论文部分内容阅读
摘要：为了明确啤酒废酵母酶解蛋白诱剂对南亚实蝇和瓜实蝇的诱杀可行性，通过触角电位（EAG）技术测定这2种实蝇对啤酒废酵母酶解液中主要挥发性成分的EAG反应。结果表明：南亚实蝇雌雄虫对3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、苯甲醛和乙酸辛酯产生的EAG相对反应值与参照正己醇有显著差异（P<0.05），同时雄虫还对乙酸苯乙酯、辛酸乙酯产生的EAG相对反应值与正己醇有显著差异（P<0.05）。瓜实蝇雌虫对苯乙醇、乙酸苯乙酯、壬酸乙酯的EAG相对反应值与正己醇有显著差异（P<0.05），雄虫对3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、苯乙氰、壬酸乙酯的EAG相对反应值与正己醇有显著差异（P<0.05）。本研究结果为该蛋白诱剂在南亚实蝇和瓜实蝇防治上的应用及蛋白诱剂的人工配制提供了依据。
关键词：触角电位反应；啤酒废酵母；南亚实蝇；瓜实蝇
中图分类号： S475 .1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0187-02
全世界真正的实蝇科昆虫有4 500余种，主要分布在温带、亚热带和热带地区，对农业具有巨大威胁的主要是果实蝇属（Bactrocera）和实蝇属（Anastrepha）实蝇[1]。目前，国内危害最重的3种实蝇——橘小实蝇[B. dorsalis （Hendel）]、南亚实蝇[B. tau （Walker）]、瓜实蝇[B. cucurbitae （Coquillett）]，都屬于果实蝇属，仅广东省每年就造成33.67亿～12987 亿元的经济损失[2]。实蝇的主要防治措施有物理防治（清洁田园）、常规化学农药防治和性诱灭雄、食物诱杀和生物防治（释放寄生蜂和不育雄虫）。其中，蛋白诱剂诱杀利用实蝇性成熟和产卵必需取食蛋白质的生理特点[3]，防治效果非常理想[4]。杜迎刚等利用啤酒废酵母研发了一种橘小实蝇蛋白诱剂[5]，并通过GC-MS和EAG技术确定3-甲基-1-丁醇等6种主要活性成分[6-7]，为判断该蛋白诱剂对南亚实蝇和瓜实蝇诱杀防治的可行性及为实蝇蛋白诱剂的人工配制提供依据，本研究系统测定了南亚实蝇和瓜实蝇对啤酒废酵母酶解液中主要挥发性成分的电生理反应。
1 材料与方法
1.1 供试虫源
瓜实蝇、南亚实蝇均来自于福建农林大学益虫研究所，分别是2010年、2013年建立的室内大量饲养种群。
饲养流程：在实蝇产卵盛期采卵，收集发育较一致的实蝇于28 cm×28 cm×28 cm塑料骨架养虫笼内饲养（外加80目尼龙网），幼虫和成虫均是人工饲料饲养；饲养温度（25±1） ℃，相对湿度（75±5）%，光照时间07：00—19：00。
1.2 仪器和试剂
触角电位仪包括Syntech MP 15微动操作仪、毛细管电极、Syntech CS-05刺激气流控制装置和Syntech UN-06直流交流放大器，荷兰Syntech公司。
试剂包括3-甲基-1-丁醇（纯度99.6%）、壬酸乙酯（纯度99%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）、苯乙醇（纯度99%）、苯甲醛（纯度99.7%，北京百威科技有限公司）、乙酸辛酯（纯度99%产品，北京百灵威科技有限公司）、苯乙腈（标准品，美国AccuStandard公司）、辛酸乙酯（标准品，美国AccuStandard公司）、十二烷酸乙酯（标准品，美国AccuStandard公司）；乙酸苯乙酯（纯度98%，东京化成工业株式会社）；正己醇（纯度97%，美国Fluka公司）；石蜡油（纯品，比利时Acros Organics公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 样品配制 以石蜡油为溶剂，按V样品 ∶ V溶剂把各个样品配成1 ∶ 10和1 ∶ 100这2个浓度，样品试验当天配制。
1.3.2 触角连接 以2～6日龄未交配的南亚实蝇和瓜实蝇作为本试验用虫，EAG测定系统运行平稳后，用手术刀片迅速切下实蝇不带任何组织的完整触角，在显微镜下小心移动触角电位仪的微动操作仪，用移虫笔和解剖针把触角连接到毛细管电极的两端。
1.3.3 触角电位测定及数据计算 取样品20 μL均匀滴于三角形（约4 cm×0.5 cm）滤纸片上，滤纸片放入刺激管中，调整连续气流量、刺激载体流量，使其分别为124、20 mL/min。同一样品在同根触角上平行刺激3次，每次刺激0.2 s，2次刺激间隔50 s（以保证触角感受功能恢复），雌雄每日龄测定1次。刺激顺序为对照、参照、样品（从低浓度到高浓度）、对照（前后2次对照取平均值）。以正己醇为参照，以石蜡油为对照，根据下列公式计算每种样品的EAG相对反应值：
EAG相对反应值=（待测样品的反应值对照平均反应值）/（参照的反应值-对照平均反应值）×100%。
1.4 数据分析方法
用SPSS 17.0软件处理数据，采用单因子方差分析对试验数据进行分析，用Duncans新复极差法分析EAG反应值的差异显著性。
2 结果与分析
由表1可知，与正己醇相比，雌性南亚实蝇对浓度为 1 ∶ 100 的3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、苯甲醛和1 ∶ 10的3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、乙酸辛酯的EAG相对反应值有极显著差异（P<0.01）。
由表1还可知，与正己醇相比，雌性瓜实蝇对浓度为1 ∶ 100的乙酸苯乙酯和1 ∶ 10的苯乙醇、乙酸苯乙酯、壬酸乙酯的EAG相对反应值有显著差异（P<0.05）。
3 结论与讨论
啤酒废酵母酶解后对橘小实蝇具有很好的诱杀效果[8]，起引诱作用的主要挥发性物质为3-甲基-1-丁醇、苯甲醛、苯乙腈、辛酸乙酯、乙酸辛酯、乙酸苯乙酯[7]。很多研究结果表明，这些物质在橘小实蝇嗜好寄主中广泛存在，如3-甲基-1-丁醇存在于丝瓜、苦瓜中[9]；苯甲醛存在于苦瓜、甜瓜[10]、柑橘[11]中；乙酸辛酯存在于杂柑、甜橙、酸橙、柑橘、杨桃[12]、甜瓜、李中；乙酸苯乙酯存在于甜瓜中等。考虑到这些寄主大多也是瓜实蝇和南亚实蝇的嗜好寄主，所以有必要测定啤酒废酵母酶解液挥发性成分对瓜实蝇、南亚实蝇的EAG反应，验证该蛋白诱剂在防治橘小实蝇的同时对这2种实蝇的防治可行性。 与杜迎刚等的研究结果[7]相似，3-甲基-1-丁醇、苯甲醛、乙酸辛酯、乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、苯乙氰这些引起橘小实蝇较强的EAG反应的物质同样也能引起南亚实蝇和瓜实蝇较强的EAG反应，所以该蛋白诱剂必定对瓜实蝇和南亚实蝇也具有很强的引诱活性。苯乙醇引起瓜实蝇和南亚实蝇的EAG反应较橘小实蝇强，也是该蛋白诱剂中对瓜实蝇、南亚实蝇起引诱作用的重要成分；而壬酸乙酯仅能引起瓜实蝇较强的EAG反应，结合菠萝皮对其良好的诱杀效果[13]及其在菠萝香气组分中的检出情况[14]，判断壬酸乙酯是该蛋白诱剂挥发性成分中对瓜实蝇起引诱作用的主要物质。这些物质的挥发性不同，在该蛋白诱剂挥发性成分中的含量也不同，引起不同种类实蝇的EAG反应强度也有差异，或许就是该蛋白诱剂对3种实蝇雌雄虫引诱活性存在差异的内在原因，这也为该蛋白诱剂的下一步改进和人工配制提供了依据。
参考文献：
[1]Yang P J，Carey J R，Dowell R V. Tephritid fruit-flies in China-historical background and current status[J]. Pan-Pacific Entomologist，1994，70（2）：159-167.
[2]馬兴莉，李志红，胡学难，等. 橘小实蝇、瓜实蝇和南亚果实蝇对广东省造成的经济损失评估[J]. 植物检疫，2013，27（3）：50-56.
[3]Houston W W. Fluctuations in numbers and the significance of the sex-ratio of the Mexican fruit-fly，anastrepha-ludens caught in mcphail traps[J]. Entomologia Experimentalis et Applicata，1981，30（2）：140-150.
[4]James D B，Sridhar P. Feeding and survivorship of Blueberry maggot flies（Diptera：Tephritidae） on protein baits incorporated with insecticides[J]. Florida Entomologist，2005，88（3）：268-279.
[5]杜迎刚，陈家骅，季清娥. 一种新型蛋白诱剂对橘小实蝇引诱作用[J]. 福建林学院学报，2007，27（3）：259-262.
[6]杜迎刚，刘贞民，代惠洁. 橘小实蝇引诱蛋白——啤酒废酵母酶解的挥发性成分分析[J]. 安徽农业科学，2012，40（6）：3341-3342.
[7]杜迎刚，季清娥，陈家骅，等. 橘小实蝇对啤酒废酵母酶解液挥发性成分的触角电位反应[J]. 福建农林大学学报：自然科学版，2015，44（4）：355-359.
[8]杜迎刚，李云玲，季清娥. 啤酒废酵母酶解生产橘小实蝇引诱蛋白研究[J]. 安徽农业科学，2012，40（3）：1279-1280.
[9]张小凤. 橘小实蝇气味结合蛋白在雌虫产卵寄主选择中的作用研究及其基因鉴定[D]. 武汉：华中农业大学，2014：43-47.
[10]张新英.嫁接对甜瓜（Cucumis melon）苗期耐盐性和果实发育期品质的影响[D]. 北京：中国农业科学院，2014：41-46.
[11]江 倩.不同种类柑橘果实香气物质组成差异及其特征性组分鉴别[D]. 杭州：浙江大学，2013：23-26.
[12]刘胜辉，魏长宾，李伟才，等. 3个杨桃品种的果实香气成分分析[J]. 果树学报，2008，25（1）：119-121.
[13]李明桃.苦瓜瓜实蝇的生物学特性与防治技术[J]. 农业灾害研究，2012，2（3）：26-28.
[14]张秀梅，杜丽清，孙光明，等. 3个菠萝品种果实香气成分分析[J]. 食品科学，2009，30（22）：275-279.
关键词：触角电位反应；啤酒废酵母；南亚实蝇；瓜实蝇
中图分类号： S475 .1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0187-02
全世界真正的实蝇科昆虫有4 500余种，主要分布在温带、亚热带和热带地区，对农业具有巨大威胁的主要是果实蝇属（Bactrocera）和实蝇属（Anastrepha）实蝇[1]。目前，国内危害最重的3种实蝇——橘小实蝇[B. dorsalis （Hendel）]、南亚实蝇[B. tau （Walker）]、瓜实蝇[B. cucurbitae （Coquillett）]，都屬于果实蝇属，仅广东省每年就造成33.67亿～12987 亿元的经济损失[2]。实蝇的主要防治措施有物理防治（清洁田园）、常规化学农药防治和性诱灭雄、食物诱杀和生物防治（释放寄生蜂和不育雄虫）。其中，蛋白诱剂诱杀利用实蝇性成熟和产卵必需取食蛋白质的生理特点[3]，防治效果非常理想[4]。杜迎刚等利用啤酒废酵母研发了一种橘小实蝇蛋白诱剂[5]，并通过GC-MS和EAG技术确定3-甲基-1-丁醇等6种主要活性成分[6-7]，为判断该蛋白诱剂对南亚实蝇和瓜实蝇诱杀防治的可行性及为实蝇蛋白诱剂的人工配制提供依据，本研究系统测定了南亚实蝇和瓜实蝇对啤酒废酵母酶解液中主要挥发性成分的电生理反应。
1 材料与方法
1.1 供试虫源
瓜实蝇、南亚实蝇均来自于福建农林大学益虫研究所，分别是2010年、2013年建立的室内大量饲养种群。
饲养流程：在实蝇产卵盛期采卵，收集发育较一致的实蝇于28 cm×28 cm×28 cm塑料骨架养虫笼内饲养（外加80目尼龙网），幼虫和成虫均是人工饲料饲养；饲养温度（25±1） ℃，相对湿度（75±5）%，光照时间07：00—19：00。
1.2 仪器和试剂
触角电位仪包括Syntech MP 15微动操作仪、毛细管电极、Syntech CS-05刺激气流控制装置和Syntech UN-06直流交流放大器，荷兰Syntech公司。
试剂包括3-甲基-1-丁醇（纯度99.6%）、壬酸乙酯（纯度99%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）、苯乙醇（纯度99%）、苯甲醛（纯度99.7%，北京百威科技有限公司）、乙酸辛酯（纯度99%产品，北京百灵威科技有限公司）、苯乙腈（标准品，美国AccuStandard公司）、辛酸乙酯（标准品，美国AccuStandard公司）、十二烷酸乙酯（标准品，美国AccuStandard公司）；乙酸苯乙酯（纯度98%，东京化成工业株式会社）；正己醇（纯度97%，美国Fluka公司）；石蜡油（纯品，比利时Acros Organics公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 样品配制 以石蜡油为溶剂，按V样品 ∶ V溶剂把各个样品配成1 ∶ 10和1 ∶ 100这2个浓度，样品试验当天配制。
1.3.2 触角连接 以2～6日龄未交配的南亚实蝇和瓜实蝇作为本试验用虫，EAG测定系统运行平稳后，用手术刀片迅速切下实蝇不带任何组织的完整触角，在显微镜下小心移动触角电位仪的微动操作仪，用移虫笔和解剖针把触角连接到毛细管电极的两端。
1.3.3 触角电位测定及数据计算 取样品20 μL均匀滴于三角形（约4 cm×0.5 cm）滤纸片上，滤纸片放入刺激管中，调整连续气流量、刺激载体流量，使其分别为124、20 mL/min。同一样品在同根触角上平行刺激3次，每次刺激0.2 s，2次刺激间隔50 s（以保证触角感受功能恢复），雌雄每日龄测定1次。刺激顺序为对照、参照、样品（从低浓度到高浓度）、对照（前后2次对照取平均值）。以正己醇为参照，以石蜡油为对照，根据下列公式计算每种样品的EAG相对反应值：
EAG相对反应值=（待测样品的反应值对照平均反应值）/（参照的反应值-对照平均反应值）×100%。
1.4 数据分析方法
用SPSS 17.0软件处理数据，采用单因子方差分析对试验数据进行分析，用Duncans新复极差法分析EAG反应值的差异显著性。
2 结果与分析
由表1可知，与正己醇相比，雌性南亚实蝇对浓度为 1 ∶ 100 的3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、苯甲醛和1 ∶ 10的3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、乙酸辛酯的EAG相对反应值有极显著差异（P<0.01）。
由表1还可知，与正己醇相比，雌性瓜实蝇对浓度为1 ∶ 100的乙酸苯乙酯和1 ∶ 10的苯乙醇、乙酸苯乙酯、壬酸乙酯的EAG相对反应值有显著差异（P<0.05）。
3 结论与讨论
啤酒废酵母酶解后对橘小实蝇具有很好的诱杀效果[8]，起引诱作用的主要挥发性物质为3-甲基-1-丁醇、苯甲醛、苯乙腈、辛酸乙酯、乙酸辛酯、乙酸苯乙酯[7]。很多研究结果表明，这些物质在橘小实蝇嗜好寄主中广泛存在，如3-甲基-1-丁醇存在于丝瓜、苦瓜中[9]；苯甲醛存在于苦瓜、甜瓜[10]、柑橘[11]中；乙酸辛酯存在于杂柑、甜橙、酸橙、柑橘、杨桃[12]、甜瓜、李中；乙酸苯乙酯存在于甜瓜中等。考虑到这些寄主大多也是瓜实蝇和南亚实蝇的嗜好寄主，所以有必要测定啤酒废酵母酶解液挥发性成分对瓜实蝇、南亚实蝇的EAG反应，验证该蛋白诱剂在防治橘小实蝇的同时对这2种实蝇的防治可行性。 与杜迎刚等的研究结果[7]相似，3-甲基-1-丁醇、苯甲醛、乙酸辛酯、乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、苯乙氰这些引起橘小实蝇较强的EAG反应的物质同样也能引起南亚实蝇和瓜实蝇较强的EAG反应，所以该蛋白诱剂必定对瓜实蝇和南亚实蝇也具有很强的引诱活性。苯乙醇引起瓜实蝇和南亚实蝇的EAG反应较橘小实蝇强，也是该蛋白诱剂中对瓜实蝇、南亚实蝇起引诱作用的重要成分；而壬酸乙酯仅能引起瓜实蝇较强的EAG反应，结合菠萝皮对其良好的诱杀效果[13]及其在菠萝香气组分中的检出情况[14]，判断壬酸乙酯是该蛋白诱剂挥发性成分中对瓜实蝇起引诱作用的主要物质。这些物质的挥发性不同，在该蛋白诱剂挥发性成分中的含量也不同，引起不同种类实蝇的EAG反应强度也有差异，或许就是该蛋白诱剂对3种实蝇雌雄虫引诱活性存在差异的内在原因，这也为该蛋白诱剂的下一步改进和人工配制提供了依据。
参考文献：
[1]Yang P J，Carey J R，Dowell R V. Tephritid fruit-flies in China-historical background and current status[J]. Pan-Pacific Entomologist，1994，70（2）：159-167.
[2]馬兴莉，李志红，胡学难，等. 橘小实蝇、瓜实蝇和南亚果实蝇对广东省造成的经济损失评估[J]. 植物检疫，2013，27（3）：50-56.
[3]Houston W W. Fluctuations in numbers and the significance of the sex-ratio of the Mexican fruit-fly，anastrepha-ludens caught in mcphail traps[J]. Entomologia Experimentalis et Applicata，1981，30（2）：140-150.
[4]James D B，Sridhar P. Feeding and survivorship of Blueberry maggot flies（Diptera：Tephritidae） on protein baits incorporated with insecticides[J]. Florida Entomologist，2005，88（3）：268-279.
[5]杜迎刚，陈家骅，季清娥. 一种新型蛋白诱剂对橘小实蝇引诱作用[J]. 福建林学院学报，2007，27（3）：259-262.
[6]杜迎刚，刘贞民，代惠洁. 橘小实蝇引诱蛋白——啤酒废酵母酶解的挥发性成分分析[J]. 安徽农业科学，2012，40（6）：3341-3342.
[7]杜迎刚，季清娥，陈家骅，等. 橘小实蝇对啤酒废酵母酶解液挥发性成分的触角电位反应[J]. 福建农林大学学报：自然科学版，2015，44（4）：355-359.
[8]杜迎刚，李云玲，季清娥. 啤酒废酵母酶解生产橘小实蝇引诱蛋白研究[J]. 安徽农业科学，2012，40（3）：1279-1280.
[9]张小凤. 橘小实蝇气味结合蛋白在雌虫产卵寄主选择中的作用研究及其基因鉴定[D]. 武汉：华中农业大学，2014：43-47.
[10]张新英.嫁接对甜瓜（Cucumis melon）苗期耐盐性和果实发育期品质的影响[D]. 北京：中国农业科学院，2014：41-46.
[11]江 倩.不同种类柑橘果实香气物质组成差异及其特征性组分鉴别[D]. 杭州：浙江大学，2013：23-26.
[12]刘胜辉，魏长宾，李伟才，等. 3个杨桃品种的果实香气成分分析[J]. 果树学报，2008，25（1）：119-121.
[13]李明桃.苦瓜瓜实蝇的生物学特性与防治技术[J]. 农业灾害研究，2012，2（3）：26-28.
[14]张秀梅，杜丽清，孙光明，等. 3个菠萝品种果实香气成分分析[J]. 食品科学，2009，30（22）：275-279.