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摘要[目的]建立犬博卡病毒（Canine bocavirus，CBoV）的PCR检测方法，了解其流行情况。[方法]根据GenBank数据库上CBoV的VP2基因序列合成1对引物，建立PCR检测方法，并运用该方法对临床样品进行检测。[结果]特异性试验中，除CBoV有目的条带出现外，犬细小病毒（CPV）、犬瘟热病毒（CDV）、犬传染性肝炎（ICHV）、犬副流感病毒（CPIV）、猫瘟热（FDV）等均无条带出现。敏感性试验表明，此检测方法对CBoV的最低检测量为4.806 2 pg/μL。重复性试验表明，多次重复试验结果一致，表明此方法重复性好。425份样品中仅有1份样品扩增出目的条带，经测序比对鉴定为CBoV。初步的流行病学调查结果表明，CBoV在犬中的流行率与感染率极低。[结论]建立的PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、可重复性强等特点。
关键词犬博卡病毒；PCR检测方法；应用
中图分类号S852.65+5文献标识码A文章编号0517-6611（2016）10-148-02
Abstract[Objective] The aim was to establish canine bocavirus PCR detection method and study its prevalence.[Method] A pair of primers were synthesized according to the sequence of VP2 gene of CBoV on Genbank database，and the PCR detection method was established and was applied for detection of clinical sample.[Result] In specific tests，except for CBoV with the emergence of the band，CPV，CDV，ICHV，CPIV，FDV and so on were not brought to appear.Sensitivity experiments showed that the minimum detection amount of CBoV was 4.806 2 pg/μL.The results of repeated experiments were consistent，indicating that the method was reproducible.Among 425 samples，1 sample was amplified with the target bands，and the result was determined as CBoV.Preliminary epidemiological survey showed that the prevalence rate and infection rate of CBoV in dogs was very low.[Conclusion] The established detection method has characteristics of strong strong specificity，high sensitivity and strong repeatability.
Key wordsCanine bocavirus； PCR detection assay； Application
犬博卡病毒（Canine bocavirus，CBoV）隶属细小病毒科细小病毒亚科博卡病毒属，为单股线状无囊膜的DNA病毒。2005年，瑞典学者Allander等[1]从1份婴幼儿病例样本中分离并鉴定出此种病毒，命名为人博卡病毒（Human bocavirus，HBoV）。后来，牛博卡病毒、犬博卡病毒、猪博卡病毒、大猩猩博卡病毒、黑猩猩博卡病毒相继被发现[1-2]。虽然博卡病毒最先在患有肺炎的婴幼儿上呼吸道中被检测到，但后来的大量样品检测结果发现腹泻样品中博卡病毒的阳性率更高[3]。博卡病毒可感染并导致宿主发生急性腹泻[3-7]。近年来，人博卡病毒（HBoV）和猪博卡病毒（PBoV）各种基因型的分离与鉴定、检测方法、流行病学调查等日趋成熟全面[7-18]。犬博卡病毒（CBoV）在这些方面的研究资料比较欠缺[19-22]。为了解CBoV在犬类中的流行情况，笔者建立了犬博卡病毒的PCR检测方法，并应用此检测方法对广州地区犬博卡病毒的流行情况进行初步调查，旨在为今后CBoV的研究提供一些依据。
1材料与方法
1.1重组质粒、病毒及样品含有CBoVVP2基因的重组质粒，由广东省农业科学院动物衛生研究所诊断中心构建；犬细小病毒（CPV）由广东省农业科学院动物卫生研究所生物技术中心提供；犬瘟热病毒（CDV）、犬传染性肝炎（ICHV）、犬副流感病毒（CPIV）以及猫瘟热（FDV）细胞分离上清液由广东省农业科学院动物卫生研究所动物疫病诊断中心保存、样品由广东省农业科学院动物卫生研究所动物疫病诊断中心采集保存。所有DNA提取均按照AXYGEN公司的核酸提取试剂盒说明操作。
1.2引物设计根据GenBank数据库中的犬博卡VP2基因序列设计1对引物，上游引物为5′TTCTTTTTCCTTTGACTGCGGG3′；下游引物为5′GCGAGTGTGCGTCTAATCTGCT3′，目的片段大小为410 bp，交由上海生工生物工程股份有限公司广州分部合成。
1.3标准阳性质粒的构建经CBoVVP2引物扩增出的基因目的序列，用E.Z.N.A Gel Extraction Kit纯化，产物连接到pMD19T载体，转化到Top10感受态细胞，再交由上海生工生物工程股份有限公司广州分部测序。 1.4PCR方法的建立
1.4.1PCR反應条件的优化。PCR反应体系（25 μL）：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、DNA模板 3 μL、上下游引物各0.5 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃ 10 min。
（1）退火温度的优化。以克隆阳性质粒为DNA模板，退火温度设置为52～60 ℃，根据扩增效果筛选出最佳退火温度。
（2）引物用量的优化。以克隆阳性质粒为DNA模板，采用不同的引物用量（0.1～2.0 μL）进行扩增，筛选最佳引物用量。
1.4.2特异性试验。对PCR反应条件进行优化后，分别扩增CDV、CPV、ICHV、CPIV和FDV，以验证该引物的特异性。
1.4.3敏感性试验。用克隆质粒为标准阳性对照，检测该方法的敏感性。先测定质粒浓度，然后做10倍倍比稀释扩增体系（10-10～100）。
1.4.4重复性试验。将敏感性试验中所稀释的每个倍比数重复扩增3次以上，以验证该方法的重复性。
1.5临床样品的检测从广州某犬繁育场采集425份粪便样品，用1 mL PBS液体稀释后混匀，离心后取上清液，按照AXYGEN公司的核酸提取试剂盒说明操作提取DNA。运用优化的PCR方法对采集样品进行检测。
2结果与分析
2.1PCR方法的优化
2.1.1退火温度的优化。从图1可以看出，当退火温度为55 ℃时扩增效果最佳，因此最佳退火温度为55 ℃。
2.1.2引物用量的优化。从图2可以看出，当引物用量为1.0 μL时扩增效果最佳，因此最佳引物用量为1.0 μL。
2.2特异性试验运用以上优化的PCR方法分别扩增CDV、CPV、ICHV、CPIV、FDV和CBoV，结果发现只有CBoV可以扩增出目的片段，表明该PCR方法具有良好的特异性（图3）。
2.3敏感性试验克隆质粒的初始浓度为480.62 ng/μL，对其进行10倍倍比稀释（10-10-100），进行敏感性试验，结果发现该方法对DNA的最低检测量为4.806 2 pg/μL（图4）。
2.4重复性试验将敏感性试验中的每个倍比数重复扩增3次以上，结果均一致，表明该方法的重复性较好。
2.5临床样品的检测运用优化后的PCR方法对临床采集的425份样品进行检测，结果发现仅有1份为阳性，经测序鉴定为CBoV。
3讨论与结论
迄今为止，研究表明博卡病毒对动物具有致病性，但同时也有研究人员从健康犬中检测到博卡病毒[23]。自2005年博卡病毒被发现以来，国内对博卡病毒的研究大多集中在人博卡病毒和猪博卡病毒，犬博卡病毒在这方面的研究甚少。该研究中优化的PCR检测方法对犬博卡病毒的最低检测量为4.806 2 pg/μL，在425份被检样品中没有出现任何非特异性条带，表明该检测方法具有良好的特异性。在初步的流行病学调查中，425份样品中仅检测出1份为阳性，此次检测的样品采集时间为8～12月。其中，被检出的阳性样品为8月从1只成年贵宾犬的粪便中所采集的。此次初步调查发现，博卡病毒目前在犬中的流行率和感染率极低，对犬暂时不构成致病性。但是，由于采样对象和区域的局限性，并不能说明更大范围犬博卡病毒的流行情况。
参考文献
[1] ALLANDER T，TAMMI M T，ERIKSSON M，et al.Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples [J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102：12891-12896.
[2] ALLANDER T.Human bocavirus [J].J Clin Virol，2008，41（1）：29-33.
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[5] BLOMSTROM A L，BELK S，FOSSUM C，et al.Studies of porcine circovirus type 2，porcine bocalike virus and torque teno virus indicate the presence of multiple viral infections in postweaning multisystemic wasting syndrome pigs[J].Virus Res，2010，152（1/2）：59-64.
[6] MADEC F，ROSE N，GRASLAND B，et al.Postweaning multisys temic wasting syndrome and other PCV2related problems in pigs：A 12year experience [J].Transbound Emerg Dis，2008，55（7）：273-283. [7] HUANG L，ZHAI S L，CHEUNG A K，et al.Detection of a novel porcine parvovirus，PPV4，in Chinese swine herds [J].Virol J，2010，7：333-338.
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[14] BLOMSTRM A L，STHL K，OKURUT A R，et al.Genetic characterisation of a porcine bocavirus detected in domestic pigs in Uganda[J].Virus genes，2013，47（2）：370-373.
[15] CHOI M G，PARK S J，NGUYEN V G，et al.Molecular detection and genetic analysis of porcine bocavirus in Korean domestic swine herds[J].Archives of virology，2014，159（6）：1487-1492.
[16] HUANG J H，MOR S K，ERBER J，et al.Detection and characterization of porcine bocavirus in the United States[J].Archives of virology，2014，159：1797.
[17] YOO S J，SUNWOO S Y，KO S S，et al.A novel porcine bocavirus harbors a variant NP gene[J].Springer Plus，2015，4（1）：370.
[18] YANG W Z，HUANG C P，DUAN Z J.Identification and characterization of porcine bocavirus episomes[J].Bingdu Xuebao，2012，28（4）：418-423.
[19] 閆琰，张茜，马婧，等.犬博卡病毒非结构基因NP1多克隆抗体的制备与鉴定[J].吉林大学学报（医学版），2015（4）：864-869，890.
[20] LAU S K P，WOO P C Y，YEUNG H C，et al.Identification and characterization of bocaviruses in cats and dogs reveals a novel feline bocavirus and a novel genetic group of canine bocavirus[J].Journal of general virology，2012，93（Pt 7）：1573-1582.
[21] PRATELLI A，MOSCHIDOU P.Host range of Canine minute virus in cell culture.[J].Journal of veterinary diagnostic investigation，2012，24（5）：981-985.
[22] LI L L，PESAVENTO P A，LEUTENEGGER C M，et al.A novel bocavirus in canine liver[J].Virology journal，2013，10（2）：1-4.
[23] SHAN T L，LAN D L，LI L L，et al.Genomic characterization and high prevalence of bocaviruses in swine [J].PLoS One，2011，6（4）：17292.
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2016，44（10）：286-289
责任编辑徐丽华
关键词犬博卡病毒；PCR检测方法；应用
中图分类号S852.65+5文献标识码A文章编号0517-6611（2016）10-148-02
Abstract[Objective] The aim was to establish canine bocavirus PCR detection method and study its prevalence.[Method] A pair of primers were synthesized according to the sequence of VP2 gene of CBoV on Genbank database，and the PCR detection method was established and was applied for detection of clinical sample.[Result] In specific tests，except for CBoV with the emergence of the band，CPV，CDV，ICHV，CPIV，FDV and so on were not brought to appear.Sensitivity experiments showed that the minimum detection amount of CBoV was 4.806 2 pg/μL.The results of repeated experiments were consistent，indicating that the method was reproducible.Among 425 samples，1 sample was amplified with the target bands，and the result was determined as CBoV.Preliminary epidemiological survey showed that the prevalence rate and infection rate of CBoV in dogs was very low.[Conclusion] The established detection method has characteristics of strong strong specificity，high sensitivity and strong repeatability.
Key wordsCanine bocavirus； PCR detection assay； Application
犬博卡病毒（Canine bocavirus，CBoV）隶属细小病毒科细小病毒亚科博卡病毒属，为单股线状无囊膜的DNA病毒。2005年，瑞典学者Allander等[1]从1份婴幼儿病例样本中分离并鉴定出此种病毒，命名为人博卡病毒（Human bocavirus，HBoV）。后来，牛博卡病毒、犬博卡病毒、猪博卡病毒、大猩猩博卡病毒、黑猩猩博卡病毒相继被发现[1-2]。虽然博卡病毒最先在患有肺炎的婴幼儿上呼吸道中被检测到，但后来的大量样品检测结果发现腹泻样品中博卡病毒的阳性率更高[3]。博卡病毒可感染并导致宿主发生急性腹泻[3-7]。近年来，人博卡病毒（HBoV）和猪博卡病毒（PBoV）各种基因型的分离与鉴定、检测方法、流行病学调查等日趋成熟全面[7-18]。犬博卡病毒（CBoV）在这些方面的研究资料比较欠缺[19-22]。为了解CBoV在犬类中的流行情况，笔者建立了犬博卡病毒的PCR检测方法，并应用此检测方法对广州地区犬博卡病毒的流行情况进行初步调查，旨在为今后CBoV的研究提供一些依据。
1材料与方法
1.1重组质粒、病毒及样品含有CBoVVP2基因的重组质粒，由广东省农业科学院动物衛生研究所诊断中心构建；犬细小病毒（CPV）由广东省农业科学院动物卫生研究所生物技术中心提供；犬瘟热病毒（CDV）、犬传染性肝炎（ICHV）、犬副流感病毒（CPIV）以及猫瘟热（FDV）细胞分离上清液由广东省农业科学院动物卫生研究所动物疫病诊断中心保存、样品由广东省农业科学院动物卫生研究所动物疫病诊断中心采集保存。所有DNA提取均按照AXYGEN公司的核酸提取试剂盒说明操作。
1.2引物设计根据GenBank数据库中的犬博卡VP2基因序列设计1对引物，上游引物为5′TTCTTTTTCCTTTGACTGCGGG3′；下游引物为5′GCGAGTGTGCGTCTAATCTGCT3′，目的片段大小为410 bp，交由上海生工生物工程股份有限公司广州分部合成。
1.3标准阳性质粒的构建经CBoVVP2引物扩增出的基因目的序列，用E.Z.N.A Gel Extraction Kit纯化，产物连接到pMD19T载体，转化到Top10感受态细胞，再交由上海生工生物工程股份有限公司广州分部测序。 1.4PCR方法的建立
1.4.1PCR反應条件的优化。PCR反应体系（25 μL）：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、DNA模板 3 μL、上下游引物各0.5 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃ 10 min。
（1）退火温度的优化。以克隆阳性质粒为DNA模板，退火温度设置为52～60 ℃，根据扩增效果筛选出最佳退火温度。
（2）引物用量的优化。以克隆阳性质粒为DNA模板，采用不同的引物用量（0.1～2.0 μL）进行扩增，筛选最佳引物用量。
1.4.2特异性试验。对PCR反应条件进行优化后，分别扩增CDV、CPV、ICHV、CPIV和FDV，以验证该引物的特异性。
1.4.3敏感性试验。用克隆质粒为标准阳性对照，检测该方法的敏感性。先测定质粒浓度，然后做10倍倍比稀释扩增体系（10-10～100）。
1.4.4重复性试验。将敏感性试验中所稀释的每个倍比数重复扩增3次以上，以验证该方法的重复性。
1.5临床样品的检测从广州某犬繁育场采集425份粪便样品，用1 mL PBS液体稀释后混匀，离心后取上清液，按照AXYGEN公司的核酸提取试剂盒说明操作提取DNA。运用优化的PCR方法对采集样品进行检测。
2结果与分析
2.1PCR方法的优化
2.1.1退火温度的优化。从图1可以看出，当退火温度为55 ℃时扩增效果最佳，因此最佳退火温度为55 ℃。
2.1.2引物用量的优化。从图2可以看出，当引物用量为1.0 μL时扩增效果最佳，因此最佳引物用量为1.0 μL。
2.2特异性试验运用以上优化的PCR方法分别扩增CDV、CPV、ICHV、CPIV、FDV和CBoV，结果发现只有CBoV可以扩增出目的片段，表明该PCR方法具有良好的特异性（图3）。
2.3敏感性试验克隆质粒的初始浓度为480.62 ng/μL，对其进行10倍倍比稀释（10-10-100），进行敏感性试验，结果发现该方法对DNA的最低检测量为4.806 2 pg/μL（图4）。
2.4重复性试验将敏感性试验中的每个倍比数重复扩增3次以上，结果均一致，表明该方法的重复性较好。
2.5临床样品的检测运用优化后的PCR方法对临床采集的425份样品进行检测，结果发现仅有1份为阳性，经测序鉴定为CBoV。
3讨论与结论
迄今为止，研究表明博卡病毒对动物具有致病性，但同时也有研究人员从健康犬中检测到博卡病毒[23]。自2005年博卡病毒被发现以来，国内对博卡病毒的研究大多集中在人博卡病毒和猪博卡病毒，犬博卡病毒在这方面的研究甚少。该研究中优化的PCR检测方法对犬博卡病毒的最低检测量为4.806 2 pg/μL，在425份被检样品中没有出现任何非特异性条带，表明该检测方法具有良好的特异性。在初步的流行病学调查中，425份样品中仅检测出1份为阳性，此次检测的样品采集时间为8～12月。其中，被检出的阳性样品为8月从1只成年贵宾犬的粪便中所采集的。此次初步调查发现，博卡病毒目前在犬中的流行率和感染率极低，对犬暂时不构成致病性。但是，由于采样对象和区域的局限性，并不能说明更大范围犬博卡病毒的流行情况。
参考文献
[1] ALLANDER T，TAMMI M T，ERIKSSON M，et al.Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples [J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102：12891-12896.
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[3] ARTHUR J L，HIGGINS G D，DAVIDSON G P，et al.A novel bocavirus associated with acute gastroenteritis in Australian children [J].PLoS Pathog，2009，5（4）：1000391.
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[8] 卢艳，李丹地，金玉，等.博卡病毒的检测方法概述[J].病毒学报，2014（3）：298-302.
[9] 程卫霞.博卡病毒流行病学、致病性及基因进化研究[D].兰州：兰州大学，2011.
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[12] DINA J，VABRET A，GOUARIN S，et al.Detection of human bocavirus in hospitalised children[J].Journal of paediatrics and child health，2009，45（3）：149-153.
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[15] CHOI M G，PARK S J，NGUYEN V G，et al.Molecular detection and genetic analysis of porcine bocavirus in Korean domestic swine herds[J].Archives of virology，2014，159（6）：1487-1492.
[16] HUANG J H，MOR S K，ERBER J，et al.Detection and characterization of porcine bocavirus in the United States[J].Archives of virology，2014，159：1797.
[17] YOO S J，SUNWOO S Y，KO S S，et al.A novel porcine bocavirus harbors a variant NP gene[J].Springer Plus，2015，4（1）：370.
[18] YANG W Z，HUANG C P，DUAN Z J.Identification and characterization of porcine bocavirus episomes[J].Bingdu Xuebao，2012，28（4）：418-423.
[19] 閆琰，张茜，马婧，等.犬博卡病毒非结构基因NP1多克隆抗体的制备与鉴定[J].吉林大学学报（医学版），2015（4）：864-869，890.
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[21] PRATELLI A，MOSCHIDOU P.Host range of Canine minute virus in cell culture.[J].Journal of veterinary diagnostic investigation，2012，24（5）：981-985.
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[23] SHAN T L，LAN D L，LI L L，et al.Genomic characterization and high prevalence of bocaviruses in swine [J].PLoS One，2011，6（4）：17292.
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2016，44（10）：286-289
责任编辑徐丽华