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[摘 要] 目的：探讨p16蛋白在骨肉瘤中的表达及临床意义。方法：应用SP免疫组化法检测P16蛋白在40例骨肉瘤及10例正常骨中的表达，分析P16蛋白表达和骨肉瘤病理分级、临床分期及不同临床病理因素间的关系。结果：p16在骨肉瘤中平均表达为60%，其表达与骨肉瘤的组织学分级、临床分期显著相关（P<0.05）。结论：P16蛋白在骨肉瘤的形成和发展中起不同程度的作用，其表达对骨肉瘤组织学分级、恶性进展和预后判断具有重要的价值。
[关键词] 骨肉瘤；P16蛋白；免疫组化
Expression of P16 protein in osteosarcoma
and its clincal Significance
[Abstract] Objective： To investigate the P16 protein expression in osteosarcoma and its clincal Significance. Methods Using immunohistochemistry test ( S-P methods) ， we examined the exp ressions of p16 p rotein in 40 cases with osteosarcoma ， 10 cases with normal bone as control group. It was compared in different histologic grade， clinical stage， Results The expression of p16 protein was 60% in osteosarcoma . The positive rate of P16 in osteosarcoma was significantly lower than that in normal bone tissue (P＜0.05)， and relate to histologic grade and clinical stage.Conclusion P16 protein expression is closely related to tumorigenesis of osteosarcoma， suggesting that P16 protein may serve as a valuable marker for histologic grade，m alignant development and prognostic assessment of osteosarcoma.
[Key Words] osteosarcoma P16 protein immunohistochemistry
新近发现的肿瘤抑制基因中p16能在人类多种肿瘤及细胞系中有失活和突变作用，引起相应蛋白的表达缺失，导致肿瘤细胞的异常增殖。p16蛋白的研究对于骨肿瘤的诊断、鉴别诊断和判断预后具有广阔的前景。我们采用免疫组织化学S-P法分别观察在40例骨肉瘤组织中p16蛋白提示的表达情况，分析了p16蛋白与骨肉瘤的组织学分级、临床分期及预后的关系。
1 材料和方法
1.1材料
40例骨肉瘤选自1988～2009年本院存档病例。骨肉瘤男性24例，女性18例，男女比1.5∶1，年龄11～57岁，平均年龄20岁，最高峰是11～21岁25例。骨肉瘤参照Price分级法；参照Enneking标准划分临床分期，低生存组为<1年生存期的患者，共计9例（22.5%），>3年者为高生存组，14例（35%）。随访全部病例。对照研究组选用10例正常骨组织。
1.2方法
免疫组织化学法将10％福尔马林固定、石蜡包埋的骨肉瘤组织制成4～5μm切片，常规脱蜡，浸入0.01mol/L、pH为6.0的枸橼酸盐缓冲液内，微波炉抗原修复10分钟，温度为92～98℃。用SP法进行免疫组织化学染色。P16试剂盒系北京中杉生物试剂公司提供的Zymed公司产品。
1.3结果判定
P16蛋白免疫组织化学染色阳性反应为棕黄色和（或）棕褐色颗粒，P16蛋白定位于细胞核或（和）细胞浆上，自每张切片选10个高倍视野（×400）观察阳性细胞与细胞总数的比例关系，无表达为阴性（-）；表达≤50%为阳性（+）；>51%为强阳性（++）。
1.4统计学处理
P16蛋白表达与骨肉瘤临床病理的关系，应用Pearsonx2检验进行统计学分析，以中位数将P16染色结果分为高表达与低表达两组，统计两组骨肉瘤存活期，并行Long-rank检验。
2 结果
2.1 P16蛋白免疫组化染色结果
P16阳性产物呈棕褐色细颗粒状，主要位于胞核，部分可见于胞浆内。阳性细胞呈弥漫或灶性分布。40例骨肉瘤免疫组化染色结果阴性16例（40.00%），阳性24例（60.00%），见表1。正常骨、骨肉瘤边缘反应性新生骨未见着色。统计学分析，Ⅰ级与Ⅱ级、Ⅰb与Ⅱa间差异具有显著性（P<0.05），Ⅰ级与Ⅲ级、Ⅰb与Ⅱb、Ⅲa间差异具有显著性（P<0.01）。
表1 P16蛋白在骨肉瘤中的表达
2.2 P16蛋白表达与骨肉瘤主要临床病理资料间的关系
P16蛋白表达与骨肉瘤主要临床病理资料间的关系，见表2。P16蛋白表达在未复发组较复发组高（P<0.01），P16蛋白表达在骨肉瘤肿瘤直径小于10cm较大于或等于10cm高（P<0.01），且具有统计学差异。P16表达在性别、年龄、部位等方面都未显示统计学差异（P>0.05）。
表2 P16蛋白表达与骨肉瘤主要临床病理资料关系
2.3 P16蛋白表达与骨肉瘤病人预后的关系
本组肿瘤P16蛋白LI中位数为50.4%，以此将骨肉瘤分为高表达组和低表达组，long-rank检验。Long-rank检验结果：X2=6.97，两者相差显著（P<0.05），表明P16低表达组骨肉瘤患者的生存期较高表达组显著缩短。 3 讨论
P16是细胞周期中非常重要的调节因子，在多种肿瘤细胞周期增殖和细胞分化调控中起着十分重要的作用[1]。对细胞G1/S期转换有关键调控作用的基因p16蛋白，可抑制细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）4和6[2]。P16蛋白的失活引起G1期缩短，细胞周期加速，特别是DNA在没有修复前过早地进入S期，已经是细胞恶性转化的关键[3]。本研究结果显示：P16蛋白表达在骨肉瘤Ⅰ级与Ⅱ级、Ⅰb与Ⅱa间差异具有显著性（P<0.05），Ⅰ级与Ⅲ级、Ⅰb与Ⅱb期、Ⅲa期间差异具有显著性（P<0.01），说明P16蛋白表达随骨肉瘤组织学分级越高，表达越弱；同时临床分期越晚，其表达越弱。此外，P16蛋白在正常骨组织皆为阳性表达（为100%）。以上结果均提示P16基因的缺失或突变在骨肉瘤的形成或发展中起不同程度的作用。
研究表明，P16基因的突变或缺失与很多肿瘤的发生和发展密切相关[4，5]，那么P16蛋白的表达水平可能影响骨肉瘤的生物学行为[6]。本研究显示，P16蛋白表达在未复发组较复发组高（P<0.01），P16蛋白表达在骨肉瘤肿瘤直径小于10cm较大于或等于10cm高（P<0.01），且具有统计学差异。P16表达在性别、年龄、部位等方面都未显示统计学差异（P>0.05）。表明p16蛋白可作为骨肉瘤分化性标记物，并可能成为判断骨肉瘤复发的有用指标。随访结果显示P16蛋白低表达组骨肉瘤患者的生存期较高表达组显著缩短，表明P16蛋白可能作为判断骨肉瘤预后的一个指标[7]，当然这还需要大量的骨肉瘤随访结果证实。
综上所述，p16作为细胞周期的负性调控因子，其蛋白减少或缺失是骨肉瘤的发生、发展及不良预后的重要指标，对临床具有重要的指导意义。
参考文献：
[1] TutorO， DiazMA， RamirezM， et al. Loss of heterozygosity of p16 correlates with minimal residual disease at the end of the induction therapy in non-high risk childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia[J]. Leuk Res， 2002， 26 (9):817 - 820.
[2]施宗高，周晓燕，许良中等.乳腺癌组织中NOEY2基因的mRNA表达及其与临床病理的关系[J].中华肿瘤杂志，2002，24（5）：475～478.
[3]陈红，姚吉龙，卞度宏等.p27在子宫内膜癌组织中的表达及其临床意义[J].现代妇产科进展，2001，10（3）：176～177.
[4]徐锦屏，章永川，陈汉松，等.p16和p27蛋白在乳腺癌的表达及其意义[J].肿瘤防治志，2009（2）.
[5]王茁，王宪智，王原，等.卵巢癌p16蛋白的表达及其意义[J].肿瘤研究与临床，2009（3）.
[6]郭成学.p16蛋白与软骨肉瘤临床病理特征及预后关系[J].中原医刊，2006（18）.
[7] Gibson SL， Dai CY， Lee HW， et al. Inhibition of colon tumur p rogression and angiogenesis by the Ink4a /Arf locus [J].Cancer Res，2003，63 (4):742-746.
[关键词] 骨肉瘤；P16蛋白；免疫组化
Expression of P16 protein in osteosarcoma
and its clincal Significance
[Abstract] Objective： To investigate the P16 protein expression in osteosarcoma and its clincal Significance. Methods Using immunohistochemistry test ( S-P methods) ， we examined the exp ressions of p16 p rotein in 40 cases with osteosarcoma ， 10 cases with normal bone as control group. It was compared in different histologic grade， clinical stage， Results The expression of p16 protein was 60% in osteosarcoma . The positive rate of P16 in osteosarcoma was significantly lower than that in normal bone tissue (P＜0.05)， and relate to histologic grade and clinical stage.Conclusion P16 protein expression is closely related to tumorigenesis of osteosarcoma， suggesting that P16 protein may serve as a valuable marker for histologic grade，m alignant development and prognostic assessment of osteosarcoma.
[Key Words] osteosarcoma P16 protein immunohistochemistry
新近发现的肿瘤抑制基因中p16能在人类多种肿瘤及细胞系中有失活和突变作用，引起相应蛋白的表达缺失，导致肿瘤细胞的异常增殖。p16蛋白的研究对于骨肿瘤的诊断、鉴别诊断和判断预后具有广阔的前景。我们采用免疫组织化学S-P法分别观察在40例骨肉瘤组织中p16蛋白提示的表达情况，分析了p16蛋白与骨肉瘤的组织学分级、临床分期及预后的关系。
1 材料和方法
1.1材料
40例骨肉瘤选自1988～2009年本院存档病例。骨肉瘤男性24例，女性18例，男女比1.5∶1，年龄11～57岁，平均年龄20岁，最高峰是11～21岁25例。骨肉瘤参照Price分级法；参照Enneking标准划分临床分期，低生存组为<1年生存期的患者，共计9例（22.5%），>3年者为高生存组，14例（35%）。随访全部病例。对照研究组选用10例正常骨组织。
1.2方法
免疫组织化学法将10％福尔马林固定、石蜡包埋的骨肉瘤组织制成4～5μm切片，常规脱蜡，浸入0.01mol/L、pH为6.0的枸橼酸盐缓冲液内，微波炉抗原修复10分钟，温度为92～98℃。用SP法进行免疫组织化学染色。P16试剂盒系北京中杉生物试剂公司提供的Zymed公司产品。
1.3结果判定
P16蛋白免疫组织化学染色阳性反应为棕黄色和（或）棕褐色颗粒，P16蛋白定位于细胞核或（和）细胞浆上，自每张切片选10个高倍视野（×400）观察阳性细胞与细胞总数的比例关系，无表达为阴性（-）；表达≤50%为阳性（+）；>51%为强阳性（++）。
1.4统计学处理
P16蛋白表达与骨肉瘤临床病理的关系，应用Pearsonx2检验进行统计学分析，以中位数将P16染色结果分为高表达与低表达两组，统计两组骨肉瘤存活期，并行Long-rank检验。
2 结果
2.1 P16蛋白免疫组化染色结果
P16阳性产物呈棕褐色细颗粒状，主要位于胞核，部分可见于胞浆内。阳性细胞呈弥漫或灶性分布。40例骨肉瘤免疫组化染色结果阴性16例（40.00%），阳性24例（60.00%），见表1。正常骨、骨肉瘤边缘反应性新生骨未见着色。统计学分析，Ⅰ级与Ⅱ级、Ⅰb与Ⅱa间差异具有显著性（P<0.05），Ⅰ级与Ⅲ级、Ⅰb与Ⅱb、Ⅲa间差异具有显著性（P<0.01）。
表1 P16蛋白在骨肉瘤中的表达
2.2 P16蛋白表达与骨肉瘤主要临床病理资料间的关系
P16蛋白表达与骨肉瘤主要临床病理资料间的关系，见表2。P16蛋白表达在未复发组较复发组高（P<0.01），P16蛋白表达在骨肉瘤肿瘤直径小于10cm较大于或等于10cm高（P<0.01），且具有统计学差异。P16表达在性别、年龄、部位等方面都未显示统计学差异（P>0.05）。
表2 P16蛋白表达与骨肉瘤主要临床病理资料关系
2.3 P16蛋白表达与骨肉瘤病人预后的关系
本组肿瘤P16蛋白LI中位数为50.4%，以此将骨肉瘤分为高表达组和低表达组，long-rank检验。Long-rank检验结果：X2=6.97，两者相差显著（P<0.05），表明P16低表达组骨肉瘤患者的生存期较高表达组显著缩短。 3 讨论
P16是细胞周期中非常重要的调节因子，在多种肿瘤细胞周期增殖和细胞分化调控中起着十分重要的作用[1]。对细胞G1/S期转换有关键调控作用的基因p16蛋白，可抑制细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）4和6[2]。P16蛋白的失活引起G1期缩短，细胞周期加速，特别是DNA在没有修复前过早地进入S期，已经是细胞恶性转化的关键[3]。本研究结果显示：P16蛋白表达在骨肉瘤Ⅰ级与Ⅱ级、Ⅰb与Ⅱa间差异具有显著性（P<0.05），Ⅰ级与Ⅲ级、Ⅰb与Ⅱb期、Ⅲa期间差异具有显著性（P<0.01），说明P16蛋白表达随骨肉瘤组织学分级越高，表达越弱；同时临床分期越晚，其表达越弱。此外，P16蛋白在正常骨组织皆为阳性表达（为100%）。以上结果均提示P16基因的缺失或突变在骨肉瘤的形成或发展中起不同程度的作用。
研究表明，P16基因的突变或缺失与很多肿瘤的发生和发展密切相关[4，5]，那么P16蛋白的表达水平可能影响骨肉瘤的生物学行为[6]。本研究显示，P16蛋白表达在未复发组较复发组高（P<0.01），P16蛋白表达在骨肉瘤肿瘤直径小于10cm较大于或等于10cm高（P<0.01），且具有统计学差异。P16表达在性别、年龄、部位等方面都未显示统计学差异（P>0.05）。表明p16蛋白可作为骨肉瘤分化性标记物，并可能成为判断骨肉瘤复发的有用指标。随访结果显示P16蛋白低表达组骨肉瘤患者的生存期较高表达组显著缩短，表明P16蛋白可能作为判断骨肉瘤预后的一个指标[7]，当然这还需要大量的骨肉瘤随访结果证实。
综上所述，p16作为细胞周期的负性调控因子，其蛋白减少或缺失是骨肉瘤的发生、发展及不良预后的重要指标，对临床具有重要的指导意义。
参考文献：
[1] TutorO， DiazMA， RamirezM， et al. Loss of heterozygosity of p16 correlates with minimal residual disease at the end of the induction therapy in non-high risk childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia[J]. Leuk Res， 2002， 26 (9):817 - 820.
[2]施宗高，周晓燕，许良中等.乳腺癌组织中NOEY2基因的mRNA表达及其与临床病理的关系[J].中华肿瘤杂志，2002，24（5）：475～478.
[3]陈红，姚吉龙，卞度宏等.p27在子宫内膜癌组织中的表达及其临床意义[J].现代妇产科进展，2001，10（3）：176～177.
[4]徐锦屏，章永川，陈汉松，等.p16和p27蛋白在乳腺癌的表达及其意义[J].肿瘤防治志，2009（2）.
[5]王茁，王宪智，王原，等.卵巢癌p16蛋白的表达及其意义[J].肿瘤研究与临床，2009（3）.
[6]郭成学.p16蛋白与软骨肉瘤临床病理特征及预后关系[J].中原医刊，2006（18）.
[7] Gibson SL， Dai CY， Lee HW， et al. Inhibition of colon tumur p rogression and angiogenesis by the Ink4a /Arf locus [J].Cancer Res，2003，63 (4):742-746.