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摘要：溃疡性结肠炎是局限于黏膜和黏膜下层的肠道非特异性炎症，肠上皮细胞和细胞间连接构成了动态的物理屏障，将黏膜组织与腔内共生细菌、病原体和饮食抗原隔开。肠上皮屏障渗漏被认为是溃疡性结肠炎的重要发病机制，而紧密连接功能异常是造成渗漏的主要原因。通过对紧密连接在溃疡性结肠炎疾病进展中所起作用以及中药活性成分、中药复方对紧密连接的基础研究和临床研究加以整理，发现中医药能使紧密连接蛋白Claudin-2表达下调，使Claudin-1、Occludin、ZO-1、ZO-2表达上调，恢复肠黏膜屏障作用，维持肠道环境的稳态，减轻溃疡性结肠炎的症状。
关键词：溃疡性结肠炎;中药活性成分;中药复方;紧密连接;Claudins;Occludin;ZOs
中图分类号：R516.1 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2021）05-0078-05
溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是病因未明、发病机制不清的局限于黏膜和黏膜下层的肠道非特异性炎症[1]，多数研究认为其发病是在遗传易感基因的背景下，受到多种环境因素刺激（吸烟、饮食、接触污染和共生肠道微生物群）而发病[2，3]。普遍认为，肠道微生物的移位造成免疫系统激活是发病基础，肠上皮在其中起机械屏障作用，紧密连接则是肠上皮机械屏障中最重要的细胞间连接[4]。紧密连接功能正常，可以有效阻挡抗原的暴露、中断白细胞募集、可溶介质释放，减轻肠道炎症。目前，UC发病的分子机制不断被揭示，多种新型生物制剂被相继研发，给患者治疗提供了新选择，但仍有部分患者存在原发性无应答[5]或继发性失应答情况[6]，其他药物（5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂等）也存在各种弊端[7]，因此，探索新的治疗方法是当前的紧要任务。中医药以整体观念和辨证论治为核心思想，在临床实践中能够有效控制患者病情，但其作用机制未被阐明。肠道屏障是维持机体内环境稳态的关键，本文就近年来中药活性成分和中药复方干预机械屏障中紧密连接的基础研究和临床研究进行总结和分析，为临床治疗提供更合理的证据。
1 紧密连接在溃疡性结肠炎的作用
紧密连接又称封闭连接，存在于管腔、腺体和皮肤表面，是上皮细胞侧表面最顶端的连接，有效阻止病原微生物的进入。紧密连接由多种蛋白构成，主要包括跨膜蛋白Claudins、Occludin、Tricellulin和胞浆蛋白ZOs[8]。目前，已发现的Claudins蛋白家族有27个亚型，不同亚型在不同组织内和组织间的表达各不相同。受到广泛研究的是Claudin-1、Claudin-2、Claudin-4蛋白，有研究发现过表达Claudin-1基因的小鼠患结肠炎几率增加，表现为修复受损和异常增生[9];Claudin-2蛋白在轻中度溃疡性结肠炎患者的结肠样本中表达量上调，并且Claudin-2的升高水平与内镜Geboes评分呈正相关，因此Claudin-2可以作为疾病治疗后评价恢复程度的指标[10];与Claudin-2成孔蛋白不同，Claudin-4是封孔蛋白，其蛋白和mRNA 水平在溃疡性结肠炎活动期患者中表达下调，当其表达量上调时可以恢复肠道屏障功能，减轻炎症水平[11]。Occludin蛋白和ZO蛋白家族同样在维持肠道紧密连接中起重要作用，在UC活动期和静止期患者中Occludin和ZO-1蛋白水平较正常患者水平降低，而在黏膜愈合的静止期UC患者ZO-1的表达明显高于无黏膜愈合的UC患者，可见Occludin和ZO-1蛋白在UC中起保护作用[12]。ZO-2与ZO-1同属胞浆蛋白家族，虽然分子量不同，但在溃疡性结肠炎中表现相同[13]。由此可见，跨膜蛋白与胞浆蛋白共同维持肠道屏障的稳定，在溃疡性结肠炎患者中常表现为多种蛋白表达量同时发生变化。
2 中药活性成分对UC紧密连接的干预
2.1 生物碱类 小檗碱（BBR）又称黄连素，是中药黄连、黄柏等清热解毒药物中主要的活性成分，因其具有抗炎、降脂和保护心、肝、肾等多种器官的作用[14]，受到学者的关注。除外其对中枢神经系统、心血管系统的保护作用，BBR与炎症性肠病的作用机制也得到广泛研究[15]。李恒等[16]研究结果表明，BBR可以上调肠黏膜中紧密连接蛋白的表达，恢复肠上皮屏障功能，同时BBR还能抑制肠神经胶质细胞分泌炎性递质、阻断黏附分子及趋化因子对炎性细胞招募而降低炎性细胞浸润。结果表明，BBR通过多种途径干预溃疡性结肠炎的发展，有效缓解溃疡性结肠炎。
小檗红碱（BB）是BBR的主要活性代谢产物之一，有研究表明[17]在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中，BB（20 mg/kg）在降低疾病活动评分（DAI）、延長结肠长度和增加体重方面所产生的治疗效果与BBR（50 mg/kg）和阳性对照柳氮磺吡啶（200 mg/kg）相当。BB可明显改善DSS诱导的结肠病理改变并降低组织学评分。此外，BB通过减轻炎性细胞浸润并抑制髓过氧化物酶（MPO）和细胞因子（TNF-α，IFN-γ，IL-1β，IL-6，IL-4和IL-10）产生，从而减轻了结肠炎症。同时，BB可以显著上调小鼠紧密连接蛋白（ZO-1，ZO-2，Occludin）的表达和黏蛋白（MUC-1和MUC-2）的mRNA表达。可见BB在改善DSS诱导的UC具有与BBR和阳性对照相似的作用，且剂量低、机理相似。所观察到的保护作用可能与BB在维持肠黏膜屏障的完整性和减轻肠炎症有关。
2.2 黄酮类 柑橘药用资源（陈皮、青皮、枳实、枳壳等）中存在多种黄酮类化合物，Wei 等[18]基于柑橘中三种黄酮类化合物：柚皮苷、橙皮素和川陈皮素，分析其对三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的溃疡性结肠炎大鼠保护作用，结果表明三种成分均能明显改善体重减轻和结肠短缩情况，降低DAI，并且显著上调Claudin-2蛋白、Occludin蛋白和ZO-1蛋白的表达;同时，利用脂多糖诱导Caco-2和RAW264.7细胞共培养体系检测对肠上皮细胞损伤的保护作用，研究显示三种黄酮类化合物均能增加跨上皮电阻，降低肠黏膜通透性，上调Occludin和ZO-1的表达。可以看出，柚皮苷、橙皮素和川陈皮素可能通过保护结肠黏膜层完整性而发挥对UC的调节作用。 马齿苋是临床中针对溃疡性结肠炎患者大肠湿热证的常用中药，具有清热利湿、解毒消肿等作用，其主要化学成分是脂肪酸及其他有机酸、黄酮类、生物碱类化合物。山奈酚是马齿苋的主要活性成分之一，Yifei等[19]研究发现，在肠上皮细胞和肠微血管内皮细胞共培养模型中，山奈酚可以抑制由脂多糖导致的上皮紧密连接蛋白丢失，恢复肠道屏障功能，并且他们认为山奈酚是通过 NF-κB 信号通路来抑制肠上皮炎症和紧密连接蛋白功能失常，由此可见，马齿苋在体内发挥作用可能由山奈酚这一活性成分的存在。
山姜素（Alpinetin）也是黄酮类化合物，分子式为C16H14O4，主要存在于姜科植物姜黄、豆蔻、郁金中，具有抗炎作用。Yue等[20]应用8-10周龄 C57BL/6小鼠进行研究，发现在UC模型中，山姜素可以改善黏膜糜烂，炎性浸润和隐窝丢失情况，并且能够显著上调Occludin和ZO-1的表达，并降低Claudin-2的表达水平，且治疗效果与剂量增加有关。结果表明山姜素通过调节紧密蛋白的功能维持肠上皮屏障的完整性和通透性，降低DAI，改善小鼠的结肠缩短和体重减轻情况。
2.3 其他 广藿香是芳香化湿类中药，具有化湿和中作用，广泛用于湿着中阻等证。广藿香醇（PA）是其提取物，具有抗炎、预防结肠炎等多种药理作用[21]。Wu等[13]研究发现PA能够调节紧密连接蛋白的表达，在TNBS和DSS所诱导的结肠炎模型中，均能显著上调Claudin-1、Occludin、ZO-2的蛋白表达水平，改善组织学损伤。同样，在Chang等[22]的研究中也得出了同样的结论。除了广藿香醇外，广藿香油也是广藿香的常见提取物。广藿香油在Gan等[23]研究中被证实能够显著增加ZO-1和Occludin mRNA的表达，稳定肠上皮屏障，改善黏膜损伤。可见，广藿香的不同提取物对肠道炎症均有良好的改善作用。
此外，还有学者应用两种活性成分治疗UC。黄芪多糖是中药黄芪的主要活性成分，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化等多种作用。苦参碱属吡啶类生物碱中双稠哌啶类，可从苦参、山豆根等中药材中提取，两者活性成分药理作用均有报导[24-25]。Xin等[26]认为在既往研究中，黄芪多糖、苦参碱对溃疡性结肠炎大鼠有治疗作用，但二者联合治疗未见报道，因此在其实验中除黄芪多糖治疗组和苦参碱治疗组外，新增两者联合治疗组，蛋白免疫印迹结果显示，与模型组和阳性对照组相比，三组均能提高ZO-1蛋白在肠黏膜中表达，以联合治疗组在第四周时效果最明显;通过免疫组织化学分析，模型组结肠组织Occludin蛋白表达在第二周和第四周较正常组显著降低，其他治疗组结肠组织Occludin蛋白表达均高于模型组，尤以第四周时黄芪多糖治疗组和单体混合物组明显，表明黄芪多糖、苦参碱联合使用能有效提高肠道ZO-1、Occludin的表达，对溃疡性结肠炎的治疗思路提供了新的方向。
3 中药复方对UC紧密连接的干预
3.1 参苓白术散 参苓白术散是《太平惠民和剂局方》中用于治疗脾虚湿盛泄泻或是肺虚喘咳证的方剂，在现代已广泛应用于多种内科病症，如功能性消化不良、腹泻、溃疡性结肠炎等[27]。在临床随机对照试验中[28]，在使用柳氮磺吡啶的基础上加用参苓白术散作为实验组，临床综合疗效显著高于单用药物;与单用柳氮磺吡啶相比，实验组在中医证候、病理学积分及内镜活动指数评分等方面均具有统计学意义。除临床报道外，针对参苓白术散治疗溃疡性结肠炎的潜在分子机制，也有大量的基础研究。在刘翠英等[29]的研究中，高剂量参苓白术散组与模型组相比显著增加了肠道Occludin蛋白的表达，减轻肠道炎症，并且调节了MLCK/MLC 通路蛋白表达，对DSS诱导的结肠损伤具有良好的恢复作用。此外，参苓白术散还被证实有下调血清炎症因子IL-1β、IL-4，结肠NLR受体家族NLRP3、NLRP6蛋白等作用[30]。
3.2 甘草泻心汤 甘草泻心汤出自《伤寒论》，原书治疗伤寒中风误下所导致的心下痞证和，在临床中常用来治疗消化系统疾病。在陈浩等[31]的动物实验中，采用TNBS/乙醇造模方法诱导溃疡性结肠炎模型，分别用美沙拉嗪和高、中、低剂量甘草泻心汤灌胃治疗14 d，结果表明与空白组相比，造模后的各组大鼠结肠Claudin-1的蛋白和mRNA 水平显著下降，但与模型组相比，美沙拉嗪和各剂量甘草泻心汤治疗组Claudin-1蛋白和mRNA表达水平增高，其中以中剂量组效果最为明显，说明甘草泻心汤可能通过改善肠道Claudin-1水平恢复肠道屏障功能。除了甘草泻心汤对溃疡性结肠炎的肠道屏障有恢复作用外，半夏泻心汤也被证实有类似的作用。在徐凤等[32]的研究中，半夏泻心汤也能显著提高因为炎症本身造成的ZO-1和Occludin蛋白的下降，使肠黏膜通透性趋向正常，降低疾病活动评分。
3.3 白头翁汤和芍药汤 白头翁汤和芍药汤都为治痢之方，白头翁汤主治热毒痢疾，芍药汤主治湿热痢疾，二者在临床中针对不同证型的患者均有良好的疗效。缪志伟[33]通过meta分析得出白頭翁汤与美沙拉嗪合用与单用美沙拉嗪相比，有更好的总体疗效和肠镜下黏膜改变。通过进一步实验，证实白头翁汤通过抑制促炎因子表达、增加抑炎因子水平来调节免疫反应，并且其还能增加肠道Occludin和ZO-1蛋白的表达，减轻肠道通透性，修复肠道物理屏障。陈大光等[34]发现芍药汤也具有保护肠道屏障的功能，他们通过透射电镜观察到应用了芍药汤的大鼠肠道紧密连接破坏较模型组轻，大鼠的一般情况、疾病活动评分也有更好的表现。
3.4 经验方 除经方外，现代学者根据自己多年临床经验总结了一系列经验方。清肠温中汤[35]是李军祥教授治疗溃疡性结肠炎患者的常用方剂，由黄连、炮姜、地榆炭、青黛、木香、三七、炙甘草组成，具有化瘀止血、平调寒热功效，临床效果显著。毛堂友等[36-37]在基础研究中发现，清肠温中汤除了可以降低炎症因子的表达，还可以显著上调大鼠结肠Claudin-1、Claudin-4的mRNA 和蛋白表达水平，保护肠黏膜屏障，同时，清肠温中汤还可以使结肠Occludin和ZO-1蛋白表达升高，抑制Claudin-2蛋白的表达，改善肠道紧密连接蛋白的功能。沈洪[38]教授使用清肠化湿方（黄连，黄芩，白头翁，煨木香，炒当归，炒白芍，生地榆，白蔹，炮姜和炙甘草）在临床治疗湿热内蕴证患者疗效显著，对于中度溃疡性结肠炎患者，中西医结合治疗在降低粪钙卫蛋白、降低疾病活动度优于单用美沙拉嗪缓释颗粒。傅书山等[39]探索其潜在的作用机制，发现在湿热证小鼠模型中，清肠化湿方能降低DAI评分，降低血清炎症因子表达，降低结肠Claudin-2蛋白和mRNA水平，缓解结肠黏膜损伤。 4 小结
UC作为炎症性肠病的常见类型，发病率总体呈上升趋势[40]，肠上皮屏障受损这一发病机制受到学者的广泛关注。有研究认为紧密连接屏障受损是溃疡性结肠炎的始动发病机制，在屏障功能正常时，尽管持续激活肌球蛋白轻链激酶（MLCK）模拟炎症因子刺激状态，但并不能引起炎症[41]。也有研究证实在炎症性肠病缓解期，存在上皮细胞过度脱落和损失的患者比上皮细胞完整的患者更易复发[42]。并且谭悦等[43]在研究中发现Occludin和 ZO-1蛋白的表达与Mayo临床评分（MCS）、Mayo内镜评分（MCSe）、Geboes指数呈负相关，这证明紧密连接蛋白有可能成为评价UC患者肠道炎症和预测黏膜愈合程度的指标。
本文总结了近3年中药活性成分和中药复方对紧密连接的作用，可以看出对UC紧密连接有良好治疗作用的中药活性成分多为生物碱、黄酮类，中药复方多具有健脾、祛湿、清热、理气等作用，与UC的基本病因病机（脾胃虚弱为本，湿热内蕴，气血失调为因）一致。根据整理的基础研究和临床研究文献，发现中药活性成分和中药复方可以通过多靶点起效，不仅能够改善肠上皮屏障，还能抑制炎症因子的表达从而减轻肠道炎症反应，对改善UC有确切疗效。中医药作为我国的传统医学，蕴含着巨大的研究价值，值得我们进一步研究其潜在的分子机制治疗各种难治性疾病。
参考文献：
[1]ABRAHAM C，CHO J H.Inflammatory bowel disease[J].N Engl J Med，2009，361（21）：2066-2078.
[2]ORDAS I，ECKMANN L，TALAMINI M，et al.Ulcerative colitis[J].Lancet，2012，380（9853）：1606-1619.
[3]DANESE S，FIOCCHI C.Etiopathogenesis of inflammatory bowel diseases[J].World J Gastroenterol，2006，12（30）：4807-4812.
[4]CITI S.Intestinal barriers protect against disease[J].Science，2018，359（6380）：1097-1098.
[5]BEN-HORIN S，KOPYLOV U，CHOWERS Y.Optimizing anti-TNF treatments in inflammatory bowel disease[J].Autoimmun Rev，2014，13（1）：24-30.
[6]ROSTHOLDER E，AHMED A，CHEIFETZ A S，et al.Outcomes after escalation of infliximab therapy in ambulatory patients with moderately active ulcerative colitis[J].Aliment Pharmacol Ther，2012，35（5）：562-567.
[7]楊黄欢，叶玲娜，曹倩.硫唑嘌呤治疗炎症性肠病患者的不良反应分析[J].中华炎性肠病杂志，2017（2）：92-95.
[8]KRUG S M，SCHULZKE J D，FROMM M.Tight junction，selective permeability，and related diseases[J].Semin Cell Dev Biol，2014，36：166-176.
[9]POPE J L，BHAT A A，SHARMA A，et al.Claudin-1 regulates intestinal epithelial homeostasis through the modulation of Notch-signalling[J].Gut，2014，63（4）：622-634.
[10]RANDALL K，HENDERSON N，REENS J，et al.Claudin-2 Expression Levels in Ulcerative Colitis：Development and Validation of an In-Situ Hybridisation Assay for Therapeutic Studies[J].PLoS One，2016，11（9）：e0162076.
[11]OSHIMA T，MIWA H，JOH T.Changes in the expression of claudins in active ulcerative colitis[J].J Gastroenterol Hepatol，2008，23 Suppl 2：S146-150.
[12]TAN Y，GUAN Y，SUN Y，et al.Correlation of Intestinal Mucosal Healing and Tight Junction Protein Expression in Ulcerative Colitis Patients[J].Am J Med Sci，2019，357（3）：195-204.
[13]WU Z，ZENG H，ZHANG L，et al.Patchouli Alcohol：a Natural Sesquiterpene Against Both Inflammation and Intestinal Barrier Damage of Ulcerative Colitis[J].Inflammation，2020，43（4）：1423-1435.
[14]于浩，杜建玲.小檗碱的药理作用及机制的研究现状[J].中国现代应用药学，2020，37（4）：501-507. [15]唐煌尧，杨亭，赵华，等.小檗碱对炎症性肠病肠道屏障的影响及其信号通路[J].动物营养学报，2020，32（2）：523-529.
[16]李恒，左建平，唐炜.小檗碱通过调控溃疡性结肠炎肠道神经免疫炎症保护黏膜屏障损伤[J].中国药理学与毒理学杂志，2019，33（9）：673.
[17]YU X T，XU Y F，HUANG Y F，et al.Berberrubine attenuates mucosal lesions and inflammation in dextran sodium sulfate-induced colitis in mice[J].PLoS One，2018，13（3）：e0194069.
[18]HE W，LIU M，LI Y，et al.Flavonoids from Citrus aurantium ameliorate TNBS-induced ulcerative colitis through protecting colonic mucus layer integrity[J].Eur J Pharmacol，2019，857：172456.
[19]BIAN Y，DONG Y，SUN J，et al.Protective Effect of Kaempferol on LPS-Induced Inflammation and Barrier Dysfunction in a Coculture Model of Intestinal Epithelial Cells and Intestinal Microvascular Endothelial Cells[J].J Agric Food Chem，2020，68（1）：160-167.
[20]TAN Y，ZHENG C.Effects of Alpinetin on Intestinal Barrier Function，Inflammation and Oxidative Stress in Dextran Sulfate Sodium-Induced Ulcerative Colitis Mice[J].Am J Med Sci，2018，355（4）：377-386.
[21]張伟，张娟娟，郭庆丰，等.广藿香醇药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2020，26（3）：213-221.
[22]QU C，YUAN Z W，YU X T，et al.Patchouli alcohol ameliorates dextran sodium sulfate-induced experimental colitis and suppresses tryptophan catabolism[J].Pharmacol Res，2017，121：70-82.
[23]GAN Y，AI G，WU J，et al.Patchouli oil ameliorates 5-fluorouracil-induced intestinal mucositis in rats via protecting intestinal barrier and regulating water transport[J].J Ethnopharmacol，2020，250：112519.
[24]吴甜甜，刘雪珂，刘妙华，等.苦参素的免疫药理作用途径研究进展[J].中药药理与临床，2020，36（1）：234-238.
[25]马秀，刘少静，张婉莹，等.黄芪多糖的分离纯化及药理作用研究进展[J].化学工程师，2019，33（8）：50-53.
[26]YAN X，LU Q G，ZENG L，et al.Synergistic protection of astragalus polysaccharides and matrine against ulcerative colitis and associated lung injury in rats[J].World J Gastroenterol，2020，26（1）：55-69.
[27]宋惠凤，金火星.参苓白术散的现代临床应用概述[J].中成药，2013，35（2）：379-383.
[28]陈天杰，张明红.参苓白术散治疗慢性复发型溃疡性结肠炎的疗效及基于β2AR/β-arrestin2/NF-κB信号转导通路的作用机制[J].中药材，2020，41（9）：999-1002.
[29]刘翠英，施家希，黄娟，等.参苓白术散对溃疡性结肠炎小鼠紧密连接及MLCK/MLC通路的影响[J].中药材，2018，41（9）：2180-2184.
[30]张嘉骏，施家希，黄娟，等.参苓白术散对溃疡性结肠炎小鼠NLPR3，NLPR6蛋白及相关炎症因子表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2019，25（4）：36-41.
[31]陈浩，张波，徐速，等.甘草泻心汤联合美沙拉嗪对溃疡性结肠炎的疗效及对血清炎症指标的影响[J].中药材，2017，40（2）：475-478.
[32]徐凤，毛艺纯，周淑芬，等.半夏泻心汤对溃疡性结肠炎小鼠肠道黏膜屏障功能保护作用及ZO-1和Occludin表达的影响[J].中国中医基础医学杂志，2019，25（1）：44-47+51.
[33]缪志伟.白头翁汤治疗溃疡性结肠炎的机制探讨以及新加白头翁汤的临床疗效评价[D].南京：南京中医药大学，2020.
[34]陈大光，曹晖，李令，等.芍药汤对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织机械屏障及细胞因子的影响[J].安徽中医药大学学报，2019，38（4）：67-71. [35]姜慧，李军祥，谭祥，等.李军祥教授治疗溃疡性结肠炎经验[J].中国中西医结合消化杂志，2019，27（3）：232-235.
[36]MAO T，LI J，LIU L，et al.Qingchang Wenzhong Decoction Attenuates DSS-Induced Colitis in Rats by Reducing Inflammation and Improving Intestinal Barrier Function via Upregulating the MSP/RON Signalling Pathway[J].Evid Based Complement Alternat Med，2017，2017：4846876.
[37]毛堂友，裴文靜，史瑞，等.清肠温中方促进DSS诱导溃疡性结肠炎大鼠结肠claudin-l、claudin-4表达修复肠黏膜屏障的机制研究[J].世界科学技术-中医药现代化，2018，20（7）：1232-1237.
[38]赵崧，王晓骁，张露，等.清肠化湿方联合美沙拉嗪对溃疡性结肠炎患者粪便钙卫蛋白的影响[J].河北医学，2018，24（3）：445-448.
[39]傅书山，朱磊，王琼，等.清肠化湿方对溃疡性结肠炎湿热证小鼠NLRP6蛋白及相关炎症因子表达的影响[J].中国中西医结合杂志，2020，40（5）：582-588.
[40]ZENG Z，ZHU Z，YANG Y，et al.Incidence and clinical characteristics of inflammatory bowel disease in a developed region of Guangdong Province，China：a prospective population-based study[J].J Gastroenterol Hepatol，2013，28（7）：1148-1153.
[41]SU L，SHEN L，CLAYBURGH D R，et al.Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis[J].Gastroenterology，2009，136（2）：551-563.
[42]KIESSLICH R，DUCKWORTH C A，MOUSSATA D，et al.Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease[J].Gut，2012，61（8）：1146-1153.
[43]谭悦，郑长清.紧密连接蛋白occludin、ZO-1在溃疡性结肠炎中的表达及其临床意义[J].现代药物与临床，2018，33（7）：1803-1808.
关键词：溃疡性结肠炎;中药活性成分;中药复方;紧密连接;Claudins;Occludin;ZOs
中图分类号：R516.1 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2021）05-0078-05
溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是病因未明、发病机制不清的局限于黏膜和黏膜下层的肠道非特异性炎症[1]，多数研究认为其发病是在遗传易感基因的背景下，受到多种环境因素刺激（吸烟、饮食、接触污染和共生肠道微生物群）而发病[2，3]。普遍认为，肠道微生物的移位造成免疫系统激活是发病基础，肠上皮在其中起机械屏障作用，紧密连接则是肠上皮机械屏障中最重要的细胞间连接[4]。紧密连接功能正常，可以有效阻挡抗原的暴露、中断白细胞募集、可溶介质释放，减轻肠道炎症。目前，UC发病的分子机制不断被揭示，多种新型生物制剂被相继研发，给患者治疗提供了新选择，但仍有部分患者存在原发性无应答[5]或继发性失应答情况[6]，其他药物（5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂等）也存在各种弊端[7]，因此，探索新的治疗方法是当前的紧要任务。中医药以整体观念和辨证论治为核心思想，在临床实践中能够有效控制患者病情，但其作用机制未被阐明。肠道屏障是维持机体内环境稳态的关键，本文就近年来中药活性成分和中药复方干预机械屏障中紧密连接的基础研究和临床研究进行总结和分析，为临床治疗提供更合理的证据。
1 紧密连接在溃疡性结肠炎的作用
紧密连接又称封闭连接，存在于管腔、腺体和皮肤表面，是上皮细胞侧表面最顶端的连接，有效阻止病原微生物的进入。紧密连接由多种蛋白构成，主要包括跨膜蛋白Claudins、Occludin、Tricellulin和胞浆蛋白ZOs[8]。目前，已发现的Claudins蛋白家族有27个亚型，不同亚型在不同组织内和组织间的表达各不相同。受到广泛研究的是Claudin-1、Claudin-2、Claudin-4蛋白，有研究发现过表达Claudin-1基因的小鼠患结肠炎几率增加，表现为修复受损和异常增生[9];Claudin-2蛋白在轻中度溃疡性结肠炎患者的结肠样本中表达量上调，并且Claudin-2的升高水平与内镜Geboes评分呈正相关，因此Claudin-2可以作为疾病治疗后评价恢复程度的指标[10];与Claudin-2成孔蛋白不同，Claudin-4是封孔蛋白，其蛋白和mRNA 水平在溃疡性结肠炎活动期患者中表达下调，当其表达量上调时可以恢复肠道屏障功能，减轻炎症水平[11]。Occludin蛋白和ZO蛋白家族同样在维持肠道紧密连接中起重要作用，在UC活动期和静止期患者中Occludin和ZO-1蛋白水平较正常患者水平降低，而在黏膜愈合的静止期UC患者ZO-1的表达明显高于无黏膜愈合的UC患者，可见Occludin和ZO-1蛋白在UC中起保护作用[12]。ZO-2与ZO-1同属胞浆蛋白家族，虽然分子量不同，但在溃疡性结肠炎中表现相同[13]。由此可见，跨膜蛋白与胞浆蛋白共同维持肠道屏障的稳定，在溃疡性结肠炎患者中常表现为多种蛋白表达量同时发生变化。
2 中药活性成分对UC紧密连接的干预
2.1 生物碱类 小檗碱（BBR）又称黄连素，是中药黄连、黄柏等清热解毒药物中主要的活性成分，因其具有抗炎、降脂和保护心、肝、肾等多种器官的作用[14]，受到学者的关注。除外其对中枢神经系统、心血管系统的保护作用，BBR与炎症性肠病的作用机制也得到广泛研究[15]。李恒等[16]研究结果表明，BBR可以上调肠黏膜中紧密连接蛋白的表达，恢复肠上皮屏障功能，同时BBR还能抑制肠神经胶质细胞分泌炎性递质、阻断黏附分子及趋化因子对炎性细胞招募而降低炎性细胞浸润。结果表明，BBR通过多种途径干预溃疡性结肠炎的发展，有效缓解溃疡性结肠炎。
小檗红碱（BB）是BBR的主要活性代谢产物之一，有研究表明[17]在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中，BB（20 mg/kg）在降低疾病活动评分（DAI）、延長结肠长度和增加体重方面所产生的治疗效果与BBR（50 mg/kg）和阳性对照柳氮磺吡啶（200 mg/kg）相当。BB可明显改善DSS诱导的结肠病理改变并降低组织学评分。此外，BB通过减轻炎性细胞浸润并抑制髓过氧化物酶（MPO）和细胞因子（TNF-α，IFN-γ，IL-1β，IL-6，IL-4和IL-10）产生，从而减轻了结肠炎症。同时，BB可以显著上调小鼠紧密连接蛋白（ZO-1，ZO-2，Occludin）的表达和黏蛋白（MUC-1和MUC-2）的mRNA表达。可见BB在改善DSS诱导的UC具有与BBR和阳性对照相似的作用，且剂量低、机理相似。所观察到的保护作用可能与BB在维持肠黏膜屏障的完整性和减轻肠炎症有关。
2.2 黄酮类 柑橘药用资源（陈皮、青皮、枳实、枳壳等）中存在多种黄酮类化合物，Wei 等[18]基于柑橘中三种黄酮类化合物：柚皮苷、橙皮素和川陈皮素，分析其对三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的溃疡性结肠炎大鼠保护作用，结果表明三种成分均能明显改善体重减轻和结肠短缩情况，降低DAI，并且显著上调Claudin-2蛋白、Occludin蛋白和ZO-1蛋白的表达;同时，利用脂多糖诱导Caco-2和RAW264.7细胞共培养体系检测对肠上皮细胞损伤的保护作用，研究显示三种黄酮类化合物均能增加跨上皮电阻，降低肠黏膜通透性，上调Occludin和ZO-1的表达。可以看出，柚皮苷、橙皮素和川陈皮素可能通过保护结肠黏膜层完整性而发挥对UC的调节作用。 马齿苋是临床中针对溃疡性结肠炎患者大肠湿热证的常用中药，具有清热利湿、解毒消肿等作用，其主要化学成分是脂肪酸及其他有机酸、黄酮类、生物碱类化合物。山奈酚是马齿苋的主要活性成分之一，Yifei等[19]研究发现，在肠上皮细胞和肠微血管内皮细胞共培养模型中，山奈酚可以抑制由脂多糖导致的上皮紧密连接蛋白丢失，恢复肠道屏障功能，并且他们认为山奈酚是通过 NF-κB 信号通路来抑制肠上皮炎症和紧密连接蛋白功能失常，由此可见，马齿苋在体内发挥作用可能由山奈酚这一活性成分的存在。
山姜素（Alpinetin）也是黄酮类化合物，分子式为C16H14O4，主要存在于姜科植物姜黄、豆蔻、郁金中，具有抗炎作用。Yue等[20]应用8-10周龄 C57BL/6小鼠进行研究，发现在UC模型中，山姜素可以改善黏膜糜烂，炎性浸润和隐窝丢失情况，并且能够显著上调Occludin和ZO-1的表达，并降低Claudin-2的表达水平，且治疗效果与剂量增加有关。结果表明山姜素通过调节紧密蛋白的功能维持肠上皮屏障的完整性和通透性，降低DAI，改善小鼠的结肠缩短和体重减轻情况。
2.3 其他 广藿香是芳香化湿类中药，具有化湿和中作用，广泛用于湿着中阻等证。广藿香醇（PA）是其提取物，具有抗炎、预防结肠炎等多种药理作用[21]。Wu等[13]研究发现PA能够调节紧密连接蛋白的表达，在TNBS和DSS所诱导的结肠炎模型中，均能显著上调Claudin-1、Occludin、ZO-2的蛋白表达水平，改善组织学损伤。同样，在Chang等[22]的研究中也得出了同样的结论。除了广藿香醇外，广藿香油也是广藿香的常见提取物。广藿香油在Gan等[23]研究中被证实能够显著增加ZO-1和Occludin mRNA的表达，稳定肠上皮屏障，改善黏膜损伤。可见，广藿香的不同提取物对肠道炎症均有良好的改善作用。
此外，还有学者应用两种活性成分治疗UC。黄芪多糖是中药黄芪的主要活性成分，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化等多种作用。苦参碱属吡啶类生物碱中双稠哌啶类，可从苦参、山豆根等中药材中提取，两者活性成分药理作用均有报导[24-25]。Xin等[26]认为在既往研究中，黄芪多糖、苦参碱对溃疡性结肠炎大鼠有治疗作用，但二者联合治疗未见报道，因此在其实验中除黄芪多糖治疗组和苦参碱治疗组外，新增两者联合治疗组，蛋白免疫印迹结果显示，与模型组和阳性对照组相比，三组均能提高ZO-1蛋白在肠黏膜中表达，以联合治疗组在第四周时效果最明显;通过免疫组织化学分析，模型组结肠组织Occludin蛋白表达在第二周和第四周较正常组显著降低，其他治疗组结肠组织Occludin蛋白表达均高于模型组，尤以第四周时黄芪多糖治疗组和单体混合物组明显，表明黄芪多糖、苦参碱联合使用能有效提高肠道ZO-1、Occludin的表达，对溃疡性结肠炎的治疗思路提供了新的方向。
3 中药复方对UC紧密连接的干预
3.1 参苓白术散 参苓白术散是《太平惠民和剂局方》中用于治疗脾虚湿盛泄泻或是肺虚喘咳证的方剂，在现代已广泛应用于多种内科病症，如功能性消化不良、腹泻、溃疡性结肠炎等[27]。在临床随机对照试验中[28]，在使用柳氮磺吡啶的基础上加用参苓白术散作为实验组，临床综合疗效显著高于单用药物;与单用柳氮磺吡啶相比，实验组在中医证候、病理学积分及内镜活动指数评分等方面均具有统计学意义。除临床报道外，针对参苓白术散治疗溃疡性结肠炎的潜在分子机制，也有大量的基础研究。在刘翠英等[29]的研究中，高剂量参苓白术散组与模型组相比显著增加了肠道Occludin蛋白的表达，减轻肠道炎症，并且调节了MLCK/MLC 通路蛋白表达，对DSS诱导的结肠损伤具有良好的恢复作用。此外，参苓白术散还被证实有下调血清炎症因子IL-1β、IL-4，结肠NLR受体家族NLRP3、NLRP6蛋白等作用[30]。
3.2 甘草泻心汤 甘草泻心汤出自《伤寒论》，原书治疗伤寒中风误下所导致的心下痞证和，在临床中常用来治疗消化系统疾病。在陈浩等[31]的动物实验中，采用TNBS/乙醇造模方法诱导溃疡性结肠炎模型，分别用美沙拉嗪和高、中、低剂量甘草泻心汤灌胃治疗14 d，结果表明与空白组相比，造模后的各组大鼠结肠Claudin-1的蛋白和mRNA 水平显著下降，但与模型组相比，美沙拉嗪和各剂量甘草泻心汤治疗组Claudin-1蛋白和mRNA表达水平增高，其中以中剂量组效果最为明显，说明甘草泻心汤可能通过改善肠道Claudin-1水平恢复肠道屏障功能。除了甘草泻心汤对溃疡性结肠炎的肠道屏障有恢复作用外，半夏泻心汤也被证实有类似的作用。在徐凤等[32]的研究中，半夏泻心汤也能显著提高因为炎症本身造成的ZO-1和Occludin蛋白的下降，使肠黏膜通透性趋向正常，降低疾病活动评分。
3.3 白头翁汤和芍药汤 白头翁汤和芍药汤都为治痢之方，白头翁汤主治热毒痢疾，芍药汤主治湿热痢疾，二者在临床中针对不同证型的患者均有良好的疗效。缪志伟[33]通过meta分析得出白頭翁汤与美沙拉嗪合用与单用美沙拉嗪相比，有更好的总体疗效和肠镜下黏膜改变。通过进一步实验，证实白头翁汤通过抑制促炎因子表达、增加抑炎因子水平来调节免疫反应，并且其还能增加肠道Occludin和ZO-1蛋白的表达，减轻肠道通透性，修复肠道物理屏障。陈大光等[34]发现芍药汤也具有保护肠道屏障的功能，他们通过透射电镜观察到应用了芍药汤的大鼠肠道紧密连接破坏较模型组轻，大鼠的一般情况、疾病活动评分也有更好的表现。
3.4 经验方 除经方外，现代学者根据自己多年临床经验总结了一系列经验方。清肠温中汤[35]是李军祥教授治疗溃疡性结肠炎患者的常用方剂，由黄连、炮姜、地榆炭、青黛、木香、三七、炙甘草组成，具有化瘀止血、平调寒热功效，临床效果显著。毛堂友等[36-37]在基础研究中发现，清肠温中汤除了可以降低炎症因子的表达，还可以显著上调大鼠结肠Claudin-1、Claudin-4的mRNA 和蛋白表达水平，保护肠黏膜屏障，同时，清肠温中汤还可以使结肠Occludin和ZO-1蛋白表达升高，抑制Claudin-2蛋白的表达，改善肠道紧密连接蛋白的功能。沈洪[38]教授使用清肠化湿方（黄连，黄芩，白头翁，煨木香，炒当归，炒白芍，生地榆，白蔹，炮姜和炙甘草）在临床治疗湿热内蕴证患者疗效显著，对于中度溃疡性结肠炎患者，中西医结合治疗在降低粪钙卫蛋白、降低疾病活动度优于单用美沙拉嗪缓释颗粒。傅书山等[39]探索其潜在的作用机制，发现在湿热证小鼠模型中，清肠化湿方能降低DAI评分，降低血清炎症因子表达，降低结肠Claudin-2蛋白和mRNA水平，缓解结肠黏膜损伤。 4 小结
UC作为炎症性肠病的常见类型，发病率总体呈上升趋势[40]，肠上皮屏障受损这一发病机制受到学者的广泛关注。有研究认为紧密连接屏障受损是溃疡性结肠炎的始动发病机制，在屏障功能正常时，尽管持续激活肌球蛋白轻链激酶（MLCK）模拟炎症因子刺激状态，但并不能引起炎症[41]。也有研究证实在炎症性肠病缓解期，存在上皮细胞过度脱落和损失的患者比上皮细胞完整的患者更易复发[42]。并且谭悦等[43]在研究中发现Occludin和 ZO-1蛋白的表达与Mayo临床评分（MCS）、Mayo内镜评分（MCSe）、Geboes指数呈负相关，这证明紧密连接蛋白有可能成为评价UC患者肠道炎症和预测黏膜愈合程度的指标。
本文总结了近3年中药活性成分和中药复方对紧密连接的作用，可以看出对UC紧密连接有良好治疗作用的中药活性成分多为生物碱、黄酮类，中药复方多具有健脾、祛湿、清热、理气等作用，与UC的基本病因病机（脾胃虚弱为本，湿热内蕴，气血失调为因）一致。根据整理的基础研究和临床研究文献，发现中药活性成分和中药复方可以通过多靶点起效，不仅能够改善肠上皮屏障，还能抑制炎症因子的表达从而减轻肠道炎症反应，对改善UC有确切疗效。中医药作为我国的传统医学，蕴含着巨大的研究价值，值得我们进一步研究其潜在的分子机制治疗各种难治性疾病。
参考文献：
[1]ABRAHAM C，CHO J H.Inflammatory bowel disease[J].N Engl J Med，2009，361（21）：2066-2078.
[2]ORDAS I，ECKMANN L，TALAMINI M，et al.Ulcerative colitis[J].Lancet，2012，380（9853）：1606-1619.
[3]DANESE S，FIOCCHI C.Etiopathogenesis of inflammatory bowel diseases[J].World J Gastroenterol，2006，12（30）：4807-4812.
[4]CITI S.Intestinal barriers protect against disease[J].Science，2018，359（6380）：1097-1098.
[5]BEN-HORIN S，KOPYLOV U，CHOWERS Y.Optimizing anti-TNF treatments in inflammatory bowel disease[J].Autoimmun Rev，2014，13（1）：24-30.
[6]ROSTHOLDER E，AHMED A，CHEIFETZ A S，et al.Outcomes after escalation of infliximab therapy in ambulatory patients with moderately active ulcerative colitis[J].Aliment Pharmacol Ther，2012，35（5）：562-567.
[7]楊黄欢，叶玲娜，曹倩.硫唑嘌呤治疗炎症性肠病患者的不良反应分析[J].中华炎性肠病杂志，2017（2）：92-95.
[8]KRUG S M，SCHULZKE J D，FROMM M.Tight junction，selective permeability，and related diseases[J].Semin Cell Dev Biol，2014，36：166-176.
[9]POPE J L，BHAT A A，SHARMA A，et al.Claudin-1 regulates intestinal epithelial homeostasis through the modulation of Notch-signalling[J].Gut，2014，63（4）：622-634.
[10]RANDALL K，HENDERSON N，REENS J，et al.Claudin-2 Expression Levels in Ulcerative Colitis：Development and Validation of an In-Situ Hybridisation Assay for Therapeutic Studies[J].PLoS One，2016，11（9）：e0162076.
[11]OSHIMA T，MIWA H，JOH T.Changes in the expression of claudins in active ulcerative colitis[J].J Gastroenterol Hepatol，2008，23 Suppl 2：S146-150.
[12]TAN Y，GUAN Y，SUN Y，et al.Correlation of Intestinal Mucosal Healing and Tight Junction Protein Expression in Ulcerative Colitis Patients[J].Am J Med Sci，2019，357（3）：195-204.
[13]WU Z，ZENG H，ZHANG L，et al.Patchouli Alcohol：a Natural Sesquiterpene Against Both Inflammation and Intestinal Barrier Damage of Ulcerative Colitis[J].Inflammation，2020，43（4）：1423-1435.
[14]于浩，杜建玲.小檗碱的药理作用及机制的研究现状[J].中国现代应用药学，2020，37（4）：501-507. [15]唐煌尧，杨亭，赵华，等.小檗碱对炎症性肠病肠道屏障的影响及其信号通路[J].动物营养学报，2020，32（2）：523-529.
[16]李恒，左建平，唐炜.小檗碱通过调控溃疡性结肠炎肠道神经免疫炎症保护黏膜屏障损伤[J].中国药理学与毒理学杂志，2019，33（9）：673.
[17]YU X T，XU Y F，HUANG Y F，et al.Berberrubine attenuates mucosal lesions and inflammation in dextran sodium sulfate-induced colitis in mice[J].PLoS One，2018，13（3）：e0194069.
[18]HE W，LIU M，LI Y，et al.Flavonoids from Citrus aurantium ameliorate TNBS-induced ulcerative colitis through protecting colonic mucus layer integrity[J].Eur J Pharmacol，2019，857：172456.
[19]BIAN Y，DONG Y，SUN J，et al.Protective Effect of Kaempferol on LPS-Induced Inflammation and Barrier Dysfunction in a Coculture Model of Intestinal Epithelial Cells and Intestinal Microvascular Endothelial Cells[J].J Agric Food Chem，2020，68（1）：160-167.
[20]TAN Y，ZHENG C.Effects of Alpinetin on Intestinal Barrier Function，Inflammation and Oxidative Stress in Dextran Sulfate Sodium-Induced Ulcerative Colitis Mice[J].Am J Med Sci，2018，355（4）：377-386.
[21]張伟，张娟娟，郭庆丰，等.广藿香醇药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2020，26（3）：213-221.
[22]QU C，YUAN Z W，YU X T，et al.Patchouli alcohol ameliorates dextran sodium sulfate-induced experimental colitis and suppresses tryptophan catabolism[J].Pharmacol Res，2017，121：70-82.
[23]GAN Y，AI G，WU J，et al.Patchouli oil ameliorates 5-fluorouracil-induced intestinal mucositis in rats via protecting intestinal barrier and regulating water transport[J].J Ethnopharmacol，2020，250：112519.
[24]吴甜甜，刘雪珂，刘妙华，等.苦参素的免疫药理作用途径研究进展[J].中药药理与临床，2020，36（1）：234-238.
[25]马秀，刘少静，张婉莹，等.黄芪多糖的分离纯化及药理作用研究进展[J].化学工程师，2019，33（8）：50-53.
[26]YAN X，LU Q G，ZENG L，et al.Synergistic protection of astragalus polysaccharides and matrine against ulcerative colitis and associated lung injury in rats[J].World J Gastroenterol，2020，26（1）：55-69.
[27]宋惠凤，金火星.参苓白术散的现代临床应用概述[J].中成药，2013，35（2）：379-383.
[28]陈天杰，张明红.参苓白术散治疗慢性复发型溃疡性结肠炎的疗效及基于β2AR/β-arrestin2/NF-κB信号转导通路的作用机制[J].中药材，2020，41（9）：999-1002.
[29]刘翠英，施家希，黄娟，等.参苓白术散对溃疡性结肠炎小鼠紧密连接及MLCK/MLC通路的影响[J].中药材，2018，41（9）：2180-2184.
[30]张嘉骏，施家希，黄娟，等.参苓白术散对溃疡性结肠炎小鼠NLPR3，NLPR6蛋白及相关炎症因子表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2019，25（4）：36-41.
[31]陈浩，张波，徐速，等.甘草泻心汤联合美沙拉嗪对溃疡性结肠炎的疗效及对血清炎症指标的影响[J].中药材，2017，40（2）：475-478.
[32]徐凤，毛艺纯，周淑芬，等.半夏泻心汤对溃疡性结肠炎小鼠肠道黏膜屏障功能保护作用及ZO-1和Occludin表达的影响[J].中国中医基础医学杂志，2019，25（1）：44-47+51.
[33]缪志伟.白头翁汤治疗溃疡性结肠炎的机制探讨以及新加白头翁汤的临床疗效评价[D].南京：南京中医药大学，2020.
[34]陈大光，曹晖，李令，等.芍药汤对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织机械屏障及细胞因子的影响[J].安徽中医药大学学报，2019，38（4）：67-71. [35]姜慧，李军祥，谭祥，等.李军祥教授治疗溃疡性结肠炎经验[J].中国中西医结合消化杂志，2019，27（3）：232-235.
[36]MAO T，LI J，LIU L，et al.Qingchang Wenzhong Decoction Attenuates DSS-Induced Colitis in Rats by Reducing Inflammation and Improving Intestinal Barrier Function via Upregulating the MSP/RON Signalling Pathway[J].Evid Based Complement Alternat Med，2017，2017：4846876.
[37]毛堂友，裴文靜，史瑞，等.清肠温中方促进DSS诱导溃疡性结肠炎大鼠结肠claudin-l、claudin-4表达修复肠黏膜屏障的机制研究[J].世界科学技术-中医药现代化，2018，20（7）：1232-1237.
[38]赵崧，王晓骁，张露，等.清肠化湿方联合美沙拉嗪对溃疡性结肠炎患者粪便钙卫蛋白的影响[J].河北医学，2018，24（3）：445-448.
[39]傅书山，朱磊，王琼，等.清肠化湿方对溃疡性结肠炎湿热证小鼠NLRP6蛋白及相关炎症因子表达的影响[J].中国中西医结合杂志，2020，40（5）：582-588.
[40]ZENG Z，ZHU Z，YANG Y，et al.Incidence and clinical characteristics of inflammatory bowel disease in a developed region of Guangdong Province，China：a prospective population-based study[J].J Gastroenterol Hepatol，2013，28（7）：1148-1153.
[41]SU L，SHEN L，CLAYBURGH D R，et al.Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis[J].Gastroenterology，2009，136（2）：551-563.
[42]KIESSLICH R，DUCKWORTH C A，MOUSSATA D，et al.Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease[J].Gut，2012，61（8）：1146-1153.
[43]谭悦，郑长清.紧密连接蛋白occludin、ZO-1在溃疡性结肠炎中的表达及其临床意义[J].现代药物与临床，2018，33（7）：1803-1808.