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[摘要] 目的 探讨乌司他丁（UTI）对盲肠结扎穿孔术（CLP）所致大鼠脓毒症急性肾损伤（AKI）的保护作用。 方法 SD健康雄性大鼠55只，按随机化原则分成3组：正常对照组5只、模型组25只、乌司他丁治疗组25只，后两组再随机分为5个时间点（1h、6h、12h、24h、48h），每组每时间点各5只，采用盲肠结扎穿孔术复制脓毒症模型，乌司他丁治疗组，造模后立即给予乌司他丁10万U/kg，尾静脉注射，分别在各个时间点采血、留尿标本，进行肾功能血肌酐（Scr）、尿素（Urea），尿肾损伤分子（KIM-1）、白细胞介素-18（IL-18）和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）检测分析。 结果 与模型组相比，乌司他丁治疗组大鼠各时间点Scr、Urea，尿KIM-1、IL-18、NGAL浓度均显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论 乌司他丁对脓毒症所致急性肾损伤具有一定的肾脏保护作用。
[关键词] 乌司他丁；脓毒症；急性肾损伤；尿相关指标
[中图分类号] R96 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）05-25-04
脓毒症并发急性肾损伤（AKI）的发病率为19%～23%，当脓毒症并发急性肾损伤（AKI）时，不仅给有效干预手段带来困难，增加患者死亡率，而且耗费巨大的医疗资源和巨额医疗费用，因此，及早防治脓毒症并发急性肾损伤，保护肾功能意义重大[1]。乌司他丁（UTI）是从尿中分离纯化出来的一种糖蛋白，具有清除自由基、抑制炎症介质释放、改善微循环衰竭状态，抑制蛋白质分解代谢亢进，以及多种蛋白酶活性等药理作用，对多脏器损伤有
保护作用[2-4]。本研究通过盲肠结扎穿孔术 （CLP）[5]建立脓毒症大鼠AKI模型，观察乌司他丁对脓毒症所致AKI的肾脏保护作用及其机制，为临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要材料和仪器
注射用乌司他丁10万U/支（广东天普生化医药股份有限公司，H19990134）；肾损伤分子1（KIM-1） ELISA试剂盒（美国R&D公司）、白细胞介素18（IL-18） ELISA试剂盒（武汉博士德公司）和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 （NGAL） ELISA试剂盒（上海蓝基生物有限公司）。
1.2 实验动物和分组
SD健康雄性大鼠55只，清洁级，10～12周，体质量200～250g，由潍坊医学院动物饲养室提供，适应性喂养1周，实验大鼠按隨机化原则分成3组：（1）正常对照组（n=5）：尾静脉推注生理盐水2mL；（2） 模型组（n=25）：行CLP；（3）乌司他丁治疗组（n=25）：行CLP后即刻尾静脉推乌司他丁10万U/kg；模型组、乌司他丁治疗组，再随机分为5个时间点（1、6、12、24、48h），每组每时间点各5只，术后均补充生理盐水3mL/100g抗休克。
1.3 动物模型制备
实验前禁食12h，手术组采用经典的CLP复制脓毒症AKI模型，即用10%水合氯醛0.3mL/100g腹腔麻醉，无菌条件下沿腹中线切开长约2cm，分离、结扎盲肠，在盲端肠壁用12号针穿刺2次，留置1条长1cm宽2 mm、两头贯穿盲肠的橡皮片，挤出少许粪便，将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁，编号，清醒后转入代谢笼内自由进水、进食。术毕补充生理盐水3mL/100g，术后自由饮食水。
1.4 留取标本
从术后腹壁缝合结束开始计时，分别于1、6、12、24、48h取材，下腔静脉抽血5mL，离心（3000 r/min）15min，取血清于-20℃保存，待测Scr、BUN；膀胱分离，膀胱穿刺收集尿标本于-20℃保存，待测KIM-1、IL-18、NGAL。
1.5 指标检测
采用Roche Cobas 8000全自动生化免疫分析仪（德国Roche公司）测定Scr、Urea。尿液标本均采用Thermo MK3（北京长弓科技有限公司）酶联免疫分析（ELISA）法检测KIM-1、IL-18和NGAL。
1.6 统计学处理
采用SPSS17.0对数据进行分析，计量资料用（）表示，应用独立样本t检验进行数据处理，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般状态
模型组大鼠病态明显，蜷缩，活动减少，少食或拒食，呼吸明显加快，反应迟钝，尿量减少等。与模型组相比，乌司他丁治疗组大鼠一般情况病态表现较轻，但较正常对照组差。
2.2 大鼠肾功能的变化
CLP术后6h，两组大鼠Scr、Urea的浓度开始升高，24h达高峰，48h开始下降，均显著高于对照组（P<0.05）。乌司他丁治疗组12、24、48h较模型组相应时间点Scr、Urea均显著低，差异均有统计学意义（P<0.05）；乌司他丁治疗组大鼠48h时Scr、Urea的浓度明显回落，但仍然高于对照组（P<0.05）。见表1～2。
2.3 两组大鼠尿KIM-1、NGAL、IL-18含量的变化
CLP术后两组大鼠尿KIM-1、NGAL、IL-18均于1h开始明显升高，12h达高峰，24h，48h下降，均显著高于对照组（P<0.05）。乌司他丁治疗组6h，12h，24h，48h较模型组相应时间点尿KIM-1、NGAL、IL-18含量显著低，差异均有统计学意义（P<0.05）；乌司他丁治疗组大鼠48h时尿KIM-1、NGAL、IL-18含量回落显著，但仍高于对照组（P<0.05）。见表3～5。
3 讨论
脓毒症时，肾脏的内皮细胞不仅被激活，产生炎性因子，同时也是炎性因子首要攻击的靶细胞之一[5-7]。在临床实践中发现，脓毒症一旦并发肾脏损害，治疗难度明显增加，而且耗费巨大的医疗资源和巨额医疗费用。因此，及早防治脓毒症并发急性肾损伤，保护肾功能意义重大[8-9]。 目前对急性肾损伤的检测，传统采用血清肌酐、尿素来评价，但该项指标的变化，出现升高较晚，很多研究证实，在大鼠AKI模型建立后6h开始升高，24h才达到高峰，48h开始下降，与KIM-1相比要晚[10]。本研究发现，CLP术后6h，两组大鼠Scr、Urea的浓度开始升高，24h达高峰，48h开始下降，与国内外报道相似[7-10]。
KIM-1是一种新的I型跨膜蛋白，参与肾小管上皮组织形态和功能的恢复，但在AKI后呈现高水平表达，并可在尿中检测出，在正常肾组织中表达微弱。国内外曾有学者研究急性肾损伤大鼠模型的尿KIM-1水平在诱导后第一天时均较诱导前的基线水平有3～5倍的升高，明显早于其他传统检测指标的改变，可以作为急性肾衰竭患者不良临床后果的预测指标[8，10，11]。本研究发现，两组大鼠CLP术后大鼠尿KIM-1于1h开始明显升高，12h达高峰，24、48h下降，均显著高于对照组，与相关报道类似[8，10，11]。
IL-18被认为与脓毒症时脏器功能受损关系密切，IL-18能促进细胞凋亡基因如Fasl的表达及降低抑制凋亡基因Bcl-2的表达发挥促凋亡作用，导致免疫功能紊乱，促进脏器功能损伤。曾有研究显示，在小鼠肾缺血性损伤模型中，IL-18在Caspase-1作用下被激活，激活后IL-18可裂解为成熟形式释放入尿，并可在尿中被检测出，目前经常选用的评价机体炎性反应程度和治疗效果的指标[2，7，10，12]。本研究结果发现，CLP术后大鼠尿IL-18于1h开始明显升高，12h达高峰，24h，48h下降，均显著高于对照组，与相关报道相似[2，7，12]。表明脓毒症大鼠急性肾损伤的发生发展，可能与炎症介质的释放有关。
NGAL是一种分泌性蛋白，研究表明，NGAL在正常肾组织中呈低水平表达，但在肾缺血/再灌注损伤和顺铂诱导小鼠肾损伤模型中，损伤后3h时的尿液中即可检测到NGAL，明显早于尿NAG、β2微球蛋白及Scr的改变，发现术后2h时尿NGAL水平与AKI程度相关，是AKI独立预测因子，也是目前基础实验中经常选用的评价急性肾功能损伤的指标[2，4，10]。本研究发现，CLP术后大鼠尿NGAL、于1h开始明显升高，12h达高峰，24、48h下降，均显著高于对照组，与有报道升高提前[2，7，8，10]，可能与本实验在制作模型时大鼠的选择，观察时间分段不一有关。
乌司他丁（UTI）是从尿中分离纯化出来的一种糖蛋白，具有稳定细胞膜及细胞亚膜、稳定溶酶体膜抑制溶酶体释放、清除自由基、抑制炎症介质释放、改善微循环衰竭状态，抑制蛋白质分解代谢亢进，以及多种蛋白酶活性等药理作用，并对多脏器损伤有保护作用[2-4]。本研究结果发现，乌司他丁治疗组12、24、48h较模型组相应时间点Scr、Urea均显著低；乌司他丁治疗组6、12、24、48h较模型组相应时间点尿KIM-1、NGAL、IL-18含量显著低，与国内外报道相似[2-4，13-15]。乌司他丁可能因减轻中性粒细胞的局部浸润，抑制炎症介质释放等机制对急性肾损伤大鼠腎功能起到保护作用。
本研究通过CLP复制脓毒症急性肾损伤模型，经乌司他丁治疗，显示了很好的肾脏保护作用，可能通过清除自由基、抑制炎症介质释放等机制，达到对脓毒症急性肾损伤大鼠肾脏起到保护作用。
[参考文献]
[1] Yohannes S，Chawla LS.Evolving practices in the management of acute kidney injury in the ICU [J].Clin Nephrol，2009，71（16）：602-607.
[2] 刘娇，陈德昌，周青山.乌司他丁对脓毒症急性肾损伤大鼠肾脏NOD1受体和血IL-18水平的影响[J].临床外科杂志，2013，21（9）：691-693.
[3] 王虹，刘贵建，刘锦丽，等.乌司他丁对老年多器官功能障碍综合征器官功能的保护作用[J].中国实用内科学杂志，2007，27（5）：242-244.
[4] Nesek V，Rasic Z，Kos J，et al.Puninotransfersses after experimental pneumoperitoneum indogs [J].Acta Anaesthesiol Seand，2004，48（7）：862-866.
[5] 桑珍珍，许云，盛英杰，等.重组人红细胞生成素对脓毒症大鼠肾脏的保护作用[J].中华肾脏病杂志，2012，28（12）：961-964.
[6] 孟建忠，郭爱华，李丹丹，等.盐酸法舒地尔防治脓毒症大鼠急性肾损伤的实验研究[J].生物医学工程研究，2010，29（3）：197-201.
[7] 任延波.脓毒血症时肾脏炎症因子的变化：以大鼠为实验动物的临床研究[J].中国急救复苏与灾害医学杂志，2008，3（10）：608-710.
[8] 李锦艳，刘虹，辛小梅.内毒素致大鼠急性肾损伤早期NGAL和KIM-1变化[J].中国医疗前沿，2011，6（9）：18-20.
[9] 王蓓蕾，张瑞，刘妍，等.化学药物诱导的大鼠急性肾损伤模型中肾损伤分子-1表达的研究[J].天津医药，2012，40（2）：138-140.
[10] 周芳芳，罗群，兰凯.KIM-1、NGAL和IL-18联合检测在大鼠缺血再灌注急性肾损伤早期诊断中的意义[J].浙江医学，2010，32（8）：1202-1204.
[11] Solling C，Christensen AT，Kraq S，et al.Erythropoitin administration is associated with short-term improvement in glomerular filtration rate after ischemia reperfusion injury[J].Acta Anaesthesiol Scand，2011，55（7）：185-195.
[12] Kakavas S，Demestiha T，Vasileiou P，et al.Erythropoetin as a novel agent with pleiotropic effects against acute lung injury[J].Eur J Clin Pharmacol，2011，67（5）：1-9.
[13] 张丽君.乌司他丁联合甲基泼尼松龙对重症急性胰腺炎大鼠AMS、IL-6及TNF-α的影响[J].中国医药科学，2013，3（17）：38-40.
[14] 廖锵云，吴晓健，容咏新，等.尼莫地平防治危重烧伤脓毒症的疗效分析[J].中国医药科学，2012，2（6）：56-57.
[15] 应斌宇，孙来芳，程碧环，等.乌司他丁对创伤弧菌脓毒血症实验大鼠细胞因子的影响和意义[J].实用医学杂志，2004，20（4）：362-364.
（收稿日期：2013-12-24）
[关键词] 乌司他丁；脓毒症；急性肾损伤；尿相关指标
[中图分类号] R96 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）05-25-04
脓毒症并发急性肾损伤（AKI）的发病率为19%～23%，当脓毒症并发急性肾损伤（AKI）时，不仅给有效干预手段带来困难，增加患者死亡率，而且耗费巨大的医疗资源和巨额医疗费用，因此，及早防治脓毒症并发急性肾损伤，保护肾功能意义重大[1]。乌司他丁（UTI）是从尿中分离纯化出来的一种糖蛋白，具有清除自由基、抑制炎症介质释放、改善微循环衰竭状态，抑制蛋白质分解代谢亢进，以及多种蛋白酶活性等药理作用，对多脏器损伤有
保护作用[2-4]。本研究通过盲肠结扎穿孔术 （CLP）[5]建立脓毒症大鼠AKI模型，观察乌司他丁对脓毒症所致AKI的肾脏保护作用及其机制，为临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要材料和仪器
注射用乌司他丁10万U/支（广东天普生化医药股份有限公司，H19990134）；肾损伤分子1（KIM-1） ELISA试剂盒（美国R&D公司）、白细胞介素18（IL-18） ELISA试剂盒（武汉博士德公司）和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 （NGAL） ELISA试剂盒（上海蓝基生物有限公司）。
1.2 实验动物和分组
SD健康雄性大鼠55只，清洁级，10～12周，体质量200～250g，由潍坊医学院动物饲养室提供，适应性喂养1周，实验大鼠按隨机化原则分成3组：（1）正常对照组（n=5）：尾静脉推注生理盐水2mL；（2） 模型组（n=25）：行CLP；（3）乌司他丁治疗组（n=25）：行CLP后即刻尾静脉推乌司他丁10万U/kg；模型组、乌司他丁治疗组，再随机分为5个时间点（1、6、12、24、48h），每组每时间点各5只，术后均补充生理盐水3mL/100g抗休克。
1.3 动物模型制备
实验前禁食12h，手术组采用经典的CLP复制脓毒症AKI模型，即用10%水合氯醛0.3mL/100g腹腔麻醉，无菌条件下沿腹中线切开长约2cm，分离、结扎盲肠，在盲端肠壁用12号针穿刺2次，留置1条长1cm宽2 mm、两头贯穿盲肠的橡皮片，挤出少许粪便，将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁，编号，清醒后转入代谢笼内自由进水、进食。术毕补充生理盐水3mL/100g，术后自由饮食水。
1.4 留取标本
从术后腹壁缝合结束开始计时，分别于1、6、12、24、48h取材，下腔静脉抽血5mL，离心（3000 r/min）15min，取血清于-20℃保存，待测Scr、BUN；膀胱分离，膀胱穿刺收集尿标本于-20℃保存，待测KIM-1、IL-18、NGAL。
1.5 指标检测
采用Roche Cobas 8000全自动生化免疫分析仪（德国Roche公司）测定Scr、Urea。尿液标本均采用Thermo MK3（北京长弓科技有限公司）酶联免疫分析（ELISA）法检测KIM-1、IL-18和NGAL。
1.6 统计学处理
采用SPSS17.0对数据进行分析，计量资料用（）表示，应用独立样本t检验进行数据处理，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般状态
模型组大鼠病态明显，蜷缩，活动减少，少食或拒食，呼吸明显加快，反应迟钝，尿量减少等。与模型组相比，乌司他丁治疗组大鼠一般情况病态表现较轻，但较正常对照组差。
2.2 大鼠肾功能的变化
CLP术后6h，两组大鼠Scr、Urea的浓度开始升高，24h达高峰，48h开始下降，均显著高于对照组（P<0.05）。乌司他丁治疗组12、24、48h较模型组相应时间点Scr、Urea均显著低，差异均有统计学意义（P<0.05）；乌司他丁治疗组大鼠48h时Scr、Urea的浓度明显回落，但仍然高于对照组（P<0.05）。见表1～2。
2.3 两组大鼠尿KIM-1、NGAL、IL-18含量的变化
CLP术后两组大鼠尿KIM-1、NGAL、IL-18均于1h开始明显升高，12h达高峰，24h，48h下降，均显著高于对照组（P<0.05）。乌司他丁治疗组6h，12h，24h，48h较模型组相应时间点尿KIM-1、NGAL、IL-18含量显著低，差异均有统计学意义（P<0.05）；乌司他丁治疗组大鼠48h时尿KIM-1、NGAL、IL-18含量回落显著，但仍高于对照组（P<0.05）。见表3～5。
3 讨论
脓毒症时，肾脏的内皮细胞不仅被激活，产生炎性因子，同时也是炎性因子首要攻击的靶细胞之一[5-7]。在临床实践中发现，脓毒症一旦并发肾脏损害，治疗难度明显增加，而且耗费巨大的医疗资源和巨额医疗费用。因此，及早防治脓毒症并发急性肾损伤，保护肾功能意义重大[8-9]。 目前对急性肾损伤的检测，传统采用血清肌酐、尿素来评价，但该项指标的变化，出现升高较晚，很多研究证实，在大鼠AKI模型建立后6h开始升高，24h才达到高峰，48h开始下降，与KIM-1相比要晚[10]。本研究发现，CLP术后6h，两组大鼠Scr、Urea的浓度开始升高，24h达高峰，48h开始下降，与国内外报道相似[7-10]。
KIM-1是一种新的I型跨膜蛋白，参与肾小管上皮组织形态和功能的恢复，但在AKI后呈现高水平表达，并可在尿中检测出，在正常肾组织中表达微弱。国内外曾有学者研究急性肾损伤大鼠模型的尿KIM-1水平在诱导后第一天时均较诱导前的基线水平有3～5倍的升高，明显早于其他传统检测指标的改变，可以作为急性肾衰竭患者不良临床后果的预测指标[8，10，11]。本研究发现，两组大鼠CLP术后大鼠尿KIM-1于1h开始明显升高，12h达高峰，24、48h下降，均显著高于对照组，与相关报道类似[8，10，11]。
IL-18被认为与脓毒症时脏器功能受损关系密切，IL-18能促进细胞凋亡基因如Fasl的表达及降低抑制凋亡基因Bcl-2的表达发挥促凋亡作用，导致免疫功能紊乱，促进脏器功能损伤。曾有研究显示，在小鼠肾缺血性损伤模型中，IL-18在Caspase-1作用下被激活，激活后IL-18可裂解为成熟形式释放入尿，并可在尿中被检测出，目前经常选用的评价机体炎性反应程度和治疗效果的指标[2，7，10，12]。本研究结果发现，CLP术后大鼠尿IL-18于1h开始明显升高，12h达高峰，24h，48h下降，均显著高于对照组，与相关报道相似[2，7，12]。表明脓毒症大鼠急性肾损伤的发生发展，可能与炎症介质的释放有关。
NGAL是一种分泌性蛋白，研究表明，NGAL在正常肾组织中呈低水平表达，但在肾缺血/再灌注损伤和顺铂诱导小鼠肾损伤模型中，损伤后3h时的尿液中即可检测到NGAL，明显早于尿NAG、β2微球蛋白及Scr的改变，发现术后2h时尿NGAL水平与AKI程度相关，是AKI独立预测因子，也是目前基础实验中经常选用的评价急性肾功能损伤的指标[2，4，10]。本研究发现，CLP术后大鼠尿NGAL、于1h开始明显升高，12h达高峰，24、48h下降，均显著高于对照组，与有报道升高提前[2，7，8，10]，可能与本实验在制作模型时大鼠的选择，观察时间分段不一有关。
乌司他丁（UTI）是从尿中分离纯化出来的一种糖蛋白，具有稳定细胞膜及细胞亚膜、稳定溶酶体膜抑制溶酶体释放、清除自由基、抑制炎症介质释放、改善微循环衰竭状态，抑制蛋白质分解代谢亢进，以及多种蛋白酶活性等药理作用，并对多脏器损伤有保护作用[2-4]。本研究结果发现，乌司他丁治疗组12、24、48h较模型组相应时间点Scr、Urea均显著低；乌司他丁治疗组6、12、24、48h较模型组相应时间点尿KIM-1、NGAL、IL-18含量显著低，与国内外报道相似[2-4，13-15]。乌司他丁可能因减轻中性粒细胞的局部浸润，抑制炎症介质释放等机制对急性肾损伤大鼠腎功能起到保护作用。
本研究通过CLP复制脓毒症急性肾损伤模型，经乌司他丁治疗，显示了很好的肾脏保护作用，可能通过清除自由基、抑制炎症介质释放等机制，达到对脓毒症急性肾损伤大鼠肾脏起到保护作用。
[参考文献]
[1] Yohannes S，Chawla LS.Evolving practices in the management of acute kidney injury in the ICU [J].Clin Nephrol，2009，71（16）：602-607.
[2] 刘娇，陈德昌，周青山.乌司他丁对脓毒症急性肾损伤大鼠肾脏NOD1受体和血IL-18水平的影响[J].临床外科杂志，2013，21（9）：691-693.
[3] 王虹，刘贵建，刘锦丽，等.乌司他丁对老年多器官功能障碍综合征器官功能的保护作用[J].中国实用内科学杂志，2007，27（5）：242-244.
[4] Nesek V，Rasic Z，Kos J，et al.Puninotransfersses after experimental pneumoperitoneum indogs [J].Acta Anaesthesiol Seand，2004，48（7）：862-866.
[5] 桑珍珍，许云，盛英杰，等.重组人红细胞生成素对脓毒症大鼠肾脏的保护作用[J].中华肾脏病杂志，2012，28（12）：961-964.
[6] 孟建忠，郭爱华，李丹丹，等.盐酸法舒地尔防治脓毒症大鼠急性肾损伤的实验研究[J].生物医学工程研究，2010，29（3）：197-201.
[7] 任延波.脓毒血症时肾脏炎症因子的变化：以大鼠为实验动物的临床研究[J].中国急救复苏与灾害医学杂志，2008，3（10）：608-710.
[8] 李锦艳，刘虹，辛小梅.内毒素致大鼠急性肾损伤早期NGAL和KIM-1变化[J].中国医疗前沿，2011，6（9）：18-20.
[9] 王蓓蕾，张瑞，刘妍，等.化学药物诱导的大鼠急性肾损伤模型中肾损伤分子-1表达的研究[J].天津医药，2012，40（2）：138-140.
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[11] Solling C，Christensen AT，Kraq S，et al.Erythropoitin administration is associated with short-term improvement in glomerular filtration rate after ischemia reperfusion injury[J].Acta Anaesthesiol Scand，2011，55（7）：185-195.
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[13] 张丽君.乌司他丁联合甲基泼尼松龙对重症急性胰腺炎大鼠AMS、IL-6及TNF-α的影响[J].中国医药科学，2013，3（17）：38-40.
[14] 廖锵云，吴晓健，容咏新，等.尼莫地平防治危重烧伤脓毒症的疗效分析[J].中国医药科学，2012，2（6）：56-57.
[15] 应斌宇，孙来芳，程碧环，等.乌司他丁对创伤弧菌脓毒血症实验大鼠细胞因子的影响和意义[J].实用医学杂志，2004，20（4）：362-364.
（收稿日期：2013-12-24）