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[摘 要]研究可以提高PCR扩增效率，改善多重PCR多引物检测易产生引物二聚体等的不足，乳化PCR扩增技术检测土样中有代表性的病原菌的反应参数和条件进行研究，改善多重PCR扩增检测易生成引物二聚体等方面的不足，提高PCR扩增效率。
[关键词]gyrB基因 PCR扩增 土壤 典型病原菌
中图分类号：TH113.22 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）23-0082-01
引言
近年来较多研究报道[1]均指出乳化PCR扩增技术可以弥补多重PCR技术的不足，特别是易生成引物二聚体这一不足。利用乳化PCR扩增技术的这一优势，将其与基因芯片的检测技术联用，应用于Y染色体的检测[2]。
1 材料与方法
1.1 土壤样品的采集及预处理
研磨过筛（20目筛），-80°C保存备用。
1.2 供试病原菌菌株
大肠杆菌：ATCC 25922;沙门氏菌：副伤寒沙门氏菌50073、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌ATCC50071;金黄色葡萄球菌：A号ATCC、MHATCC 25923;福氏志贺菌51302。
1.3 主要试剂及试剂盒
主要试剂及试剂盒：span80，tween80，tritonX-100，mineral oil，无水乙醚，Taq DNA聚合酶、dNTP、引物、50bp DNA Ladder、100 bp DNA Ladder（上海生工生物工程技术服务有限公司），琼脂糖（中国惠兴生化试剂有限公司），FastDNA？ SPIN Kit for Soil 试剂盒（MP Biomedicals，Solon，OH，USA）。
1.4 主要仪器
主要仪器：PTC-100 PCR仪（MJ Research，Waltham，MA，USA），高速离心机（上海安亭科学仪器厂），DYY-8B型电泳仪（北京市六一仪器厂），凝胶成像系统（Bio-Rad Laboratories，Segrate，Italy），FastPrepTM FP120核酸提取仪（Bio 101，Carlsbad，CA，USA），Mini-BeadBeater-16TM核酸提取仪（Biospec products，USA）。
1.5 病原菌污染的土壤DNA提取
利用FastDNA？ SPIN Kit for Soil 试剂盒与Mini-BeadBeater-16TM核酸提取仪提取土壤DNA。主要过程参见FastDNA？ SPIN Kit for Soil 试剂盒。
1.6 引物合成
根据致病菌的功能基因phoA、ttrBCA、vicK、virA，合成4对特异性引物（5'to3'）：致病性大肠杆菌序列phoA正向TACAGGTGACTGCGGGCTTATC、phoA反向CTTACCGGGCAATACACTCACTA，622bp;金黄色葡萄球菌vicK1CTAATACTGAAAGTGAGAAACGTA、vicK2TCCTGCACAATCGTACTAAA，289bp;志贺氏菌virA-FCTGCATTCTGG
CAATCTCTTCACA、virA-RTGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCTCC，215bp;沙门氏菌ttrC-13ACT GCC GAT AAATGC ACG TT、ttrB-1CTT TTT TCCGCC
AGT GAA GA，418bp。
1.7 产物电泳检测
电泳检测条件：5μl破乳后的PCR扩增产物混合l 6×上样缓冲液1μ，打入琼脂糖凝胶（2%（w/v））的加样孔中，0.5×TBE缓冲液，200V恒压，电泳时间25-35 min，紫外凝胶成像系统观察结果并进行分析。
2 结果与分析
2.1 优化乳化PCR扩增条件
破乳时改变条件如下：加入40μlNX Buffer，孵化2min（室温），涡旋振荡20秒，12000转离心5min;加入体积比为1：1的乙醚与超纯水混合溶液（现用现配，混合时间为30s），8000转离心2min，去掉油相。电泳结果（图1）：1-8泳道的产物条带是乳化PCR扩增方法，9泳道产物条带是用的常规多重PCR 扩增法，可以看出常规多重PCR扩增产物条带比乳化PCR的要更明亮和清晰，但乳化PCR扩增没有弥散现象，而多重PCR扩增有。
2.2 乳化PCR扩增应用
土壤样品：志贺氏菌和沙门氏菌污染的土壤样品。用乳化PCR扩增检测结果见图2：1-4（乳化PCR）泳道和6-7（多重PCR）泳道均在215bp、418bp处有志贺氏菌、沙门氏菌的目的产物条带。泳道6-7多重PCR扩增产物条带相对更明亮清晰。但随着引物数量的增多，乳化PCR扩增技术的优势越发明显，能有效的弥补多重PCR扩增极其容易产生非特异性扩增、引物二聚体等不足。
3 结论
乳化PCR扩增检测土壤中典型病原菌的反应条件经优化后为：100μl油相，0.1%tween80，0.05%tritonX-100，mineral oil;水相，4μlMg2+2.5mM10×PCR Buffer， 0.25mM dNTP2.5μl，上下游引物各0.5μl，DNA模板1μl，5U taq DNA聚合酶，1.25μl的5%（v/v）DMSO，14.75μl的5μg/μl BSA。将以上水相一滴滴加入100μl的油相中，涡旋振荡（20s），分装至4个PCR管中，放入PCR扩增仪。反应参数为95℃，2min（94℃，10s;50℃，10s;72℃，15s）40cycles;72℃，15s。
破乳方法：向扩增产物中加入NX Buffer40μl，室温孵化2min，涡旋振荡20s，12000rpm离心5min;加入体积比为1：1的无水乙醚与超纯水混合溶液（现用现配），混合30S，8000rpm离心2min，去除残留油相。
有报道在乳化过程中加入磁力搅拌器，可以提高乳化效率，可以应用在未来的研究中[2]。
参考文献
[1]Ge Q Y， Bai Y F， Liu Z B， et al. Detection of fetal DNA in maternal plasma by microarray coupled with emulsions PCR. Clinica Chimica Acta， 2006：82-88.
[2]Ge Q Y， Liu Z B， Bai Y F， et al. Emulsion PCR-based method to detect Y chromosome microdeletions. Analytical Biochemistry， 2007：173-178.
[3]Nakano M， Komatsu J， Matsuura S， et al. Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion. Journal of Biotechnology， 2003：117-124.
作者簡介：
刘燕，江苏苏州，1986.01， 硕士研究生，研究方向环境微生物、环境检测、环境工程、环境影响评价等
[关键词]gyrB基因 PCR扩增 土壤 典型病原菌
中图分类号：TH113.22 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）23-0082-01
引言
近年来较多研究报道[1]均指出乳化PCR扩增技术可以弥补多重PCR技术的不足，特别是易生成引物二聚体这一不足。利用乳化PCR扩增技术的这一优势，将其与基因芯片的检测技术联用，应用于Y染色体的检测[2]。
1 材料与方法
1.1 土壤样品的采集及预处理
研磨过筛（20目筛），-80°C保存备用。
1.2 供试病原菌菌株
大肠杆菌：ATCC 25922;沙门氏菌：副伤寒沙门氏菌50073、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌ATCC50071;金黄色葡萄球菌：A号ATCC、MHATCC 25923;福氏志贺菌51302。
1.3 主要试剂及试剂盒
主要试剂及试剂盒：span80，tween80，tritonX-100，mineral oil，无水乙醚，Taq DNA聚合酶、dNTP、引物、50bp DNA Ladder、100 bp DNA Ladder（上海生工生物工程技术服务有限公司），琼脂糖（中国惠兴生化试剂有限公司），FastDNA？ SPIN Kit for Soil 试剂盒（MP Biomedicals，Solon，OH，USA）。
1.4 主要仪器
主要仪器：PTC-100 PCR仪（MJ Research，Waltham，MA，USA），高速离心机（上海安亭科学仪器厂），DYY-8B型电泳仪（北京市六一仪器厂），凝胶成像系统（Bio-Rad Laboratories，Segrate，Italy），FastPrepTM FP120核酸提取仪（Bio 101，Carlsbad，CA，USA），Mini-BeadBeater-16TM核酸提取仪（Biospec products，USA）。
1.5 病原菌污染的土壤DNA提取
利用FastDNA？ SPIN Kit for Soil 试剂盒与Mini-BeadBeater-16TM核酸提取仪提取土壤DNA。主要过程参见FastDNA？ SPIN Kit for Soil 试剂盒。
1.6 引物合成
根据致病菌的功能基因phoA、ttrBCA、vicK、virA，合成4对特异性引物（5'to3'）：致病性大肠杆菌序列phoA正向TACAGGTGACTGCGGGCTTATC、phoA反向CTTACCGGGCAATACACTCACTA，622bp;金黄色葡萄球菌vicK1CTAATACTGAAAGTGAGAAACGTA、vicK2TCCTGCACAATCGTACTAAA，289bp;志贺氏菌virA-FCTGCATTCTGG
CAATCTCTTCACA、virA-RTGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCTCC，215bp;沙门氏菌ttrC-13ACT GCC GAT AAATGC ACG TT、ttrB-1CTT TTT TCCGCC
AGT GAA GA，418bp。
1.7 产物电泳检测
电泳检测条件：5μl破乳后的PCR扩增产物混合l 6×上样缓冲液1μ，打入琼脂糖凝胶（2%（w/v））的加样孔中，0.5×TBE缓冲液，200V恒压，电泳时间25-35 min，紫外凝胶成像系统观察结果并进行分析。
2 结果与分析
2.1 优化乳化PCR扩增条件
破乳时改变条件如下：加入40μlNX Buffer，孵化2min（室温），涡旋振荡20秒，12000转离心5min;加入体积比为1：1的乙醚与超纯水混合溶液（现用现配，混合时间为30s），8000转离心2min，去掉油相。电泳结果（图1）：1-8泳道的产物条带是乳化PCR扩增方法，9泳道产物条带是用的常规多重PCR 扩增法，可以看出常规多重PCR扩增产物条带比乳化PCR的要更明亮和清晰，但乳化PCR扩增没有弥散现象，而多重PCR扩增有。
2.2 乳化PCR扩增应用
土壤样品：志贺氏菌和沙门氏菌污染的土壤样品。用乳化PCR扩增检测结果见图2：1-4（乳化PCR）泳道和6-7（多重PCR）泳道均在215bp、418bp处有志贺氏菌、沙门氏菌的目的产物条带。泳道6-7多重PCR扩增产物条带相对更明亮清晰。但随着引物数量的增多，乳化PCR扩增技术的优势越发明显，能有效的弥补多重PCR扩增极其容易产生非特异性扩增、引物二聚体等不足。
3 结论
乳化PCR扩增检测土壤中典型病原菌的反应条件经优化后为：100μl油相，0.1%tween80，0.05%tritonX-100，mineral oil;水相，4μlMg2+2.5mM10×PCR Buffer， 0.25mM dNTP2.5μl，上下游引物各0.5μl，DNA模板1μl，5U taq DNA聚合酶，1.25μl的5%（v/v）DMSO，14.75μl的5μg/μl BSA。将以上水相一滴滴加入100μl的油相中，涡旋振荡（20s），分装至4个PCR管中，放入PCR扩增仪。反应参数为95℃，2min（94℃，10s;50℃，10s;72℃，15s）40cycles;72℃，15s。
破乳方法：向扩增产物中加入NX Buffer40μl，室温孵化2min，涡旋振荡20s，12000rpm离心5min;加入体积比为1：1的无水乙醚与超纯水混合溶液（现用现配），混合30S，8000rpm离心2min，去除残留油相。
有报道在乳化过程中加入磁力搅拌器，可以提高乳化效率，可以应用在未来的研究中[2]。
参考文献
[1]Ge Q Y， Bai Y F， Liu Z B， et al. Detection of fetal DNA in maternal plasma by microarray coupled with emulsions PCR. Clinica Chimica Acta， 2006：82-88.
[2]Ge Q Y， Liu Z B， Bai Y F， et al. Emulsion PCR-based method to detect Y chromosome microdeletions. Analytical Biochemistry， 2007：173-178.
[3]Nakano M， Komatsu J， Matsuura S， et al. Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion. Journal of Biotechnology， 2003：117-124.
作者簡介：
刘燕，江苏苏州，1986.01， 硕士研究生，研究方向环境微生物、环境检测、环境工程、环境影响评价等