枸杞棉蚜SSR—PCR反应体系的建立与优化

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  摘要:采用单因素法和L25(55)正交试验设计进行简单重复系列PCR(SSR-PCR)反应体系优化,并对引物退火温度进行筛选,以建立适宜枸杞棉蚜的SSR反应体系和扩增程序。结果表明,枸杞棉蚜SSR-PCR的优化体系总体积为25 μL,包括50 ng模板DNA,1.5U Taq DNA聚合酶,150 μmol/L Mg2 ,300 μmol/L dNTPs,0.4 pmol/μL引物,优化后的检测体系更为经济有效;Ago66引物PCR适宜退火温度为58 ℃。
  关键词:棉蚜;SSR;单因素试验;正交优化
  中图分类号: S435.671文献标志码: A文章编号:1002-1302(2017)07-0040-04
  运用分子生物学技术研究蚜虫已经成为热点问题[1],棉蚜的分子生物学研究多集中于棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜,国内学者孟玲等初步应用随机扩增多态性DNA(RAPD)研究黄瓜寄主和棉花寄主的棉蚜遗传多样性,奠定了一定的基础[2-3]。邹晨辉等采用简单重复序列(SSR)初步研究了不同地理及季节的棉花型棉蚜遗传多样性[4-6]。国外学者Fuller等运用SSR技术研究了欧洲、非洲、美洲、亚洲等地区多个国家的棉蚜遗传多样性,这些棉蚜原寄主涉及棉花、葫芦科、棉花、茄子、马铃薯、辣椒、花椒、梨树和柑橘树[7-9]。枸杞是重要的药用经济作物,棉蚜危害严重,国内外尚缺少对原寄主是枸杞的棉蚜分子生物学方面的研究资料。
  微卫星DNA是短的碱基重复序列,最早在寄居蟹中被发现[10],在真核生物中广泛存在,由于点突变、不等交换、基因转换等原因,使其变异速率高,因此具有高的多样性及种特异性[11]。微卫星分子标记是基于PCR的第二代分子标记技术[12],具有重复性好、多态性高、共显性、所需DNA量少、操作简单等优点。正是由于微卫星分子标记是基于PCR的,因此优化的PCR体系与扩增条件是微卫星分子标记的前提条件。
  单因素试验无法考虑到因素之间的交互作用,正交试验无法分析因素的影响趋势,本研究综合以上2种方法,弥补不足,以枸杞棉蚜为材料,对DNA用量、Taq聚合酶用量、Mg2 浓度、dNTPs浓度和引物浓度5个因素进行优化,建立枸杞棉蚜SSR-PCR试验的最佳反应体系,并在此基础上得到引物的最适退火温度。本试验探讨枸杞棉蚜种群遗传多样性研究中 SSR-PCR方法的一致性、可靠性和可重复性,为枸杞棉蚜种群遗传多样性分析、生物型鉴定、指纹图谱构建等研究奠定基础。
  1材料与方法
  1.1材料与试剂
  1.1.1材料材料采于青海诺木洪红枸杞栽培田,采集无翅棉蚜成虫,样品单头分别放于盛有无水乙醇的1.5 mL离心管中浸泡,于-20 ℃保存备用。
  1.1.2试剂试验所用试剂10×PCR Buffer(无Mg2 )、dNTPs(2.5nmol/μL)、MgCl2(25.0nmol/μL)、Taq DNA 聚合酶(5.0 U/μL)等均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。200 bp DNA Marker,购自TaKaRa公司。SSR引物采用Vanlerberghe-Masutti等于1999年设计的棉蚜微卫星引物(表1)[13],正交试验所用引物为Ago66,引物Ago59和Ago89為体系验证引物,均为生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
  1.2方法
  1.2.1枸杞棉蚜总DNA提取及检测采用杨子祥等的改进SDS法[14]提取枸杞棉蚜基因组DNA,用核酸微量测定仪(德国Eppendorf公司BioSpectrometerbasic型)检测DNA的浓度和质量,用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性,将提取的DNA于-20 ℃保存备用。
  1.2.2因素设计方案本试验设定的标准反应体系:反应总体积为25μL,其中含有80 ng模板DNA、2.5 U Taq酶、150 μmol/L Mg2 、250 μmol/L dNTPs、1.2 pmol/μL引物。为比较不同处理对SSR扩增的影响,采用单因素体系优化试验对影响扩增的Mg2 、dNTPs、Taq酶、引物分别设置5种梯度水平。即当一种成分浓度梯度变化时,其他成分不变。其中DNA模板的梯度设计为20、40、60、80、100 ng;Taq酶的梯度设计为0.5、1、1.5、2、2.5 U;Mg2 的梯度设计为150、175、200、225、250 μmol/L;dNTPs的梯度设计为100、150、200、250、300 μmol/L;引物的梯度设计为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 pmol/μL。加ddH2O补足体积为25 μL。
  1.2.3正交优化设计为探讨反应因素间的互作效应,PCR扩增所设置因素的水平同单因素试验一致,采用L25(55)正交试验设计(表2)。为提高试验准确性,正交试验进行1次重复检验。
  1.2.4SSR-PCR扩增及产物检测PCR反应程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 60 s,58 ℃ 60 s,72 ℃ 30 s,35次循环;72 ℃ 5 min。4 ℃保存备用。PCR扩增产物用8%非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳检测,用 DL200 Marker 作为标准分子量参照物,恒压180 V电泳约1 h,经固定、银染、显色和漂洗后,数码相机拍照观察。
  参照何正文等的方法[15],依据扩增条带的敏感性和特异性进行计分,分数越高表示扩增带的敏感性、特异性越好。
  1.2.5PCR扩增程序退火温度的筛选在确定最佳反应体系的基础上,对引物Ago66的退火温度在Tm值上下设置5个温度梯度进行筛选。
  1.2.6SSR最佳反应体系的验证 利用引物Ago59和Ago89验证此反应体系的可行性及稳定性。
  2结果与分析   2.1DNA提取
  用改进的十二烷基硫酸钠(SDS)法提取的枸杞棉蚜DNA样品浓度在 155~300 ng/mL,D260 nm/D280 nm值在1.65~1.88之间。经琼脂糖电泳检测,点样泳道均检测出明亮清晰的DNA条带,说明改进的SDS法提取枸杞棉蚜的DNA质量较高、完整、无降解,点样孔有微量蛋白质、多糖等杂质(图1)。结果表明,提取的DNA能够满足SSR-PCR试验要求。
  2.2单因素优化试验
  以枸杞棉蚜为材料,进行单因素优化试验,5个因素对SSR-PCR试验影响见图2。
  单因素优化试验结果表明,DNA浓度对扩增影响不大,在设定的DNA浓度下均能扩增出谱带,随DNA用量增加,扩增产物增多,其中40 ng扩增条带最清晰;DNA浓度高于 60 ng/μL,扩增产率高,但条带模糊。
  Taq DNA 聚合酶直接影响PCR扩增效率,0.5 U反应不能扩增出目的条带,含量高于2.5 U反应时,反而抑制扩增,使扩增条带弥散。
  设定的Mg2 浓度不同,扩增效果不同,150~250 μmol/L均能扩增出目的条带。Mg2 作为Taq酶的激活剂,浓度高于175 μmol/L时有非特异性扩增,Mg2 浓度升高时,会使PCR扩增产物背景加深。
  dNTPs是PCR扩增中磷酸基团的来源,低浓度易使其过早消耗,扩增效果差,多为扩增单链;高浓度的dNTPs,导致Taq酶错误掺入,引起错配,产生非特异性扩增,浓度大于 300 μmol/L 时,过量的dNTPs会与聚合酶结合抑制PCR反应。
  引物作为PCR扩增的原料,引物成功与模板DNA结合,便可扩增出有效片段,0.3~0.6 pmol/μL引物模板均能与DNA模板有效结合,都能扩增出条带,引物模板浓度高于 0.7 pmol/μL,引物易与自身结合并扩增,形成引物二聚体。
  2.3正交优化试验
  由图3可见,重复1中有5个组合没有扩出条带,另有2个组合条带很弱;重复2中有1个组合没有扩增条带,说明正交试验所设计的各个试验因素浓度梯度均没有偏离最适范围。依照评分标准,对各处理进行等级评分,依据条带强弱及杂带多少,2次处理评分结果分别为7、6,6、6,4、4,6、2,6、8,6、6,7、5,5、3,2、2,6、6,8、6,1、3,1、3,2、4,6、6,6、7,1、1,6、3,1、6,4、6,5、6,1、4,6、5,5、6,1、1。其中处理14重复性好,分值均较高,对比单因素试验结果,选择处理14作为最佳反应体系(50 ng模板DNA,1.5 U Taq DNA聚合酶,150 μmoL/L Mg2 ,300 μmol/L dNTPs,0.4 pmoL/μL引物)。
  本研究首先根据电泳平均得分求出每个因素下各水平的和Ti,然后求出每个因素下各水平的均值ki;最后求出同一因素ki的极差R。R越大,影响越大。极差分析结果(表3)表明,各因素影响大小排序为dNTPs>Mg2 >引物> Taq DNA聚合酶=DNA。因极差分析不能估计试验误差,无法确定分析的精度,为了判断各因素对棉蚜SSR-PCR反应的影响是否显著,笔者利用 SPSS 17.0对结果进一步进行方差分析,与极差分析结果一致,由Ⅲ型平方和比较可知,对扩增的影响排序为dNTPs>Mg2 >引物> Taq DNA聚合酶=DNA。dNTPs、Mg2 、引物对棉蚜SSR-PCR反应的影响极显著,Taq DNA聚合酶、DNA对棉蚜SSR-PCR反应的影响显著(表4)。
  2.4PCR反应退火温度的筛选
  退火温度决定PCR的特异性,引物退火温度在理论退火温度基础上进行设置,共设置5个温度梯度,依次为58、61、64、67、70 ℃。图4结果表明,PCR试验不同退火温度的条带特异性和敏感度均比较好,泳道的背景颜色随着退火温度升高而加深,其中58 ℃的条带特异性最优。
  2.5最佳反应体系的验证
  利用获得的最佳体系,用引物Ago53、Ago89对反应体系的验证结果(图5)表明,2对引物条带清晰,重复性好。
  3结论和讨论
  利用单因素试验结果分别分析5个因素对PCR反应的影响趋势,并利用正交优化试验研究5个因素对PCR反应的综合影响。综合单因素试验和正交设计试验结果,同时考虑到试剂成本,最终获得枸杞棉蚜SSR-PCR最优组合:枸杞棉蚜SSR-PCR的优化体系总体积为25 μL,包括50 ng模板DNA、 1.5 U Taq DNA聚合酶、150 μmoL/L Mg2 、300 μmol/L dNTPs、0.4 pmoL/μL引物PCR;适宜扩增程序为94 ℃ 5 min,94 ℃ 60 s、58 ℃ 60 s、72 ℃ 30 s、35次循环,72 ℃ 5 min。
  单因素试验表明,模板DNA、Taq DNA聚合酶、Mg2 、dNTPs、引物浓度5个因素均具有促进或抑制SSR-PCR扩增的影响。同刘永刚等利用单因素研究的桃蚜SSR最優反应体系[16]相比,枸杞棉蚜SSR研究所用Taq酶及DNA的量较少,说明Taq DNA聚合酶及DNA对SSR-PCR影响较小,少量即可满足枸杞棉蚜SSR-PCR,优化后的体系更为经济。正交试验表明,5个因素的影响大小排序为dNTPs>Mg2 >引物>Taq DNA 聚合酶=DNA。这一结果同谢家楠等研究的白背飞虱简单重复序列区间(ISSR)反应体系结果[17]基本一致,同张敏哲等研究的宽翅曲背蝗SSR反应体系结果相比,影响因素大小排序完全相反[18],这可能是由于材料物种的差异造成的。
  dNTPs是影响枸杞棉蚜SSR-PCR的最主要因素,为扩增时的4种核苷酸原料,低浓度使其过早消耗,扩增效率低。高浓度的dNTPs导致Taq酶错误掺入,引起错配,产生非特异性扩增,而浓度过高则会与 Taq DNA聚合酶竞争性结合Mg2 ,使酶反应活性降低,从而降低扩增效率。单因素扩增表明,dNTPs浓度为300 μmol/L时,过量的dNTPs会与聚合酶结合而抑制PCR反应;但是,由于存在5个因子的互作作用,在正交试验中,优化的体系中dNTPs浓度为300 μmol/L。Mg2 是影响枸杞棉蚜SSR-PCR的主要因素,它作为Taq DNA 聚合酶的催化剂,当浓度高于175 μmol/L时,能抑制Taq DNA 聚合酶的活性,有非特异性扩增,Mg2 离子浓度升高时,会使PCR扩增产物背景加深。本研究单因素试验与正交试验结果表明,150 μmol/L Mg2 是最适浓度。引物对 SSR-PCR影响也较大,单因素试验表明,作为结合模板DNA的原料的引物,引物浓度过高易产生引物二聚体或抑制扩增,并且正交试验结果也表明,适合的引物浓度为0.4 pmoL/μL。本研究中Taq DNA 聚合酶、模板DNA、引物的退火温度对SSR-PCR的影响较小,少量的Taq DNA 聚合酶、模板DNA和低的退火温度即可获得明亮清晰的特异性条带。   参考文献:
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