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【摘要】目的：探究血清甲胎蛋白（Alpha fetoprotein，AFP）与超声联合DNA5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylation，5-hmC）在原发性肝癌早期筛查中的临床应用价值;方法：选择2019年1月至2019年12月于九江市第三人民医院接受诊治的80例疑似原发性肝癌患者为研究对象，分别对其开展血清AFP、超声以及5-hmc检测，以病理学检测结果为金标准，分别评估3种检测方式在原发性肝癌早期筛查中的应用价值;结果：血清AFP对原发性肝癌诊断一致性、灵敏度和特异度分别为61.25%、48.84%和70.00%，超声诊断一致性、灵敏度和特异度分别为56.25%、37.21%和78.38%，5-hmc诊断一致性、灵敏度和特异度分别为83.75%、81.40%和86.49%;3种检测方式联合检测对原发性肝癌诊断一致性、灵敏度和特异度分别为95.00%、97.67%、91.89%，相较其他联合检测三种方式联合诊断价值最高（P<0.05）;结论：血清AFP、超声和5-hmc检测应用于原发性肝癌早期筛查中，可以提高早期肝癌的发现率。
【关键词】血清AFP;超声;5-hmc;原发性肝癌;早期筛查;临床应用
【中图分类号】R735.7 【文献标识码】A 【DOI】
【基金项目】血清AFP与超声联合DNA5-羟基胞嘧啶检测在原发性肝癌早期筛查中的临床应用;（编号：20191108;合同编号：20202042）
肝细胞癌（HCC）目前是我国死亡率位居第二的恶性肿瘤，HCC在慢性肝病及肝硬化患者中呈现发病率高、恶性程度高等相关特征，70%以上肝癌患者被确诊已到中晚期，因此早期的筛查和诊断显得尤为关键[1]。目前临床常用筛查方法为AFP和超声，已有的研究证实约有30%的肝癌患者AFP为阴性[2]，而超声检测在≤2cm的肝脏肿瘤的灵敏度只有20%[3]。近年来，表观遗传修饰5hmc（5-羟甲基胞嘧啶）的高通量检测作为新型、高效的肝癌筛查手段，能够从肝癌形成的源头切入检测，更早更准发现肝癌，其灵敏度和特异性均高达90%。可以作为一种早期的筛查分子[3]。本研究拟通过纳入80例疑似肝癌患者并分别分析血清AFP、超声、5hmc对原发性肝癌诊断价值的方式，进一步论证将上述检测手段联合应用于原发性肝癌鉴别中的临床意义，以期为原发性肝癌患者的早期诊断与预后改善提供临床参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2019年1月至2019年12月于我院接受诊治的80例疑似原发性肝癌患者为研究对象。
入组标准：HBV病毒携带者有以下任何一项：（1）>40岁的男性，>50岁的女性;（2）肝硬化患者;（3）有肝癌家族史者;（4）其他无肝硬化的HBV病毒携带者，根据肝炎活动严重程度来判断是否属于高危人群。
排除标准：（1）合并有肝脏肿瘤;（2）有不稳定性心绞痛、症状性充血性心衰、严重的心律失常、过去6个月有心梗、QT间期延长（>450ms）;（3）最近5年之内出现其他部位的恶性肿瘤;（4）患者不能接受随访或正参加其它临床试验。
1.2 干预方法
1.2.1血清AFP检测
抽取静脉血3ml，置一次性采血管内，充分离心，不应有溶血及细胞颗粒，吸取血清0.2ml至专用杯中并放入DXI800发光仪进行检测。
1.2.2超声检查
所有患者在进行超声检查前8～12h内禁食、禁水。检查时，患者先采取仰卧位，平稳呼吸，两手上举置于枕后，然后采取侧卧位或坐位。根据患者实际情况，将仪器调整至最佳状况，先进行常规肝脏扫查，观察左右肝叶的形态改变情况，包膜光滑程度，肝实质回声增粗、粗糙和分布均匀程度，寻找病灶。
1.2.3Nano 5HmC-Seal技术
（1）游离DNA提取：按照Quick-cfDNA Serum&Plasma Kit （Zymo）产品说明书从血浆中提取cfDNA，cfDNA样本需要进行回收率质控和污染质控。
（2）添加接头：修复cfDNA或片段化的基因组DNA并与衔接子连接。
（3）5hmC标记：使用T4噬菌体酶β-GT将含有叠氮基的工程化葡萄糖部分转移至双链体DNA中的5hmC。
（4）点击化学反应：使用Huisgen Cycloaddition（点击）化学，将生物素标签安装在叠氮基上。
（5）磁珠捕获：具有生物素标签的含5hmC的DNA片段被抗生素蛋白珠有效捕获。
（6）PCR扩增和二代测序：常规PCR扩增产生文库，将获得的测序文库通过qPCR进行浓度测定，并用Agilent2100对文库中DNA片段大小含量进行确定。将通过质检的测序文库以相同浓度混合，用Illumina测序仪进行测序。测序原始数据Raw Data经得到的clean reads，作为后续分析的基础。通过计算每个基因的reads数。通过对数据质量评估，包括对测序错误率、数据量等進行统计，评估建库测序是否达到标准，符合标准的数据册进行后续的分析。
（7）确定各基因标志物的5hmC含量，将获得的测序结果进行初步质控评估，将达到测序质量标准的独段利用Bowtie2工具与人类标准基因组参考序列进行比较，继而确定各基因5hmC含量。
1.3 观察指标及评测标准
正常人血清AFP浓度<20ng/ml，本研究以血清AFP浓度≥20ng/
ml为阳性;超声检测以发现病灶为阳性;以5-mhc≥5.29%为阳性[9]。
1.4 统计学方法
应用SPSS13.0统计软件进行，计量资料以（均值±标准差）或中位数、四分位间距分布表示，组间比较采用独立样本t检验;计数资料用百分比（%）表示，采用卡方检验（X 2）。取P<0.05时差异具有统计学意义。 2 结果
2.1 血清AFP、超声及5-hmc对原发性肝癌诊断价值分析
以病理学检测结果为金标准，评估血清AFP对原发性肝癌诊断价值显示，诊断一致性为61.25%，诊断灵敏度为48.84%，诊断特异度为70.00%，见表1。以病理学检测结果为金标准，超声对原发性肝癌诊断一致性为56.25%，诊断灵敏度为37.21%，诊断特异度为78.38%，见表2。以病理学检测结果为金标准，5-hmc对原发性肝癌诊断一致性为83.75%，诊断灵敏度为81.40%，诊断特异度为86.49%，见表3。
2.2 联合检测对原发性肝癌诊断价值分析
分别将血清AFP、超声以及5-hmc检测结果进行检测分析，同样以病理学结果为金标准，评估显示3种检测方式联合检测临床价值最优，其诊断一致性为95.00%，诊断灵敏度为97.67%，诊断特异度为91.89%，相较其他联合检测三种方式联合诊断价值最高（P<0.05），见表4。
3 讨论
一项调研指出，国内现有肝癌例数约35万，占同期癌症发病例数的11.6%左右[4]。肝癌的确切分子机制目前尚不清晰，但多数研究指出病毒感染、饮水污染、酒精、肝硬化等都与肝癌的发生发展存在密切联系。DNA羟甲基化修饰是指10-11易位（ten-eleven translocation，TET）蛋白家族通过氧化5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mc）生成5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylation，5-hmc），使基因甲基化状态终止[5]。本研究通过将80例疑似肝癌患者纳入研究并分别实施血清AFP、超声以及5-hmc检测的方式，就上述3种措施联合检测对原发性肝癌诊断价值进行了分析，结果显示，单纯血清AFP对原发性肝癌诊断一致性、灵敏度和特异度分别为61.25%、48.84%和70.00%，超声诊断一致性、灵敏度和特异度分别为56.25%、37.21%和78.38%，5-hmc诊断一致性、灵敏度和特异度分别为83.75%、81.40%和86.49%。将血清AFP、超声以及5-hmc联合检测后再次分析显示，联合检测一致性、灵敏度和特异度分别为95.00%、97.67%、91.89%，同任一单纯检测方式相比较，3种方式联合检测的临床价值显著更优。国内杨国华[6]的研究显示，TET家族可以催化5mc出现连续氧化反应，通过羟化形成5hmc，而该过程可以转化胞嘧啶，进而实现DNA的去甲基化，这也是诱发细胞恶变的重要原因之一。
本文作者分析认为，5hmC是5mC主动去甲基化过程中的重要中间产物，被称为“第六种DNA碱基”，5hmC参与肝癌的发生发展过程，能够实时动态地反映癌症相关的基因表达活性，尽管肝癌早期或极早期肿瘤组织释放入血的循环肿瘤DNA量很低，但5hmC化学标记捕获技术在循环肿瘤DNA低至1ng情况下仍有稳定的检测结果，本研究通过联合血清AFP、超声以及5hmc的方式，为原发性肝癌的诊治提供了新的思路举措，可以筛查和诊断早期的肝癌患者，为提高患者的生存期打下良好基础。
综上所述，血清AFP、超声和5-hmc检测应用于原发性肝癌早期筛查中，可以提高早期肝癌的发现率。
参考文献：
[1]李治军，纪永利.超声造影在诊断慢性肝炎背景下直径≤2cm肝局灶性病变中的应用[J].肝脏，2018，23（11）：97-98.
[2]文天夫.原发性肝癌诊疗规范（2017年版）解读[J].中国普外基础与临床杂志，2018，25（1）：32-34.
[3]王双佳，李秀东，苏旭，等.原发性肝癌患者术后肝外转移复发分析[J].中华肝胆外科杂志，2018，24（5）：341-343.
[4]赵颖，孟成立.超声造影診断原发性肝癌的价值和增强CT对比观察[J].中国CT和MRI杂志，2021，19（1）：129-131.
[5]汪鑫，闫亮亮，王兴宇，等.通过目标区域DNA甲基化测序对隐源性肝癌差异性DNA甲基化谱的研究[J].肝胆外科杂志，2020，28（2）：149-153.
[6]杨国华.TET2/E-cadherin/β-catenin调控环路在肝癌演进中的作用研究[D].南方医科大学，2018.
作者简介：
汤雄（1964.11.11-），男，汉族，江西，主任医师，科主任，本科，研究方向：肝病临床和基础研究。
【关键词】血清AFP;超声;5-hmc;原发性肝癌;早期筛查;临床应用
【中图分类号】R735.7 【文献标识码】A 【DOI】
【基金项目】血清AFP与超声联合DNA5-羟基胞嘧啶检测在原发性肝癌早期筛查中的临床应用;（编号：20191108;合同编号：20202042）
肝细胞癌（HCC）目前是我国死亡率位居第二的恶性肿瘤，HCC在慢性肝病及肝硬化患者中呈现发病率高、恶性程度高等相关特征，70%以上肝癌患者被确诊已到中晚期，因此早期的筛查和诊断显得尤为关键[1]。目前临床常用筛查方法为AFP和超声，已有的研究证实约有30%的肝癌患者AFP为阴性[2]，而超声检测在≤2cm的肝脏肿瘤的灵敏度只有20%[3]。近年来，表观遗传修饰5hmc（5-羟甲基胞嘧啶）的高通量检测作为新型、高效的肝癌筛查手段，能够从肝癌形成的源头切入检测，更早更准发现肝癌，其灵敏度和特异性均高达90%。可以作为一种早期的筛查分子[3]。本研究拟通过纳入80例疑似肝癌患者并分别分析血清AFP、超声、5hmc对原发性肝癌诊断价值的方式，进一步论证将上述检测手段联合应用于原发性肝癌鉴别中的临床意义，以期为原发性肝癌患者的早期诊断与预后改善提供临床参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2019年1月至2019年12月于我院接受诊治的80例疑似原发性肝癌患者为研究对象。
入组标准：HBV病毒携带者有以下任何一项：（1）>40岁的男性，>50岁的女性;（2）肝硬化患者;（3）有肝癌家族史者;（4）其他无肝硬化的HBV病毒携带者，根据肝炎活动严重程度来判断是否属于高危人群。
排除标准：（1）合并有肝脏肿瘤;（2）有不稳定性心绞痛、症状性充血性心衰、严重的心律失常、过去6个月有心梗、QT间期延长（>450ms）;（3）最近5年之内出现其他部位的恶性肿瘤;（4）患者不能接受随访或正参加其它临床试验。
1.2 干预方法
1.2.1血清AFP检测
抽取静脉血3ml，置一次性采血管内，充分离心，不应有溶血及细胞颗粒，吸取血清0.2ml至专用杯中并放入DXI800发光仪进行检测。
1.2.2超声检查
所有患者在进行超声检查前8～12h内禁食、禁水。检查时，患者先采取仰卧位，平稳呼吸，两手上举置于枕后，然后采取侧卧位或坐位。根据患者实际情况，将仪器调整至最佳状况，先进行常规肝脏扫查，观察左右肝叶的形态改变情况，包膜光滑程度，肝实质回声增粗、粗糙和分布均匀程度，寻找病灶。
1.2.3Nano 5HmC-Seal技术
（1）游离DNA提取：按照Quick-cfDNA Serum&Plasma Kit （Zymo）产品说明书从血浆中提取cfDNA，cfDNA样本需要进行回收率质控和污染质控。
（2）添加接头：修复cfDNA或片段化的基因组DNA并与衔接子连接。
（3）5hmC标记：使用T4噬菌体酶β-GT将含有叠氮基的工程化葡萄糖部分转移至双链体DNA中的5hmC。
（4）点击化学反应：使用Huisgen Cycloaddition（点击）化学，将生物素标签安装在叠氮基上。
（5）磁珠捕获：具有生物素标签的含5hmC的DNA片段被抗生素蛋白珠有效捕获。
（6）PCR扩增和二代测序：常规PCR扩增产生文库，将获得的测序文库通过qPCR进行浓度测定，并用Agilent2100对文库中DNA片段大小含量进行确定。将通过质检的测序文库以相同浓度混合，用Illumina测序仪进行测序。测序原始数据Raw Data经得到的clean reads，作为后续分析的基础。通过计算每个基因的reads数。通过对数据质量评估，包括对测序错误率、数据量等進行统计，评估建库测序是否达到标准，符合标准的数据册进行后续的分析。
（7）确定各基因标志物的5hmC含量，将获得的测序结果进行初步质控评估，将达到测序质量标准的独段利用Bowtie2工具与人类标准基因组参考序列进行比较，继而确定各基因5hmC含量。
1.3 观察指标及评测标准
正常人血清AFP浓度<20ng/ml，本研究以血清AFP浓度≥20ng/
ml为阳性;超声检测以发现病灶为阳性;以5-mhc≥5.29%为阳性[9]。
1.4 统计学方法
应用SPSS13.0统计软件进行，计量资料以（均值±标准差）或中位数、四分位间距分布表示，组间比较采用独立样本t检验;计数资料用百分比（%）表示，采用卡方检验（X 2）。取P<0.05时差异具有统计学意义。 2 结果
2.1 血清AFP、超声及5-hmc对原发性肝癌诊断价值分析
以病理学检测结果为金标准，评估血清AFP对原发性肝癌诊断价值显示，诊断一致性为61.25%，诊断灵敏度为48.84%，诊断特异度为70.00%，见表1。以病理学检测结果为金标准，超声对原发性肝癌诊断一致性为56.25%，诊断灵敏度为37.21%，诊断特异度为78.38%，见表2。以病理学检测结果为金标准，5-hmc对原发性肝癌诊断一致性为83.75%，诊断灵敏度为81.40%，诊断特异度为86.49%，见表3。
2.2 联合检测对原发性肝癌诊断价值分析
分别将血清AFP、超声以及5-hmc检测结果进行检测分析，同样以病理学结果为金标准，评估显示3种检测方式联合检测临床价值最优，其诊断一致性为95.00%，诊断灵敏度为97.67%，诊断特异度为91.89%，相较其他联合检测三种方式联合诊断价值最高（P<0.05），见表4。
3 讨论
一项调研指出，国内现有肝癌例数约35万，占同期癌症发病例数的11.6%左右[4]。肝癌的确切分子机制目前尚不清晰，但多数研究指出病毒感染、饮水污染、酒精、肝硬化等都与肝癌的发生发展存在密切联系。DNA羟甲基化修饰是指10-11易位（ten-eleven translocation，TET）蛋白家族通过氧化5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mc）生成5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylation，5-hmc），使基因甲基化状态终止[5]。本研究通过将80例疑似肝癌患者纳入研究并分别实施血清AFP、超声以及5-hmc检测的方式，就上述3种措施联合检测对原发性肝癌诊断价值进行了分析，结果显示，单纯血清AFP对原发性肝癌诊断一致性、灵敏度和特异度分别为61.25%、48.84%和70.00%，超声诊断一致性、灵敏度和特异度分别为56.25%、37.21%和78.38%，5-hmc诊断一致性、灵敏度和特异度分别为83.75%、81.40%和86.49%。将血清AFP、超声以及5-hmc联合检测后再次分析显示，联合检测一致性、灵敏度和特异度分别为95.00%、97.67%、91.89%，同任一单纯检测方式相比较，3种方式联合检测的临床价值显著更优。国内杨国华[6]的研究显示，TET家族可以催化5mc出现连续氧化反应，通过羟化形成5hmc，而该过程可以转化胞嘧啶，进而实现DNA的去甲基化，这也是诱发细胞恶变的重要原因之一。
本文作者分析认为，5hmC是5mC主动去甲基化过程中的重要中间产物，被称为“第六种DNA碱基”，5hmC参与肝癌的发生发展过程，能够实时动态地反映癌症相关的基因表达活性，尽管肝癌早期或极早期肿瘤组织释放入血的循环肿瘤DNA量很低，但5hmC化学标记捕获技术在循环肿瘤DNA低至1ng情况下仍有稳定的检测结果，本研究通过联合血清AFP、超声以及5hmc的方式，为原发性肝癌的诊治提供了新的思路举措，可以筛查和诊断早期的肝癌患者，为提高患者的生存期打下良好基础。
综上所述，血清AFP、超声和5-hmc检测应用于原发性肝癌早期筛查中，可以提高早期肝癌的发现率。
参考文献：
[1]李治军，纪永利.超声造影在诊断慢性肝炎背景下直径≤2cm肝局灶性病变中的应用[J].肝脏，2018，23（11）：97-98.
[2]文天夫.原发性肝癌诊疗规范（2017年版）解读[J].中国普外基础与临床杂志，2018，25（1）：32-34.
[3]王双佳，李秀东，苏旭，等.原发性肝癌患者术后肝外转移复发分析[J].中华肝胆外科杂志，2018，24（5）：341-343.
[4]赵颖，孟成立.超声造影診断原发性肝癌的价值和增强CT对比观察[J].中国CT和MRI杂志，2021，19（1）：129-131.
[5]汪鑫，闫亮亮，王兴宇，等.通过目标区域DNA甲基化测序对隐源性肝癌差异性DNA甲基化谱的研究[J].肝胆外科杂志，2020，28（2）：149-153.
[6]杨国华.TET2/E-cadherin/β-catenin调控环路在肝癌演进中的作用研究[D].南方医科大学，2018.
作者简介：
汤雄（1964.11.11-），男，汉族，江西，主任医师，科主任，本科，研究方向：肝病临床和基础研究。