探讨二氢叶酸还原酶（DHFR）基因表达上调对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞顺铂耐药的影响。
方法构建携带DHFR基因的重组慢病毒载体（即重组载体DHFR-pWPI），利用脂质体lipofectamine 2000将其转染至卵巢癌细胞系SKOV3细胞中。实验分为3组：转染组（转染重组载体DHFR-pWPI质粒）、阴性对照组（转染慢病毒载体pWPI质粒）、空白对照组（未转染任何质粒）。（1）蛋白印迹（western blot）法检测3组SKOV3细胞中DHFR蛋白的表达；（2）流式细胞仪检测3组SKOV3细胞经不同浓度（2.5、5.0、10.0、20.0 μg/ml）顺铂作用不同时间（24、48、72 h）后的细胞凋亡率，以及经3组细胞各自的50％抑制浓度（IC50；分别为6.0、4.0、4.9 μg/ml，下同）的顺铂作用不同时间（24、48、72 h）后的细胞周期比例；（3）高效液相色谱法检测3组SKOV3细胞经不同浓度（4.0、6.0、8.0 μg/ml）顺铂作用不同时间（24、48 h）后其细胞内顺铂浓度的变化；（4）透射电镜观察3组SKOV3细胞经各自的IC50的顺铂作用不同时间（24、48、72 h）后细胞超微结构的变化。
结果本研究成功构建携带DHFR基因的重组载体DHFR-pWPI并转染入SKOV3细胞。（1）western blot法检测显示，转染组细胞中DHFR蛋白表达水平为10.280±0.009，明显高于阴性对照组及空白对照组（分别为2.050±0.003、3.480±0.003；P< 0.01）。（2）流式细胞仪检测显示，不同浓度（2.5、5.0、10.0、20.0 μg/ml）的顺铂作用24、48 h后，转染组细胞凋亡率均明显低于阴性对照组和空白对照组（P<0.05）；而顺铂浓度为5.0、10.0 μg/ml作用72 h后，转染组细胞凋亡率则明显高于阴性对照组和空白对照组（P<0.05）。3组细胞经各自IC50的顺铂作用24、48 h时，其细胞均以G0/G1期细胞为主，且转染组G0/G1期细胞比例明显高于阴性对照组和空白对照组（P<0.05）；而作用72 h时，3组细胞均以G2/M、S期细胞为主，且转染组S期细胞比例明显高于阴性对照组和空白对照组（P<0.01），G2/M期细胞比例明显低于阴性对照组和空白对照组（P<0.01）。（3）高效液相色谱法检测显示，顺铂浓度为4.0 μg/ml作用24、48 h后，以及顺铂浓度为6.0 μg/ml作用24 h后，转染组细胞内的顺铂浓度均明显低于阴性对照组和空白对照组（P<0.01）；而顺铂浓度为6.0 μg/ml作用48 h以及8.0 μg/ml的顺铂作用24、48 h后，转染组细胞内的顺铂浓度均明显高于阴性对照组和空白对照组（P<0.05）。（4）透射电镜下观察，3组细胞经各自IC50的顺铂作用24、48 h后，转染组SKOV3细胞的微丝聚集，线粒体数量及结构改变明显，而空白对照组及阴性对照组细胞微丝少见，线粒体数量减少，但结构改变不明显；3组细胞均出现扩张的内质网，正常的细胞器少见。顺铂作用72 h后，转染组细胞未见微丝，核膜几乎完全消失，胞质内有白色囊状物质，线粒体结构基本消失，大部分细胞濒临死亡；而空白对照组及阴性对照组细胞可见微丝排列紊乱，核膜部分消失，核糖体大量聚集，进入明显的坏死阶段。
结论本研究采用慢病毒载体系统成功构建了携带DHFR基因的重组慢病毒载体，DHFR基因表达上调后卵巢癌SKOV3细胞的耐药性增加，其耐药性增加可能与微丝的聚集及线粒体的改变有一定的联系。