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【摘 要】本文阐述了哺乳动物转基因技术的研究概况，主要介绍了哺乳动物转基因技术的主要技术环节、哺乳动物转基因技术存在的主要问题及其发展前景。
【关键词】哺乳动物；转基因技术；问题；发展前景
1980年，Gordn等人用显微注射转基因方法获得了两只转基因小鼠。1982年，Palmiter和Brinster用此方法把大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵中，获得体重是对照组2倍的“超级鼠”。[1]从此，哺乳动物转基因技术迅速发展，转基因兔、绵羊、猪等相继问世。哺乳动物转基因技术实现了哺乳动物间遗传物质的交换和重组，已成为分子生物学研究的基本技术，并广泛应用于科学研究的各个领域。哺乳动物转基因技术的主要技术环节介绍如下。
1 目标基因克隆和体外重组[1]
1.1 人工合成
它是用DNA合成仪人工合成小片段碱基序列，一般不超过100个碱基。
1.2 互补DNA的克隆
提取组织中的mRNA，用反转录酶合成cDNA，建cDNA立文库，再克隆目标蛋白的cDNA。
1.3 DNA的克隆
首先通过基因克隆技术获得编码目标蛋白的基因，再把目标基因与表达载体相连接，从而形成一个独立表达的调控单元，再通过扩增和纯化，使DNA达到一定浓度后就可以用于基因导入。
2 外源基因的导入
2.1 DNA显微注射
此方法是借助显微操作仪将在体外构建的目的基因直接注射到处于原核时期的受精卵的原核中，使这种外源基因整合到受体细胞的基因组中，以达到转基因的目的。这种方法效果稳定，但操作复杂，转基因效率低。
2.2 反转录病毒感染法
将外源基因重组到载体转录病毒上，包装成高浓度病毒颗粒，然后去感染受精卵或着床后的胚胎，也可将它们进行单层共培养。这种方法的优点是宿主范围广且呈单一位点单拷贝整合，整合效率高，但載体病毒DNA序列有时会对外源基因在受体中的表达产生影响，并且它的安全问题也令人担忧[4]，不易用于商业性转基因动物[6]。
2.3 胚胎干细胞法
这种方法是用外源基因转化胚胎干细胞，通过筛选，把阳性细胞注入受体动物的囊胚腔[1]或桑椹胚的卵周隙形成嵌合体，它会很快地与受体胚囊的内细胞团聚集在一起，共同参入正常胚泡的发育。这种方法的整合率高，但胚胎干细胞细胞株不易建立，所产生的转基因动物全为嵌合体。目前，研究者们正试图把胚胎干细胞的细胞核移入去核的受精卵中来获得非嵌合体[4]。
2.4 细胞核移植法
首先用外源DNA对培养的体细胞或胚胎干细胞进行转染，然后选阳性细胞作核供体，通过细胞核移植获得基因动物。该方法的应用还依赖于体细胞技术的发展[1]。
此外还有精子载体法、基因枪法、电脉冲法、磷酸钙共沉淀法等其他方法[4]。
3 外源DNA整合、转录与表达的分子检测[1]
3.1 外源DNA整合检测
常用方法是用目标基因的一段序列作引物，用PCR仪扩增目标DNA，再通过电泳初步检测是否含目标基因，最后用Southern杂交检测PCR阳性个体是否含有目标基因，如出现阳性，就可断定转基因为阳性动物。
3.2 外源基因的转录检测
该方法是用Nouthern杂交法对转基因动物某一组织的mRNA进行分析检测，出现阳性则表明外源基因具有转录活性。
3.3 外源基因的表达检测
该方法是检测转基因动物组织中是否含有目的基因编码的外源蛋白质，常用的方法有酶联免疫法、免疫荧光法和Western杂交法。
4 转基因哺乳动物研究面临的问题
4.1 转基因技术存在的主要问题
转基因动物的外源基因经常是随机整合和异常表达的，其整合率与表达率极低，同时，转基因动物的多病、不育以至死亡都制约着转基因动物的开发前景[4]。
4.2 转基因动物的安全性问题
（1）具有某些优势性状的转基因动物可能会对生态平衡以及物种的多样性产生不良影响；（2）转基因动物器官移植可能会增加“人兽共患”病的传播机会；（3）用转基因动物生产的食物有可能使食用者发生过敏反应；（4）转基因动物的研究还将会引发一系列社会伦理问题[6]。
5 哺乳动物转基因技术的发展前景
5.1 哺乳动物转基因技术可用来改良动物品种及其生产性能[6]
我们可以利用转基因技术让外源基因在家畜乳腺中特异性地表达，以此提高奶液的蛋白含量和抗菌能力，降低乳糖含量，使其品质更接近人奶。
5.2 用转基因动物生产药物蛋白[6]
把药用蛋白或营养蛋白质与组织特异性表达调控元件藕联，运用家畜的造血系统或泌乳蛋白生产药用或营养蛋白质，提高畜牧业的经济效益。
5.3 为人类器官移植提供供体
探索用转基因动物的器官作为人类器官移植的供体，为器官的异体移植提供基础，利用此项技术可解决器官移植中供体相对不足的问题。
5.4 建立诊断、治疗人类疾病及新药筛选的动物模型[6，13]
利用此项技术，遗传学家可以精确地失活某些基因（如“knock—out”）或增强修复（如“knock—in”）某些基因的表达，从而制作各种研究和治疗人类疾病的动物模型和新药的筛选模型。
参考文献
[1]岳文斌，张建红.动物繁殖及营养调控[M].北京：中国农业出版社，2004：91-98.
[2]剂谦，朱矗泉.生物安全[M].北京：科学出版社，2001.
[3]刘煮，卢光露.转基因动物技术的研究进展[J].遗传，2001（3）：289-291.
[4]王学慧，刘月学.农业转基因技术的发展概况[J].临沂师范学院学报.2001，23 （4）：68-70.
[5]张穗扎.转基因动植物及其在农业的应用[J].生物学通报，1993，28 （1）：4-5.
[6]程焉平，炳昌.转基因动物的研究与应用[J]松辽学刊（然科学版），2002，（1）：5-7.
[7]张穗扎.转基因动植物及其在农业的应用[J].生物学通报，1993.28（1）：4-5.
[8]程炜中.转基因动物的遗传修饰与应用（上）[M].遗传，1995，17（2）：42-48.
[9]程炜中.转基因动物的遗传修饰与应用（下）[M].遗传，1995，17（3）：46-48.
[10]卢一凡，邓继先，朱鑫泉.转基因动物理论与技术的研究进展[J].生物技术通报，1997（4）：19-20.
[11]贾士荣.转基因植物环境及食品安全性[J].生物工程进展，1997，17（6）：37-42.
[12]John J，Kennely.开发改变乳成分的潜力[J].国外畜牧科技，2001，28（4）：45-47.
[13]瞿礼嘉，顾红雅，胡苹.现代生物技术[M].北京：高等敦育出版社，1998.
【关键词】哺乳动物；转基因技术；问题；发展前景
1980年，Gordn等人用显微注射转基因方法获得了两只转基因小鼠。1982年，Palmiter和Brinster用此方法把大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵中，获得体重是对照组2倍的“超级鼠”。[1]从此，哺乳动物转基因技术迅速发展，转基因兔、绵羊、猪等相继问世。哺乳动物转基因技术实现了哺乳动物间遗传物质的交换和重组，已成为分子生物学研究的基本技术，并广泛应用于科学研究的各个领域。哺乳动物转基因技术的主要技术环节介绍如下。
1 目标基因克隆和体外重组[1]
1.1 人工合成
它是用DNA合成仪人工合成小片段碱基序列，一般不超过100个碱基。
1.2 互补DNA的克隆
提取组织中的mRNA，用反转录酶合成cDNA，建cDNA立文库，再克隆目标蛋白的cDNA。
1.3 DNA的克隆
首先通过基因克隆技术获得编码目标蛋白的基因，再把目标基因与表达载体相连接，从而形成一个独立表达的调控单元，再通过扩增和纯化，使DNA达到一定浓度后就可以用于基因导入。
2 外源基因的导入
2.1 DNA显微注射
此方法是借助显微操作仪将在体外构建的目的基因直接注射到处于原核时期的受精卵的原核中，使这种外源基因整合到受体细胞的基因组中，以达到转基因的目的。这种方法效果稳定，但操作复杂，转基因效率低。
2.2 反转录病毒感染法
将外源基因重组到载体转录病毒上，包装成高浓度病毒颗粒，然后去感染受精卵或着床后的胚胎，也可将它们进行单层共培养。这种方法的优点是宿主范围广且呈单一位点单拷贝整合，整合效率高，但載体病毒DNA序列有时会对外源基因在受体中的表达产生影响，并且它的安全问题也令人担忧[4]，不易用于商业性转基因动物[6]。
2.3 胚胎干细胞法
这种方法是用外源基因转化胚胎干细胞，通过筛选，把阳性细胞注入受体动物的囊胚腔[1]或桑椹胚的卵周隙形成嵌合体，它会很快地与受体胚囊的内细胞团聚集在一起，共同参入正常胚泡的发育。这种方法的整合率高，但胚胎干细胞细胞株不易建立，所产生的转基因动物全为嵌合体。目前，研究者们正试图把胚胎干细胞的细胞核移入去核的受精卵中来获得非嵌合体[4]。
2.4 细胞核移植法
首先用外源DNA对培养的体细胞或胚胎干细胞进行转染，然后选阳性细胞作核供体，通过细胞核移植获得基因动物。该方法的应用还依赖于体细胞技术的发展[1]。
此外还有精子载体法、基因枪法、电脉冲法、磷酸钙共沉淀法等其他方法[4]。
3 外源DNA整合、转录与表达的分子检测[1]
3.1 外源DNA整合检测
常用方法是用目标基因的一段序列作引物，用PCR仪扩增目标DNA，再通过电泳初步检测是否含目标基因，最后用Southern杂交检测PCR阳性个体是否含有目标基因，如出现阳性，就可断定转基因为阳性动物。
3.2 外源基因的转录检测
该方法是用Nouthern杂交法对转基因动物某一组织的mRNA进行分析检测，出现阳性则表明外源基因具有转录活性。
3.3 外源基因的表达检测
该方法是检测转基因动物组织中是否含有目的基因编码的外源蛋白质，常用的方法有酶联免疫法、免疫荧光法和Western杂交法。
4 转基因哺乳动物研究面临的问题
4.1 转基因技术存在的主要问题
转基因动物的外源基因经常是随机整合和异常表达的，其整合率与表达率极低，同时，转基因动物的多病、不育以至死亡都制约着转基因动物的开发前景[4]。
4.2 转基因动物的安全性问题
（1）具有某些优势性状的转基因动物可能会对生态平衡以及物种的多样性产生不良影响；（2）转基因动物器官移植可能会增加“人兽共患”病的传播机会；（3）用转基因动物生产的食物有可能使食用者发生过敏反应；（4）转基因动物的研究还将会引发一系列社会伦理问题[6]。
5 哺乳动物转基因技术的发展前景
5.1 哺乳动物转基因技术可用来改良动物品种及其生产性能[6]
我们可以利用转基因技术让外源基因在家畜乳腺中特异性地表达，以此提高奶液的蛋白含量和抗菌能力，降低乳糖含量，使其品质更接近人奶。
5.2 用转基因动物生产药物蛋白[6]
把药用蛋白或营养蛋白质与组织特异性表达调控元件藕联，运用家畜的造血系统或泌乳蛋白生产药用或营养蛋白质，提高畜牧业的经济效益。
5.3 为人类器官移植提供供体
探索用转基因动物的器官作为人类器官移植的供体，为器官的异体移植提供基础，利用此项技术可解决器官移植中供体相对不足的问题。
5.4 建立诊断、治疗人类疾病及新药筛选的动物模型[6，13]
利用此项技术，遗传学家可以精确地失活某些基因（如“knock—out”）或增强修复（如“knock—in”）某些基因的表达，从而制作各种研究和治疗人类疾病的动物模型和新药的筛选模型。
参考文献
[1]岳文斌，张建红.动物繁殖及营养调控[M].北京：中国农业出版社，2004：91-98.
[2]剂谦，朱矗泉.生物安全[M].北京：科学出版社，2001.
[3]刘煮，卢光露.转基因动物技术的研究进展[J].遗传，2001（3）：289-291.
[4]王学慧，刘月学.农业转基因技术的发展概况[J].临沂师范学院学报.2001，23 （4）：68-70.
[5]张穗扎.转基因动植物及其在农业的应用[J].生物学通报，1993，28 （1）：4-5.
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[8]程炜中.转基因动物的遗传修饰与应用（上）[M].遗传，1995，17（2）：42-48.
[9]程炜中.转基因动物的遗传修饰与应用（下）[M].遗传，1995，17（3）：46-48.
[10]卢一凡，邓继先，朱鑫泉.转基因动物理论与技术的研究进展[J].生物技术通报，1997（4）：19-20.
[11]贾士荣.转基因植物环境及食品安全性[J].生物工程进展，1997，17（6）：37-42.
[12]John J，Kennely.开发改变乳成分的潜力[J].国外畜牧科技，2001，28（4）：45-47.
[13]瞿礼嘉，顾红雅，胡苹.现代生物技术[M].北京：高等敦育出版社，1998.