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摘 要 目的:测定粒系集落刺激因子(G-CSF)动员前、后正常异基因供者外周血(PB)移植物中I型树突状细胞(DC1)、Ⅱ型树突状细胞(DC2)的数量及DC2/DC1比例;探讨G-CSF对于PB中DC1、DC2数量及DC2/DC1比例的影响。方法:以流式细胞术(FCM)检测11例G-CSF动员的异基因PB造血干细胞移植物(G-PBSC)中的DC1、DC2数量与DC2/DC1比例;并与8例正常供者动员前PB进行比较。结果:正常异基因PB造血干细胞(PBSC)供者以G-CSF动员后,能选择性增加移植物中DC2数量(26.76×106/L vs 14.92×106/L;P=0.029)和DC2/DC1比例(2.02±1.43 vs 1.00±0.37;P=0.044),但DC1无显著变化。结论:移植前以G-CSF动员正常异基因PBSC供者,可选择性提高DC2的数量,而DC1数量无明显增加。
关键词 粒系集落刺激因子 树突状细胞 异基因外周血造血干细胞移植 急性移植物抗宿主病
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.01.114
资料与方法
19例PB标本均取自2006年6月～2007年2月接受Allo-PBSCT的正常供体,其中动员后PB 11例,未动员PB 8例。DC鉴定:DC为阳性表达抗HLA-DR-PE CY5兼阴性表达髓、淋系特异性混合标志Lin-FITC。DC分型:抗CD11c PE或抗CD123 PE用来确定DC亚群。供体PBSC动员和采集:供体接受rhG-CSF(吉粒芬),5μg/kg,每12小时1次连续皮下注射,-4～0天;第5和(或)第6天以血细胞分离机采集PBSC。
单抗和溶血剂:单抗Lineage Cocktail1-FITC购自BD公司,鼠抗人HLA-DR-PE-CY5、鼠抗人CD11c-PE、人CD123-PE、Caltag Cal-LyseTM溶血剂均购自Caltag公司。
流式细胞仪(FACS):所用FACS为Beckman Coμlter公司产品,型号EPICS-XL。数据获取和分析软件为CellQuest3.2。
标本采集和抗体标记:抽取G-CSF动员前、后PB 2ml,肝素抗凝,按说明书操作,取干燥洁净离心管3支,每管加新鲜抗凝PB 100μl,实验管(A/B管)和对照管(O管)按表1加入荧光标记抗体,室温22±3℃避光孵育15分钟后加入Caltag Cal-LyseTM溶血剂,室温避光再放置10分钟,继加去离子水1ml,室温避光放置10分钟。300g离心5分钟,弃上清,磷酸缓冲盐(PBS)1ml洗涤2次,然后加入500μl PBS,混匀后立即上机检测。见表1。
流式细胞术(FCM)检测分析:运行FACSComp,调节PMT电压和荧光补偿,检查仪器灵敏度。使用CellQuest软件获取1万～万个细胞。用FSC设阈值,排除细胞碎片的干扰。在SSC/FSC散点图中设门。三色试剂分析法检测PBDC亚群的设门策略:在SSC对Lineage 1的细胞分布图中以Lin-设门,用Lin-区的细胞在双重设门中获取HLA-DR与CD11c双阳性的细胞,并同时获取HLA-DR与CD123双阳性的细胞,其中Lin-HLA-DR+CD11c+细胞为DC1,Lin-HLA-DR+CD123+细胞为DC2。用CellQuest软件分析CD11c阳性及CD123阳性的DC分别在所测PB标本白细胞(WBC)中的百分比。所取标本均以手工计数PBWBC,DC1、DC2绝对数为WBC绝对数乘以相应的百分数。
统计方法:应用SPSS11.5软件包处理数据。
结 果
动员前后PBWBC的数量变化:正常供体在动员前PBWBC绝对计数为7.01×109/L,而动员后PBWBC显著增至43.11×109/L(P=0.000)。
动员前后PBDC1的数量变化:G-CSF动员前、后供体PBDC1绝对数分别为14.21×106/L和18.02×106/L,兩者无统计学差异(P=0.541)。
动员前后PBDC2的数量变化:供体经G-CSF动员后PBDC2数量(26.76×106/L)显著超过动员前(14.92×106/L)的水平(P=0.029)。
动员前后PB中DC2/DC1的比例变化:动员前PB中DC2/DC1的比例为1.00±0.37,而在动员后该比例高达2.02±1.43,差异有统计学意义(P=0.044)。
讨 论
研究证实,G-PBSC移植物中的确具有高DC2优势。正常供者经短期G-CSF刺激后,PBDC1在动员前、后无明显变化,而PBDC2较之动员前确有显著性增高。考虑到WBC手工计数可以影响到PBDC绝对计数结果的准确性,故进一步分析动员前、后DC2/DC1比例的变化,这样即可完全消除WBC手工计数所造成的偏差。
体外试验证实,从G-PBSC移植物中分离纯化的DC1亚群,在未经CD40L或TNF-α激活的状态下,也可以刺激初始型CD4+CD45RA+T细胞产1型CK增多,朝向Th1型细胞极化;但未经活化的DC2亚群却不能激活CD4+CD45RA+T细胞。可见G-PBSC移植物的Th2型极化现象似乎不能以移植物中的未活化DC2亚群的直接效应来解释。
参考文献
1 Pan L,Delmonte J Jr,Jalonen CK,Ferrara JL.Pretreatment of donor mice with granμlocyte colony-stimμlating factor polarizes donor T lymphocytes toward type-2 cytokine production and reduces severity of experimental graft-versushost disease.Blood.1995:86,4422.
2 Zeng D,Dejbakhsh-Jones S,Strober S.Granμlocyte colony- stimμlating factor reduces the capacity of blood mononuclear cells to induce graft-versus-host disease:impact on blood progenitor cell transplantation.Blood.1997:90,453.
3 Reddy V,Hill GR,Pan L,et al.G-CSF modμlates cytokine profile of dendritic cells and decreases acute graft-vs-host disease through effects on the donor rather than the recipient.Transplantation.2000:69,691.
关键词 粒系集落刺激因子 树突状细胞 异基因外周血造血干细胞移植 急性移植物抗宿主病
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.01.114
资料与方法
19例PB标本均取自2006年6月～2007年2月接受Allo-PBSCT的正常供体,其中动员后PB 11例,未动员PB 8例。DC鉴定:DC为阳性表达抗HLA-DR-PE CY5兼阴性表达髓、淋系特异性混合标志Lin-FITC。DC分型:抗CD11c PE或抗CD123 PE用来确定DC亚群。供体PBSC动员和采集:供体接受rhG-CSF(吉粒芬),5μg/kg,每12小时1次连续皮下注射,-4～0天;第5和(或)第6天以血细胞分离机采集PBSC。
单抗和溶血剂:单抗Lineage Cocktail1-FITC购自BD公司,鼠抗人HLA-DR-PE-CY5、鼠抗人CD11c-PE、人CD123-PE、Caltag Cal-LyseTM溶血剂均购自Caltag公司。
流式细胞仪(FACS):所用FACS为Beckman Coμlter公司产品,型号EPICS-XL。数据获取和分析软件为CellQuest3.2。
标本采集和抗体标记:抽取G-CSF动员前、后PB 2ml,肝素抗凝,按说明书操作,取干燥洁净离心管3支,每管加新鲜抗凝PB 100μl,实验管(A/B管)和对照管(O管)按表1加入荧光标记抗体,室温22±3℃避光孵育15分钟后加入Caltag Cal-LyseTM溶血剂,室温避光再放置10分钟,继加去离子水1ml,室温避光放置10分钟。300g离心5分钟,弃上清,磷酸缓冲盐(PBS)1ml洗涤2次,然后加入500μl PBS,混匀后立即上机检测。见表1。
流式细胞术(FCM)检测分析:运行FACSComp,调节PMT电压和荧光补偿,检查仪器灵敏度。使用CellQuest软件获取1万～万个细胞。用FSC设阈值,排除细胞碎片的干扰。在SSC/FSC散点图中设门。三色试剂分析法检测PBDC亚群的设门策略:在SSC对Lineage 1的细胞分布图中以Lin-设门,用Lin-区的细胞在双重设门中获取HLA-DR与CD11c双阳性的细胞,并同时获取HLA-DR与CD123双阳性的细胞,其中Lin-HLA-DR+CD11c+细胞为DC1,Lin-HLA-DR+CD123+细胞为DC2。用CellQuest软件分析CD11c阳性及CD123阳性的DC分别在所测PB标本白细胞(WBC)中的百分比。所取标本均以手工计数PBWBC,DC1、DC2绝对数为WBC绝对数乘以相应的百分数。
统计方法:应用SPSS11.5软件包处理数据。
结 果
动员前后PBWBC的数量变化:正常供体在动员前PBWBC绝对计数为7.01×109/L,而动员后PBWBC显著增至43.11×109/L(P=0.000)。
动员前后PBDC1的数量变化:G-CSF动员前、后供体PBDC1绝对数分别为14.21×106/L和18.02×106/L,兩者无统计学差异(P=0.541)。
动员前后PBDC2的数量变化:供体经G-CSF动员后PBDC2数量(26.76×106/L)显著超过动员前(14.92×106/L)的水平(P=0.029)。
动员前后PB中DC2/DC1的比例变化:动员前PB中DC2/DC1的比例为1.00±0.37,而在动员后该比例高达2.02±1.43,差异有统计学意义(P=0.044)。
讨 论
研究证实,G-PBSC移植物中的确具有高DC2优势。正常供者经短期G-CSF刺激后,PBDC1在动员前、后无明显变化,而PBDC2较之动员前确有显著性增高。考虑到WBC手工计数可以影响到PBDC绝对计数结果的准确性,故进一步分析动员前、后DC2/DC1比例的变化,这样即可完全消除WBC手工计数所造成的偏差。
体外试验证实,从G-PBSC移植物中分离纯化的DC1亚群,在未经CD40L或TNF-α激活的状态下,也可以刺激初始型CD4+CD45RA+T细胞产1型CK增多,朝向Th1型细胞极化;但未经活化的DC2亚群却不能激活CD4+CD45RA+T细胞。可见G-PBSC移植物的Th2型极化现象似乎不能以移植物中的未活化DC2亚群的直接效应来解释。
参考文献
1 Pan L,Delmonte J Jr,Jalonen CK,Ferrara JL.Pretreatment of donor mice with granμlocyte colony-stimμlating factor polarizes donor T lymphocytes toward type-2 cytokine production and reduces severity of experimental graft-versushost disease.Blood.1995:86,4422.
2 Zeng D,Dejbakhsh-Jones S,Strober S.Granμlocyte colony- stimμlating factor reduces the capacity of blood mononuclear cells to induce graft-versus-host disease:impact on blood progenitor cell transplantation.Blood.1997:90,453.
3 Reddy V,Hill GR,Pan L,et al.G-CSF modμlates cytokine profile of dendritic cells and decreases acute graft-vs-host disease through effects on the donor rather than the recipient.Transplantation.2000:69,691.