根据GenBank中H5、H7、H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白(HA)编码基因,使用DNAStar软件比较分析筛选出特异的保守片段,设计3对引物H5-P1/H5-P2、H7-P3/P4和H9-P5/P6。在此基础上,建立了H5、H7、H9亚型禽流感的三重RT-PCR检测方法,本方法可同时检测出样品中的H5、H7、H9亚型禽流感病毒。敏感性试验结果表明,该方法检测H5、H7、H9亚型禽流感RNA的敏感性分别达2.80、10.50、5.73pg/μL,该方法检测其他相关病毒时均为阴性,具有很高的特异性,此外,该方法具有良好的重复性。利用所建立方法对240份禽流感临床样品进行检测,结果与血凝试验和血凝抑制试验结果的符合率为100%。此诊断方法检出时间早,且特异、敏感、经济、快速,可普遍推广,在禽流感诊断和防制中具有重要意义和应用价值。