目的制备小鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)标准血清,建立ELISA检测方法,实现一种病毒多种检测方法的比对研究。方法用TMEV感染3周龄SPF级BALB/c小鼠,制备免疫用抗原。分别在0、7、14 d以腹腔注射的方式免疫SPF级6~8周龄BALB/c小鼠,免疫血清用IFAI、EA法进行鉴定;TMEV感染BHK-21细胞,制备ELISA抗原,确定酶结合物、抗原和标准阳性血清的最佳工作浓度,建立TMEV ELISA检测方法,进行敏感性、特异性、重复性和稳定性实验。结果制备TMEV免疫血清,以IFAI、EA测定血清效价分别为1∶640和1∶320,与痘苗病毒、小鼠肺炎病毒、小鼠肝炎病毒、仙台病毒和呼肠孤病毒-Ш型均无交叉反应;建立了ELISA检测方法,确立了各种试剂的最佳工作浓度,其中酶结合物最佳工作浓度为1∶10000,抗原为2.5μg/mL,阳性参考血清为1∶200;ELISA检测灵敏度为1∶3200。板内特异抗原、正常抗原平均变异系数为4.67%和5.7%,板间为4.39%和7.61%。稳定性实验相对偏差均小于20%。结论本研究制备的TMEV免疫血清可作为血清学检测方法中的标准质控血清;建立的ELISA方法重复性、稳定性好,敏感性和特异性强,可用于小鼠脑脊髓炎病毒血清抗体检测。