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【摘要】 目的 研究再生障碍性贫血(AA)患者骨髓(BM)及外周血(PB)淋巴细胞及其活化相关分子的表达及临床意义。方法 采用双色免疫荧光标记、流式细胞仪分析AA患者的BM和PB中淋巴细胞膜分子表达。结果 AA患者BM和BP中CD8+细胞增加,CD4/CD8比例下降,BM中CD25+细胞和HLA-DR+细胞增多,急性AA增加尤为显著(p(0.01),BM中CD16+或CD56+细胞也明显增多(P<0.05);双标记分析提示T细胞主要为CD8+细胞;急性AA患者CD8+-CD25+细胞显著增多(P<0.01),AA患者BM中淋巴细胞活化相关分子表达增多,尤其是4-1BB+、CD95L+和CD40L+细胞显著增多(P<0.01)。结论 AA患者BM中淋巴细胞活化相关膜分子增多,是AA免疫功能异常及最终导致造血功能衰竭的原因之一。
【关键词】再生障碍性贫血;淋巴细胞异常活化;细胞表达
The changes oflymphocytein aplastic anemia patients
XU Xue-xin. NanyangCentralHospisal of Nanyang,HeNan473009,China
【Abstract】 Objective To investigate the phenotypesandexpression of activated T cell membrancmolecules onlymphocytes in thePeriperal blood(PB)and bonemarrow(BM)of the patients withaplastic anemia.Methods Single and double-color immunofluorescents wereused to analyze the mononuclear cells from PB and BM of the AA patientsby flowcytometry.Results The expression of CD8+increased and the ratio of CD4+/CD8+cell decreased significantly.The expression of CD25+andHLA-DR+was increased in the BM,whichwasmoresignificantin patientswithseriousAA(P<0.01) andtheCD16+orCD56+positivecellsalsoincreasedonBM.Double-coloranalysisshowedthatthe most activated T cells wereCD8+cells.the CD8+-CD25+lymphocytes increased significantly in the BM(P<0.01).Co-stimulatorymolecules which essential to activation of lymphocytes
DOI:10.3760/cma.j.issn 1673-8799.2010.06.27
作者单位:473009河南省南阳市中心医院输血科
such as 4-1BB+,CD95L+and CD40L+increased sigenficantly in the BM of AA patients.Conclusion Theincrease of co-stimulating molecules which was necessary for lymphocytes activation in the BM Of AA patients is one of main reasons to explainabnormalT cells activation and failure of hematopoiesis.
【Key words】Aplastlc anemial;Abnormal lymphocyte activation;Cell expression
再生障碍性贫血(AA)是造血系统的常见疾病。据报道患者造血功能衰竭与细胞免疫功能异常、大量富克隆淋巴细胞局部浸润、多种细胞因子分泌失调等有关[1]。现已证实,淋巴细胞活化需要抗原的刺激为其活化提供第1信号,而活化第2信号则是淋巴细胞最终能否完成活化,并进行细胞增殖的关键,如无第2信号,淋巴细胞将进入免疫耐受或细胞凋亡,只有获得第2信号使细胞活化,才能产生免疫应答[2]。笔者对近年来诊断的AA进行了骨施(BM)及外周血(PB)淋巴细胞表面标志及与其活化相关的共刺激分子进行了观标记流式细胞仪分析,并探讨其在AA发病中的作用,现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料及治疗方案 2008年2月至2009年5月,19例全血细胞减少的患者按常规进行协常规、生化、溶血、染色体及骨髓细胞学檢查,14例符合AA的诊断标准。急性AA4例,其中 Ⅰ型 3例,Ⅱ型 1例;慢性 AA 6例。女9例,男10例,平均27.3岁(9~55岁),病程 14 d~16个月。患者入院后,分别抽取新鲜 PB和 BM各5 ml,EDTA抗凝。正常对照 PB为年龄相仿成人10例,BM来自非血液系统疾病的患者,共6例。AA患者均采用雄激素 50~100 mg/d加环抱素 A静脉用量3~5 mg/d,10 d为 1个疗程,2~3个疗程后改为口服 CyA的治疗方案,疗程 4个月。疗效判断接血液病的诊断与疗效标准[2]。
1.2 实验试剂与细胞因子 各种单克隆抗体和红细胞溶解液均购自法国Immunotech公司;羊抗鼠FYFC荧光二抗购自上海生物制品研究所。
1.3 流式细胞仪分析 BM和PM按1:4与红细胞溶解液混合室温作用5 min,离心去除上清,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤 2次,用含5%AB型血清的 PBS孵育 15 min后计数备用。采用直接和间接免疫荧光法进行淋巴细胞表面抗原测定。双标记组合为CD3-CD25、CD3-CD28、CD3-CD40 L、CD3-CD95、CD3-C95 L、CD4-CD25、CD4-CD28、CD4-CD95、CD8-CD25、CD8-CD28、CD8-CD95。方法简述如下:每 2 ×105/ml细胞加人单抗20 μl(双标均用直标抗体,同时加入荧光标记的单抗),4℃作用45 min,PBS洗涤2次,加人FITC标记的荧光二抗,4℃作用45 min,PBS洗涤3次后上机。阳性对照为FITC标记的小鼠同型免疫球蛋白。
1.4 统计学分析 采用SPSS 10.0统计软件包进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,计数资料用百分比(%)表示,各组间的均数比较采用t检验,率的比较用χ2检验。检验水准α=0.05,P<0.05表示差异有统计学意义,并进行多因素相关分析。
2 结果
2.1 PB和BM淋巴细胞表型改变 PB及BM淋巴细胞亚群流式细胞分析发现患者CD3+细胞数基本正常,部分患者BM中CD3+细胞比例显著增多,但CD4+细胞明显减少,CD4/CD8比例下降。活化淋巴细胞的标志CD25+、4-1BB和HLA-DR+细胞增多,尤其是 BM中CD25、4-1BB和 HLA-DR阳性细胞比例显著增多,与对照组相比差异非常显著(P<0.01)。PE则以CD25+细胞增加最为显著(P<0.05),急、慢性AA患者相比发现,急性AA患者BM或PB中CD25+、4-1BB+和HlA-DR+细胞多于慢性AA(P<0.05)。BM中自然杀伤细胞NK表面标志CD16+或CD56+也明显升高,PBCD40+也有一定程度的增加。
2.2 共刺激分子的表达与疾病的相关性 双标记分析AA患者PB和BM中CD28、CD40L、CD80、CD95和CD95L表达,结果发现不论急、慢性AA患者,其CD28(7.1%)和CD80(7.9%)表达无明显改变,而CD40 L及CD95 L阳性率高于对照组(P<0.01)BM中CD40L主要表达在CD4+T细胞,而CD95L则主要见于CD8+T细胞,CD4+和 CD8+细胞 CD95的表达量相似;比较 CD4+CD95L+和CD8+CD95L+双阳性细胞在急、慢性的比例,提示急性 AA患者BM出CD8*CD95+细胞显著多于慢性AA(P<0.05),而CD40L阳性细胞则无区别,P>0.05。
2.3 AA患者PB及BM淋巴细胞表型与临床的相关性 所有AA患者均有不同程度的免疫功能异常,PB和BM血中CD4/CD8倒置。部分急性AA患者BM中CD3+细胞增加,与慢性AA患者差异显著(P<0.05),说明大量异常活化的淋巴细胞骨髓浸润在急性AA发病过程中起重要作用。双标记分析发现急、慢性AA的BM中CD4+CD25+、CD4+CD40L+、CD8+CD25+和CD8+CD95L+细胞均高于对照组,急性AA患者CD8+CD25+和CD8+CD95L+细胞比例增加,CD4+CD25+/CD8+CD25+之比与患者骨髓增生程度成正相关,大部分急性AA两者之比在0.8~1.0者占大多数,且BM中CD8+、CD25+和CD8+、CD95L+细胞总体水平与其对骨髓造血功能的抑制作用呈负相关(r=0.90,P<0.05),急、慢性AA患者BM中CD8+CD25+和CD8+CD95L+细胞较高者,临床表现较为严重,出血和感染多见于该类患者。
3 讨论
T淋巴细胞是细胞免疫中的主要效应细胞,也是极不均一的群体,从功能上可分为辅助性T细胞(TH)和抑制性T细胞(TS/c)。AA患者免疫功能异常与对造血干/祖细胞具有杀伤和抑制作用的T细胞异常活化和增殖有关。我们检测了14例AA患者BM和PB中T淋巴细胞的表型发现,大部分患者的CD3+细胞基本正常,但CD4/CD8比值下降,与对照组相比差异非常显著(P<0.01)。PB中CD25+细胞增多最为明显(P<0.05)。双标记分析提示急、慢性AA BM除CD4+、CD25+、CD4+、CD40L+、CD8+、CD25+和CD8+、CD95L+细胞均高于对照组。NK细胞表面标志CD16+或CD56+细胞也明显升高。由此提示,AA患者存在不同程度的细胞免疫功能异常,活化的淋巴细胞主要是CD8+细胞。本研究提示与异常免疫有关的细胞毒T淋巴细胞的活化和增生主要局限在骨髓,异常表达的 CD95L又可使团代偿进入细胞周期的造血细胞凋亡,进一步加重造血功能的衰竭。
免疫應答是由多种免疫细胞和分子参加并受到严格调控及制约的复杂的生理过程,研究表明[4]一组细胞膜分子-共刺激分子(costimulating molecules),其调节性表达、相互作用及信号传递在非常复杂的淋巴细胞活化和免疫应答过程中起着极其重要的作用。
参考文献
[1] Nakao S.Immune mechanism of aplasticanemia.IntJHematol,2007,66:127-134.
[2] Bretscher PA.A.two-step,two-signal modelfor theprimaryactivation ofprecursorhelper T cells.Proc Nall AcakSci USA,1999:96:185,190.
[3] 张之南.血液病诊断与疗效标准.天津科学技术出版社,1991:29-36.
[4] Manzs CY,DietricgPY,Schnuriger V,et al.T-cellteceptor betachainvariability in bone amrrowand peripheralbloodinsevereacpuiredaplastic anemia.Blood Cells Mol Dis,2007,23:110-122.
【关键词】再生障碍性贫血;淋巴细胞异常活化;细胞表达
The changes oflymphocytein aplastic anemia patients
XU Xue-xin. NanyangCentralHospisal of Nanyang,HeNan473009,China
【Abstract】 Objective To investigate the phenotypesandexpression of activated T cell membrancmolecules onlymphocytes in thePeriperal blood(PB)and bonemarrow(BM)of the patients withaplastic anemia.Methods Single and double-color immunofluorescents wereused to analyze the mononuclear cells from PB and BM of the AA patientsby flowcytometry.Results The expression of CD8+increased and the ratio of CD4+/CD8+cell decreased significantly.The expression of CD25+andHLA-DR+was increased in the BM,whichwasmoresignificantin patientswithseriousAA(P<0.01) andtheCD16+orCD56+positivecellsalsoincreasedonBM.Double-coloranalysisshowedthatthe most activated T cells wereCD8+cells.the CD8+-CD25+lymphocytes increased significantly in the BM(P<0.01).Co-stimulatorymolecules which essential to activation of lymphocytes
DOI:10.3760/cma.j.issn 1673-8799.2010.06.27
作者单位:473009河南省南阳市中心医院输血科
such as 4-1BB+,CD95L+and CD40L+increased sigenficantly in the BM of AA patients.Conclusion Theincrease of co-stimulating molecules which was necessary for lymphocytes activation in the BM Of AA patients is one of main reasons to explainabnormalT cells activation and failure of hematopoiesis.
【Key words】Aplastlc anemial;Abnormal lymphocyte activation;Cell expression
再生障碍性贫血(AA)是造血系统的常见疾病。据报道患者造血功能衰竭与细胞免疫功能异常、大量富克隆淋巴细胞局部浸润、多种细胞因子分泌失调等有关[1]。现已证实,淋巴细胞活化需要抗原的刺激为其活化提供第1信号,而活化第2信号则是淋巴细胞最终能否完成活化,并进行细胞增殖的关键,如无第2信号,淋巴细胞将进入免疫耐受或细胞凋亡,只有获得第2信号使细胞活化,才能产生免疫应答[2]。笔者对近年来诊断的AA进行了骨施(BM)及外周血(PB)淋巴细胞表面标志及与其活化相关的共刺激分子进行了观标记流式细胞仪分析,并探讨其在AA发病中的作用,现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料及治疗方案 2008年2月至2009年5月,19例全血细胞减少的患者按常规进行协常规、生化、溶血、染色体及骨髓细胞学檢查,14例符合AA的诊断标准。急性AA4例,其中 Ⅰ型 3例,Ⅱ型 1例;慢性 AA 6例。女9例,男10例,平均27.3岁(9~55岁),病程 14 d~16个月。患者入院后,分别抽取新鲜 PB和 BM各5 ml,EDTA抗凝。正常对照 PB为年龄相仿成人10例,BM来自非血液系统疾病的患者,共6例。AA患者均采用雄激素 50~100 mg/d加环抱素 A静脉用量3~5 mg/d,10 d为 1个疗程,2~3个疗程后改为口服 CyA的治疗方案,疗程 4个月。疗效判断接血液病的诊断与疗效标准[2]。
1.2 实验试剂与细胞因子 各种单克隆抗体和红细胞溶解液均购自法国Immunotech公司;羊抗鼠FYFC荧光二抗购自上海生物制品研究所。
1.3 流式细胞仪分析 BM和PM按1:4与红细胞溶解液混合室温作用5 min,离心去除上清,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤 2次,用含5%AB型血清的 PBS孵育 15 min后计数备用。采用直接和间接免疫荧光法进行淋巴细胞表面抗原测定。双标记组合为CD3-CD25、CD3-CD28、CD3-CD40 L、CD3-CD95、CD3-C95 L、CD4-CD25、CD4-CD28、CD4-CD95、CD8-CD25、CD8-CD28、CD8-CD95。方法简述如下:每 2 ×105/ml细胞加人单抗20 μl(双标均用直标抗体,同时加入荧光标记的单抗),4℃作用45 min,PBS洗涤2次,加人FITC标记的荧光二抗,4℃作用45 min,PBS洗涤3次后上机。阳性对照为FITC标记的小鼠同型免疫球蛋白。
1.4 统计学分析 采用SPSS 10.0统计软件包进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,计数资料用百分比(%)表示,各组间的均数比较采用t检验,率的比较用χ2检验。检验水准α=0.05,P<0.05表示差异有统计学意义,并进行多因素相关分析。
2 结果
2.1 PB和BM淋巴细胞表型改变 PB及BM淋巴细胞亚群流式细胞分析发现患者CD3+细胞数基本正常,部分患者BM中CD3+细胞比例显著增多,但CD4+细胞明显减少,CD4/CD8比例下降。活化淋巴细胞的标志CD25+、4-1BB和HLA-DR+细胞增多,尤其是 BM中CD25、4-1BB和 HLA-DR阳性细胞比例显著增多,与对照组相比差异非常显著(P<0.01)。PE则以CD25+细胞增加最为显著(P<0.05),急、慢性AA患者相比发现,急性AA患者BM或PB中CD25+、4-1BB+和HlA-DR+细胞多于慢性AA(P<0.05)。BM中自然杀伤细胞NK表面标志CD16+或CD56+也明显升高,PBCD40+也有一定程度的增加。
2.2 共刺激分子的表达与疾病的相关性 双标记分析AA患者PB和BM中CD28、CD40L、CD80、CD95和CD95L表达,结果发现不论急、慢性AA患者,其CD28(7.1%)和CD80(7.9%)表达无明显改变,而CD40 L及CD95 L阳性率高于对照组(P<0.01)BM中CD40L主要表达在CD4+T细胞,而CD95L则主要见于CD8+T细胞,CD4+和 CD8+细胞 CD95的表达量相似;比较 CD4+CD95L+和CD8+CD95L+双阳性细胞在急、慢性的比例,提示急性 AA患者BM出CD8*CD95+细胞显著多于慢性AA(P<0.05),而CD40L阳性细胞则无区别,P>0.05。
2.3 AA患者PB及BM淋巴细胞表型与临床的相关性 所有AA患者均有不同程度的免疫功能异常,PB和BM血中CD4/CD8倒置。部分急性AA患者BM中CD3+细胞增加,与慢性AA患者差异显著(P<0.05),说明大量异常活化的淋巴细胞骨髓浸润在急性AA发病过程中起重要作用。双标记分析发现急、慢性AA的BM中CD4+CD25+、CD4+CD40L+、CD8+CD25+和CD8+CD95L+细胞均高于对照组,急性AA患者CD8+CD25+和CD8+CD95L+细胞比例增加,CD4+CD25+/CD8+CD25+之比与患者骨髓增生程度成正相关,大部分急性AA两者之比在0.8~1.0者占大多数,且BM中CD8+、CD25+和CD8+、CD95L+细胞总体水平与其对骨髓造血功能的抑制作用呈负相关(r=0.90,P<0.05),急、慢性AA患者BM中CD8+CD25+和CD8+CD95L+细胞较高者,临床表现较为严重,出血和感染多见于该类患者。
3 讨论
T淋巴细胞是细胞免疫中的主要效应细胞,也是极不均一的群体,从功能上可分为辅助性T细胞(TH)和抑制性T细胞(TS/c)。AA患者免疫功能异常与对造血干/祖细胞具有杀伤和抑制作用的T细胞异常活化和增殖有关。我们检测了14例AA患者BM和PB中T淋巴细胞的表型发现,大部分患者的CD3+细胞基本正常,但CD4/CD8比值下降,与对照组相比差异非常显著(P<0.01)。PB中CD25+细胞增多最为明显(P<0.05)。双标记分析提示急、慢性AA BM除CD4+、CD25+、CD4+、CD40L+、CD8+、CD25+和CD8+、CD95L+细胞均高于对照组。NK细胞表面标志CD16+或CD56+细胞也明显升高。由此提示,AA患者存在不同程度的细胞免疫功能异常,活化的淋巴细胞主要是CD8+细胞。本研究提示与异常免疫有关的细胞毒T淋巴细胞的活化和增生主要局限在骨髓,异常表达的 CD95L又可使团代偿进入细胞周期的造血细胞凋亡,进一步加重造血功能的衰竭。
免疫應答是由多种免疫细胞和分子参加并受到严格调控及制约的复杂的生理过程,研究表明[4]一组细胞膜分子-共刺激分子(costimulating molecules),其调节性表达、相互作用及信号传递在非常复杂的淋巴细胞活化和免疫应答过程中起着极其重要的作用。
参考文献
[1] Nakao S.Immune mechanism of aplasticanemia.IntJHematol,2007,66:127-134.
[2] Bretscher PA.A.two-step,two-signal modelfor theprimaryactivation ofprecursorhelper T cells.Proc Nall AcakSci USA,1999:96:185,190.
[3] 张之南.血液病诊断与疗效标准.天津科学技术出版社,1991:29-36.
[4] Manzs CY,DietricgPY,Schnuriger V,et al.T-cellteceptor betachainvariability in bone amrrowand peripheralbloodinsevereacpuiredaplastic anemia.Blood Cells Mol Dis,2007,23:110-122.