脑组织中发现一些与性别差异相关的基因，其作为转录因子在影响性别发育的过程中发挥重要作用。SRY基因是雄性性别决定基因，在脑黑质的形成过程中发挥关键作用（Natàlia et al.，2009）;Cbln1基因在雄性小鼠（Mus musculus）中高表达，且在雄性小鼠性别发育过程中不可或缺（Ikeda et al.，2012）;LOC101160739基因与雄性个体的性行为有关（Pauletto et al.，2018）。在硬骨鱼类中，Tcf12基因在雄性鲦鱼（Pimephales promelas）个体中参与抗雌性激素反应，在其性别发育及繁殖过程中发挥重要作用（Garcia-Reyero et al.，2009）;PSCA基因在雄性黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）脑组织中特异表达（Lu et al.，2015）;同样，在雌性鱼类脑组织中也存在一些与性别相关的基因，如fzd10基因参与斑马鱼（Danio rerio）的Wnt信号通路，与雌性个体的性别发育相关，而spry4基因通过抑制受体酪氨酸激酶（RPTKs）信号，对维持雌性脑组织的正常发育起关键作用（Santos et al.，2008）;Cyp19a1b基因则参与黑鲷（Acanthopagrus schlegeli）雌激素的合成（Wu et al.，2010）。此外，诸多配子基因对存在性别差异表达方式，如chd1z/chd1w（Agate et al.，2004）、Utx/Uty（Xu et al.，2005）和Usp9x/Usp9y（Xu et al.，2008）等，其在两性发育过程中均发挥重要作用。【本研究切入点】本课题组前期已从七彩神仙鱼性腺转录组中鉴定出与性别相关的基因，并分析其相关功能（徐哲，2018），但针对七彩神仙鱼脑组织中与性别差异表达相关的基因尚无研究报道。【拟解决的关键问题】利用Illumina HiSeq 6000测序平台对七彩神仙鱼转录组进行测序分析，筛选出雌、雄鱼脑组织差异表达基因，为揭示脑组织性别相关基因调控繁殖生理机制打下基础。
1 材料与方法
1. 1 样品采集
从上海海洋大学滨海养殖基地七彩神仙鱼养殖车间选取12月龄性成熟七彩神仙鱼雄鱼3条（99.0±15.8 g/尾）、雌鱼3条（90.0±13.2 g/尾）。供试验七彩神仙鱼经100 mg/L MS-222麻醉后，分别采集其脑组织立即冷冻，-80 ℃液氮保存备用。
1. 2 RNA提取与cDNA文库构建及测序
按miRNeasy试剂盒（美国QIAGEN公司）说明提取样本总RNA，经质检合格后使用连接有Oligo（dT）的磁珠富集mRNAs。使用六碱基随机引物（Random hexamers）合成cDNA第一链，随后加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNA Polymerase I合成cDNA第二链;经修复、筛选后进行PCR扩增并构建cDNA文库。文库质检合格后采用Illumina HiSeq 6000进行测序分析。
1. 3 mRNAs转录组数据生物信息学分析
测序获得的原始数据（Raw reads）经预处理，使用Cutadapt去除测序接头，以fqtrim过滤掉不合格序列即得到有效数据，然后通过Trinity组装获得基因并进行质量评判，包括基因长度、GC含量和N50等。采用DIAMOND进行功能注释，并选取NR、GO、KEGG、Pfam、Swiss-Prot和eggNOG等数据库进行比对;同时对比雌、雄鱼脑组织中显著差异表达的基因[表达量差异倍数（log2绝对值）≥1，P≤0.05]，并结合其在NR、GO、KEGG、Pfam、Swiss-Prot和eggNOG等数据库中的注释信息，筛选出雌、雄鱼脑组织间的差异表达基因。
1. 4 实时荧光定量PCR验证
为了验证测序筛选结果的准确性和可靠性，采用实时荧光定量PCR随机在mRNAs转录组中选择6个差异表达基因进行验证。扩增引物（表1）采用Primer 5.0进行设计，并委托南京建成科技有限公司合成。实时荧光定量PCR扩增程序：95 ℃预变性2 min;95 ℃ 10 s;60 ℃ 20 s;进行40个循环;72 ℃延伸60 s。经SYBR通道检测荧光信号，发现18S rRNA在七彩神仙鱼雌、雄鱼脑组织中无差别且稳定表达，因此将其作为本研究的管家基因。管家基因和目的基因的扩增效率相同，采用2-ΔΔCt法换算目的基因相对表达量。 2 结果与分析
2. 1 mRNAs转录组组装及功能注释结果
利用Illumina HiSeq 6000平台对构建的七彩神仙鱼脑组织cDNA文库进行测序分析，结果在6个cDNA文库中共获得337190200条Raw reads;经质量筛选后获得34109个基因（平均长度1007.00 bp）和67488个转录本（平均长度694.00 bp）。将34109个基因输入NR、GO、KEGG、Pfam、Swiss-Prot和eggNOG等数据库中进行比对，结果（表2）显示，在NR数据库中共比对出16220个基因（占47.55%），比对得到序列最多的是尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）（占30.04%），其次是斑马拟丽鱼（Maylandia zebra）（占9.61%）和新亮丽鲷（Neolamprologus brichardi）（占7.34%），说明七彩神仙鱼转录组测序比对得到亲缘关系最近的物种是罗非鱼。在eggNOG数据库中共比对出15242个基因（占44.69%），发现大量基因参与细胞运输、囊泡运输、信号转导、蛋白质翻译及转录等过程。在GO数据库中共比对出13624个基因（占39.94%），分别包含在25个生物过程（Biological process）、15个细胞组成（Cellular component）和10个分子功能（Molecular function）中（图1）。在生物过程中，以参与生化过程、DNA模板转录调节、发育过程及信号传导过程的基因最多;在细胞组成中，以参与细胞膜及膜组成的基因最多;在分子功能中，则以参与金属离子结合、分子功能及ATP结合过程的基因最多。
在生物体中，不同基因产物会通过有序的相互协调而行使其生物学功能。在KEGG数据库中有12746个基因（占37.37%）被富集到3274个KEGG信号通路，可划分为有机系统、新陈代谢、人类疾病、遗传信息加工、环境信息处理和细胞过程等六大类（图2）。其中，以参与细胞过程的基因最多（占18.29%），主要参与细胞运输、分解代谢及生长调节过程;有11.86%的基因参与有机系统，包括内分泌系统、循环系统和免疫系统;有15.35%的基因参与新陈代谢，包括氨基酸代谢、脂质代谢和碳水化合物代谢;有5.60%的基因参与人类疾病，主要涉及内分泌代谢疾病和传染疾病;有12.21%的基因参与遗传信息加工，包括翻译、折叠、分类和降解;有15.07%的基因参与环境信息处理，主要涉及信号传导和信号分子相互作用。
2. 2 七彩神仙魚雌、雄鱼脑组织间的差异表达基因
依据雌、雄鱼脑组织表达量差异倍数（log2绝对值）≥1且P≤0.05的标准，筛选七彩神仙鱼雌、雄鱼脑组织间的差异表达基因，结果获得85个差异表达基因。85个差异表达基因在6个样品中的具体表达情况详见图3。与雌鱼相比，有61个差异表达基因在雄鱼脑组织中呈上调表达、24个差异表达基因呈下调表达。将部分差异表达基因的GO功能注释结果与KEGG信号通路富集分析结果进行对比，结果（表3）发现：（1）涉及细胞突触传递、激素调控及信号传导的基因呈差异表达，且呈下调趋势;（2）涉及黑色素浓集激素、催乳素释放激素、生长激素和G蛋白偶联受体的基因呈差异表达，也呈下调趋势;（3）涉及离子运输和免疫反应的基因也呈差异表达，但呈上调趋势。
2. 3 实时荧光定量PCR验证结果
随机选取6个差异表达基因（Prlh、pitx2、MCH、LMX1A、KBP和CRP），采用实时荧光定量PCR检测其在七彩神仙鱼雌、雄鱼脑组织中的表达情况，结果（图4）显示，Prlh、pitx2、MCH、LMX1A和KBP基因在雌鱼脑组织中的相对表达量较高，而CRP基因在雄鱼脑组织中的相对表达量较高。可见，实时荧光定量PCR验证结果与Illumina HiSeq 6000测序结果基本一致，说明Illumina HiSeq 6000测序结果准确可靠。
3 讨论
本研究对七彩神仙鱼雌、雄鱼脑组织转录组进行测序、组装和注释，结果获得85个差异表达基因;与雌鱼相比，有61个差异表达基因在雄鱼脑组织中呈上调表达、24个差异表达基因呈下调表达。这些差异表达基因主要涉及到激素合成、细胞组成、信号传导和免疫反应等方面。MCH是一种由下丘脑外侧神经元产生的高效增强食物摄取的调节因子（Tritos and Maratos-Flier，1999），已有研究证实GnRH神经元所在区域存在MCH神经纤维，且在GnRH神经元活动的视前区高表达，对GnRH神经元有直接或间接的调节作用，而影响GnRH和促黄体素的分泌（Williamson et al.，2005）。GnRH通过调节MCH而调控鱼类的摄食情况（Amiya et al.，2008），即MCH可作为能量调节与生殖调节间的另一种潜在整合信号，通过下丘脑的食欲调节因子影响神经系统的生殖功能（Smith and Grove，2002）。因此，MCH基因在七彩神仙鱼雌鱼脑组织中高表达可能与其生殖功能存在密切联系。Prlh神经纤维可投射到垂体中，促使垂体前叶细胞分泌催乳素并广泛参与神经分泌及自主神经调节（Wang et al.，2012），在下丘脑—垂体—卵巢轴中发挥重要作用（Kataoka et al.，2001），或通过大脑视前区中的GnRH神经元介导促黄体生成激素分泌（Watanobe，2001）;此外，Prlh可刺激人类垂体腺分泌生长激素。pitx2是POU1F-PROP1通路的成员之一（Davis et al.，2010），在脑和垂体等器官的发育过程中发挥重要作用（Rodríguez-León et al.，2008;Liu et al.，2013）。pitx2通过调节POU1F1、LHX3及PROP1等垂体转录因子，而影响催乳素、促黄体生成激素、促卵泡激素和生长激素的分泌。此外，pitx2基因在胚胎、成体体细胞及生殖细胞中均有表达，在生物体胚胎至性成熟阶段发挥着性别调控作用（Nandi et al.，2011）。本研究发现MCH、Prlh和pitx2基因在七彩神仙鱼雌鱼脑组织中高表达，推测这些基因在调节七彩神仙鱼脑组织性别相关激素的合成与释放过程中发挥重要作用。 在七彩神仙鱼雄鱼脑组织中也存在一些高表达的差异表达基因，包括DSCAM、IGDCC3、UNC93B1、AKR1B1和Nid1等基因。DSCAM是细胞答黏附分子（Ig-CAM）免疫球蛋白家族的成员之一，在果蝇、小鼠及人类的神经系统中广泛表达，具有较高的表达水平，可能在神经系统的发育及神经网络的形成过程中发挥重要作用（Schmucker et al.，2000）。刘聪辉（2016）研究表明，DSCAM基因除了在哺乳动物的脑组织中高表达外，还在精巢中特异性表达，且参与精子的形成及精卵识别过程，但在卵巢中几乎不表达。IGDCC3是免疫球蛋白家族的DCC类成员，在脑组织中大量表达，且在精巢中的表达量是在卵巢中的5倍（Fagerberg et al.，2014）。UNC93B1是一种Toll样受体（TLRs）信号调节剂，在TLRs从内质网向内溶酶体的运输过程中扮演重要角色（Lee et al.，2013）。在大脑皮质、海马体和小脑中均发现有UNC93A基因表达，且在许多神经元包括GnRH神经元中也有表达（Ceder et al.，2017）。AKR1B1是多元醇形成途径的成员，是一种利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）作为电子供体将葡萄糖还原成山梨醇的生物酶，而山梨醇是精子的能量来源（Oates，2012），因此AKR1B1与精子的运动存在密切联系，其在精子、附睾上皮和附睾小体细胞中均有表达，且以在附睾近端和中段的表达活性最高（Frenette et al.，2003）。在小鼠的相关研究中还发现，Nid1与精巢的正常生理代谢有关，在精巢雄性激素受体及睾丸支持细胞中均有表达（Tainaka et al.，2012）。上述差异表达基因在七彩神仙鱼雄鱼脑组织中高表达，故推测其在七彩神仙鱼雄性生殖系统中发挥重要作用。
本研究基于Illumina HiSeq高通量测序技术分析七彩神仙鱼雌、雄鱼脑组织性别差异基因的表达情况，并通过生物信息学分析方法进行筛选，最终获得85个差异表达基因（61个在雄鱼脑组织中高表达，24个在雌鱼脑组织中高表达），其中MCH、Prlh、pitx2、DSCAM、IGDCC3、UNC93B1、AKR1B1和Nid1等基因可能在调节大脑类固醇激素形成及配子发生的过程中发挥重要作用，可作为候选基因应用于七彩神仙鱼脑组织性别相关基因调控繁殖生理机制研究。
4 结论
MCH、Prlh、pitx2、DSCAM、IGDCC3、UNC-93B1、AKR1B1和Nid1等基因在七彩神仙魚雌、雄鱼脑组织中呈明显的差异表达，可能在调节大脑类固醇激素形成及配子发生的过程中发挥重要作用，可作为候选基因应用于七彩神仙鱼脑组织性别相关基因调控繁殖生理机制研究。
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（責任编辑 兰宗宝）
收稿日期：2020-02-18
基金项目：上海市自然科学基金项目（20ZR1423600）;上海市扬帆人才计划项目（19YF1419400）
作者简介：*为通讯作者，陈再忠（1972-），博士，教授，主要从事观赏鱼繁殖遗传育种生物学研究工作，E-mail：chenzz@shou.edu.cn。刘怡南（1994-），研究方向为观赏鱼繁殖生物学，E-mail：liuyinan941024@163.com