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摘 要：该研究提取了95%酒精保存的病虾组织（鳃、肌肉、表皮、附肢和复眼）的基因组总DNA，并进行了对虾白斑综合征病毒的PCR检测。琼脂糖凝胶电泳结果显示，病虾组织（鳃、肌肉、表皮、附肢和复眼）有轻微的跑带现象，鳃和肌肉比表皮、附肢和复眼的基因组总DNA电泳条带亮。PCR检测结果发现，对虾不同组织的阳性检出率高低顺序如下：鳃>肌肉=表皮>附肢>复眼。研究结果说明，鳃和肌肉可作为对虾白斑综合征病毒PCR检测的合适部位。
关键词：对虾白斑综合征病毒；PCR；组织特异性
中图分类号 S945 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）13-0132-02
对虾白斑综合症病毒（White spot syndrome virus，WSSV），属线头病毒科（Nimaviridae）白斑病毒属（Whispovirus）。该病毒曾被误以为杆状病毒，曾被称为皮下及造血坏死杆状病毒等[1]。对虾白斑综合病毒可以引起对虾严重的传染病-白斑综合征（俗称白斑病），20世纪90年代以来一直严重威胁着全世界对虾的养殖安全。该病毒诱发疾病的特点是发病急、发病率高、死亡速度快。病虾停止摄食，部分濒死虾甲壳出现白色斑点，白斑综合征因此得名。世界动物卫生组织（OIE）将其列为强制通报疫病，我国将其列为一类动物疫病[1]。近年来，随着养殖环境的恶化，对虾病毒性疾病频繁暴发，严重影响了对虾养殖业的健康发展。
对虾养殖是广东省沿海地区的一个重要产业，由于WSSV致病性强、危害性大、流行范围广，建立特异、敏感、快速的检测系统极为重要。WSSV检测方法有多种，如现场快速诊断、常规组织学、电镜、免疫学、PCR和原位杂交等。PCR具有特异性和敏感性都很高的特点，是检测WSSV的重要手段。因此，本文对PCR检测对虾白斑综合征病毒的组织特异性进行分析，为实现对虾养殖中对白斑综合征病毒的监控打下基础。
1 材料与方法
1.1 病料 病虾取自广东省江门市对虾养殖场，病虾为疑似白斑综合症、濒死的南美白对虾，用95%乙醇保存，运回实验室用于检测。
1.2 试剂和引物 Tissue DNA Kit D3396购自美国OMEGA公司；Easy PureTM Quick Gel Extraction Kit和Easy PureTM Plasmid MiniPrep Kit购自北京全式金生物技术有限公司；Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、10×buffer、氯化镁（25mmol/L）和电泳样品缓冲液均购自TaKaRa公司；引物由上海生物工程有限公司合成（表1）。
1.4 基因组总DNA的检测 将6μL基因组总DNA和2μL电泳样品缓冲液混匀后，加入凝胶孔中，5V/cm电泳约30min，用凝胶成像仪拍照并判断结果。
1.5 PCR鉴定 PCR反应总体积为100μL，其中含10×buffer 10μL、dNTP 2μL、氯化镁10μL、引物F1和R1各2.5μL、灭菌双蒸水62μL和待测样品10μL。将以上反应混合液混匀后稍离心，设置反应条件为：94℃预变性4min，然后94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min，30个循环；72℃延伸10min，最后4℃保温。同时设立阳性、阴性和空白对照。取反应产物5μL于含有溴化乙锭的0.8%琼脂糖凝胶。第一次PCR后，如结果为阳性，根据阳性的强弱作10～1000稀释，如结果为阴性，则不作稀释，取10μL作为第二次PCR反应的模板。同时设立阳性、阴性和空白对照。按照1.6分别加入反应组分及引物F2和R2各2.5μL，进行第二次PCR。
1.6 琼脂糖电泳 将6μL样品和2μL电泳样品缓冲液混匀后，加入凝胶孔中，5V/cm电泳15～30min，用凝胶成像仪拍照并判断结果。第一次PCR扩增，阳性对照会得到一条大小1447bp的DNA片段，阴性和空白对照没有该核酸条带，第二次PCR后，阳性对照会得到一条大小941bp的DNA片段，阴性和空白对照没有该核酸条带。待测样品2次PCR均能得到和阳性对照同样大小的DNA片段，送上海生物工程有限公司測序，并与NCBI上的对虾白斑病毒序列进行比对，序列相似性在98%以上判为阳性；若两次PCR均无目的带或测序不对者判为阴性。
2 结果与分析
2.1 基因组总DNA的检测结果 为了检测组织提取的基因组总DNA降解情况，将提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示鳃、肌肉、表皮、附肢和复眼都有轻微的跑带现象，鳃和肌肉比表皮、附肢和复眼的基因组总DNA条带亮。
2.2 PCR检测结果 应用上述方法对50尾病虾的不同组织进行PCR检测，凝胶电泳和测序结果显示，鳃的阳性检出率为98%；肌肉和表皮的阳性检出率均为90%；附肢的阳性检出率为76%；复眼的阳性检出率为70%（表2）。
3 讨论
用凝胶电泳对不同组织提取的基因组总DNA质量进行检测，结果发现鳃、肌肉、表皮、附肢和复眼都有轻微的跑带现象，鳃和肌肉比表皮、附肢和复眼的基因组总DNA条带亮。试验中存在跑带现象，这说明用95%乙醇保存的样品基因组总DNA有轻微降解。用液氮保存样品，基因组总DNA降解最少。然而，大容积液氮罐在野外取样中携带不便，存在气体外泄、人员冻伤等隐患，小容积液氮罐气体容易挥发，保持时间短。因此液氮冻存不适用于长途野外样品采集工作。95%乙醇溶液配制简单，携带方便，是较佳的野外取样保存方法。
本次研究中发现，对虾不同组织的阳性检出率高低顺序如下：鳃>肌肉=表皮>附肢>复眼。有研究指出WSSV先感染宿主血细胞，再通过血液循环将病毒粒子传播到宿主体内的其他组织[2]。WSSV感染的细胞主要分布在外胚层和中胚层起源的组织，如鳃、表皮、肌肉、前肠、后肠、胃、性腺、淋巴组织、心脏、触角腺以及神经系统的相关细胞等。由于甲壳动物特殊的摄食和呼吸方式，水中的病毒粒子可以经鳃部感染宿主，而鳃也被公认是WSSV感染较严重的部位。在本次研究中，复眼的阳性检出率最低。Lo等[3]对带复眼的眼柄进行PCR检测，结果为阴性，只有去除复眼的眼柄才为阳性，因此他推测对虾的复眼可能含有某种抑制剂，导致结果出现假阴性。
通过本研究，建议在野外可用95%乙醇保存对虾白斑综合征病料样品，鳃和肌肉可作为WSSV PCR检测的合适部位。
参考文献
[1]陈爱平，江育林，钱冬，等.白斑综合征[J].中国水产，2010（10）：64-65.
[2]Di Leonardo V A，Bonnichon V，Roch P，et al.Comparative WSSV infection routes in the shrimp genera Marsupenaeus and Palaemon[J].Journal of Fish Diseases，2005，28（9）：565-569.
[3]Lo C F，Leu J H，Ho C H，et al.Detection of baculovirus associated with white spot syndrome（WSBV）in penaeid shrimps using polymerase chain reaction[J].Diseases of Aquatic Organism，1996，25：133-141. （责编：张宏民）
关键词：对虾白斑综合征病毒；PCR；组织特异性
中图分类号 S945 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）13-0132-02
对虾白斑综合症病毒（White spot syndrome virus，WSSV），属线头病毒科（Nimaviridae）白斑病毒属（Whispovirus）。该病毒曾被误以为杆状病毒，曾被称为皮下及造血坏死杆状病毒等[1]。对虾白斑综合病毒可以引起对虾严重的传染病-白斑综合征（俗称白斑病），20世纪90年代以来一直严重威胁着全世界对虾的养殖安全。该病毒诱发疾病的特点是发病急、发病率高、死亡速度快。病虾停止摄食，部分濒死虾甲壳出现白色斑点，白斑综合征因此得名。世界动物卫生组织（OIE）将其列为强制通报疫病，我国将其列为一类动物疫病[1]。近年来，随着养殖环境的恶化，对虾病毒性疾病频繁暴发，严重影响了对虾养殖业的健康发展。
对虾养殖是广东省沿海地区的一个重要产业，由于WSSV致病性强、危害性大、流行范围广，建立特异、敏感、快速的检测系统极为重要。WSSV检测方法有多种，如现场快速诊断、常规组织学、电镜、免疫学、PCR和原位杂交等。PCR具有特异性和敏感性都很高的特点，是检测WSSV的重要手段。因此，本文对PCR检测对虾白斑综合征病毒的组织特异性进行分析，为实现对虾养殖中对白斑综合征病毒的监控打下基础。
1 材料与方法
1.1 病料 病虾取自广东省江门市对虾养殖场，病虾为疑似白斑综合症、濒死的南美白对虾，用95%乙醇保存，运回实验室用于检测。
1.2 试剂和引物 Tissue DNA Kit D3396购自美国OMEGA公司；Easy PureTM Quick Gel Extraction Kit和Easy PureTM Plasmid MiniPrep Kit购自北京全式金生物技术有限公司；Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、10×buffer、氯化镁（25mmol/L）和电泳样品缓冲液均购自TaKaRa公司；引物由上海生物工程有限公司合成（表1）。
1.4 基因组总DNA的检测 将6μL基因组总DNA和2μL电泳样品缓冲液混匀后，加入凝胶孔中，5V/cm电泳约30min，用凝胶成像仪拍照并判断结果。
1.5 PCR鉴定 PCR反应总体积为100μL，其中含10×buffer 10μL、dNTP 2μL、氯化镁10μL、引物F1和R1各2.5μL、灭菌双蒸水62μL和待测样品10μL。将以上反应混合液混匀后稍离心，设置反应条件为：94℃预变性4min，然后94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min，30个循环；72℃延伸10min，最后4℃保温。同时设立阳性、阴性和空白对照。取反应产物5μL于含有溴化乙锭的0.8%琼脂糖凝胶。第一次PCR后，如结果为阳性，根据阳性的强弱作10～1000稀释，如结果为阴性，则不作稀释，取10μL作为第二次PCR反应的模板。同时设立阳性、阴性和空白对照。按照1.6分别加入反应组分及引物F2和R2各2.5μL，进行第二次PCR。
1.6 琼脂糖电泳 将6μL样品和2μL电泳样品缓冲液混匀后，加入凝胶孔中，5V/cm电泳15～30min，用凝胶成像仪拍照并判断结果。第一次PCR扩增，阳性对照会得到一条大小1447bp的DNA片段，阴性和空白对照没有该核酸条带，第二次PCR后，阳性对照会得到一条大小941bp的DNA片段，阴性和空白对照没有该核酸条带。待测样品2次PCR均能得到和阳性对照同样大小的DNA片段，送上海生物工程有限公司測序，并与NCBI上的对虾白斑病毒序列进行比对，序列相似性在98%以上判为阳性；若两次PCR均无目的带或测序不对者判为阴性。
2 结果与分析
2.1 基因组总DNA的检测结果 为了检测组织提取的基因组总DNA降解情况，将提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示鳃、肌肉、表皮、附肢和复眼都有轻微的跑带现象，鳃和肌肉比表皮、附肢和复眼的基因组总DNA条带亮。
2.2 PCR检测结果 应用上述方法对50尾病虾的不同组织进行PCR检测，凝胶电泳和测序结果显示，鳃的阳性检出率为98%；肌肉和表皮的阳性检出率均为90%；附肢的阳性检出率为76%；复眼的阳性检出率为70%（表2）。
3 讨论
用凝胶电泳对不同组织提取的基因组总DNA质量进行检测，结果发现鳃、肌肉、表皮、附肢和复眼都有轻微的跑带现象，鳃和肌肉比表皮、附肢和复眼的基因组总DNA条带亮。试验中存在跑带现象，这说明用95%乙醇保存的样品基因组总DNA有轻微降解。用液氮保存样品，基因组总DNA降解最少。然而，大容积液氮罐在野外取样中携带不便，存在气体外泄、人员冻伤等隐患，小容积液氮罐气体容易挥发，保持时间短。因此液氮冻存不适用于长途野外样品采集工作。95%乙醇溶液配制简单，携带方便，是较佳的野外取样保存方法。
本次研究中发现，对虾不同组织的阳性检出率高低顺序如下：鳃>肌肉=表皮>附肢>复眼。有研究指出WSSV先感染宿主血细胞，再通过血液循环将病毒粒子传播到宿主体内的其他组织[2]。WSSV感染的细胞主要分布在外胚层和中胚层起源的组织，如鳃、表皮、肌肉、前肠、后肠、胃、性腺、淋巴组织、心脏、触角腺以及神经系统的相关细胞等。由于甲壳动物特殊的摄食和呼吸方式，水中的病毒粒子可以经鳃部感染宿主，而鳃也被公认是WSSV感染较严重的部位。在本次研究中，复眼的阳性检出率最低。Lo等[3]对带复眼的眼柄进行PCR检测，结果为阴性，只有去除复眼的眼柄才为阳性，因此他推测对虾的复眼可能含有某种抑制剂，导致结果出现假阴性。
通过本研究，建议在野外可用95%乙醇保存对虾白斑综合征病料样品，鳃和肌肉可作为WSSV PCR检测的合适部位。
参考文献
[1]陈爱平，江育林，钱冬，等.白斑综合征[J].中国水产，2010（10）：64-65.
[2]Di Leonardo V A，Bonnichon V，Roch P，et al.Comparative WSSV infection routes in the shrimp genera Marsupenaeus and Palaemon[J].Journal of Fish Diseases，2005，28（9）：565-569.
[3]Lo C F，Leu J H，Ho C H，et al.Detection of baculovirus associated with white spot syndrome（WSBV）in penaeid shrimps using polymerase chain reaction[J].Diseases of Aquatic Organism，1996，25：133-141. （责编：张宏民）