【摘 要】
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Rev蛋白是所有慢病毒属成员均具有的附属蛋白,它与病毒mRNA的特定序列结合,将编码病毒结构蛋白的mRNA运输至胞浆,从而促进病毒结构蛋白的表达,将Rev介导病毒mRNA核质运输的生物学功能简称为核输出活性.为建立马传染性贫血病毒(EIAV)附属蛋白Rev的核输出活性检测方法,本研究通过PCR方法克隆了EIAV的结构蛋白Gag-Pol编码区序列及Rev反应元件(RRE)序列,构建pGagpol-RRE表达载体,将其单独或与Rev表达载体(pcDNA-RevFDDV-HA)共转染HEK293T细胞后,通过w
【机 构】
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吉林农业大学动物科学技术学院,吉林 长春 130118;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150069;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室
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Rev蛋白是所有慢病毒属成员均具有的附属蛋白,它与病毒mRNA的特定序列结合,将编码病毒结构蛋白的mRNA运输至胞浆,从而促进病毒结构蛋白的表达,将Rev介导病毒mRNA核质运输的生物学功能简称为核输出活性.为建立马传染性贫血病毒(EIAV)附属蛋白Rev的核输出活性检测方法,本研究通过PCR方法克隆了EIAV的结构蛋白Gag-Pol编码区序列及Rev反应元件(RRE)序列,构建pGagpol-RRE表达载体,将其单独或与Rev表达载体(pcDNA-RevFDDV-HA)共转染HEK293T细胞后,通过western blot分析显示,pGagpol-RRE单独转染HEK293T细胞不表达,须在Rev的作用下才能在HEK293T细胞中表达,而且Gag的表达量随着Rev剂量(0.05 μg、0.1μg、0.2μg)的增加而增加.在pcDNA-RevFDDV-HA的基础上,通过PCR方法将Rev核输出活性的关键位点L36突变成A,构建突变的Rev表达载体pcDNA-RevL36A-HA,将其与pGagpol-RRE共转染HEK293T细胞后,经westernblot检测结果显示,未检测到Gag的表达.上述结果表明表达载体pGagpol-RRE可以用于评价EIAV Rev的核输出活性.在此基础上,本研究将不同EIAV的Rev表达载体与pGagPol-RRE共转染HEK293T细胞,经western blot鉴定结果显示,不同EIAV的Rev均可以介导Gag-Pol的表达.上述结果表明,表达载体pGagpol-RRE转染细胞后经western blot检测Gag表达量的变化可以广泛用于评价不同EIAV Rev的核输出活性.本研究利用Rev与RRE结合介导Gag-Pol表达的原理首次建立了 EIAV Rev核输出活性检测系统,为进一步研究Rev的生物学活性奠定了基础.
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单核细胞增生李斯特菌(Lm)是主要的食源性致病菌之一,也是一种重要的人畜共患病原菌,感染人和动物后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多症等.为建立快速检测Lm的方法,本研究以Lm毒力因子actA作为特异性检测的靶基因,通过条件优化初步建立了快速检测食源性Lm的环介导等温扩增(LAMP)方法.并采用该方法进行了特异性、敏感性及临床样品检测试验.结果显示,利用建立的LAMP方法检测Lm、肠出血性大肠杆菌O157∶H7、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森菌、产气荚膜梭菌、空肠弯曲菌、胸膜肺炎放线
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非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由 ASF 病毒(ASFV)感染家猪和野猪引起的一种高度接触性传染病,不同日龄的猪均易感.急性型ASF临床表现为高热、皮肤发绀和各脏器出血,病死率可高达100％,对全球养猪业造成重大的经济损失[11.世界动物卫生组织(OIE)将ASF列为法定报告动物疫病,我国将其列为一类动物疫病[2].2018年8月,辽宁省沈阳市暴发了我国首例ASF疫情,随后蔓延至我国各省[3].由于目前尚无商品化的疫苗及治疗药物,所以ASF的防控主要依靠检疫、扑杀以及严格的生
为了研究锡兰钩虫鞘脂激活蛋白样蛋白(Ace-SLP-1)的免疫学特性,本研究以锡兰钩虫成虫cDNA为模板,根据GenBank中Ace-SLP-1基因序列(DQ855414.1)设计特异性引物,采用RT-PCR扩增Ace-SLP-1基因,结果显示,PCR扩增了Ace-SLP-1基因,其ORF全长315bp,编码104个氨基酸;利用在线软件对其编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析,结果显示该蛋白为疏水蛋白,前17个氨基酸为信号肽序列且有跨膜结构域等;根据Ace-SLP-1基因编码氨基酸序列信息将其成熟肽编码
为筛选表达量高且免疫原性强的红斑丹毒丝菌表面保护性抗原A(SpaA)的抗原片段,本研究根据该菌SpaA的结构和功能区将其设计为6个子片段和1个全长片段,采用PCR技术从红斑丹毒丝菌HG-1菌株中扩增出SpaA的7个抗原基因片段,利用原核表达系统克隆并表达后采用SDS-PAGE和western blot检测表达及纯化情况.结果显示,获得7个重组蛋白,分别命名为rSpaA1～rSpaA7,其表达量占菌体总蛋白的17.44％～25.38％,其中rSpaA1、rSpaA2、rSpaA5以包涵体形式表达,rSpaA
为了研究单核细胞增生李斯特菌(Lm)RsbS蛋白的抗应激机制,本研究设计针对rsbS基因完整ORF的引物,PCR扩增rsbS基因,构建重组表达质粒pET-30a-rsbS,转化至表达菌株Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导培养后SDS-PAGE检测,结果显示获得18.8 ku带His标签的重组RsbS蛋白,利用His-Ni纯化柱纯化重组RsbS蛋白,得到浓度约1 μg/mL的纯化蛋白.以纯化的重组RsbS蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,经间接ELISA测定抗体效价为1∶128 000;经western
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