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摘 要 以甜瓜（Cucumis melo）品种‘新银辉’为材料，采取根灌法，以水杨酸（10 μmol/L）处理甜瓜幼苗，通过Real-Time PCR对叶片中部分自毒作用相关基因的表达量进行定量分析，以探究外源水杨酸诱导对甜瓜自毒作用的影响。结果显示，经外源水杨酸诱导后：（1）在催化苯丙烷类代谢途径的3个初始反应的蛋白酶编码基因中，PAL和C4H随处理后时间增加，呈逐渐上调趋势，但PAL比C4H更快响应胁迫，而4CL转录水平没有显著变化；（2）在类黄酮生物合成的3个关键酶的基因中，CHI、F3H均显示出不同程度的下调，CHS于处理后1 d略微上调，然后恢复至处理前水平；（3）两个转录因子基因WD40、R2R3-MYB分别在不同处理时间后显著下调；（4）WD40与CHI的表达相关性较高。据上述结果，水杨酸诱导后：（Ⅰ）CHI表达可能与转录因子WD40蛋白相关；（Ⅱ）WD40、R2R3-MYB与PAL、C4H、4CL、CHS间不存在简单、明确的调控关系；（Ⅲ）柚皮苷、表儿茶素、芦丁等甜瓜主要化感物质合成减少。
关键词 甜瓜；自毒作用；水杨酸；苯丙烷类代谢途径
中图分类号 S652；Q78 文献标识码 A
Abstract Aiming at investigating the effect of exogenous salicylic acid on the autotoxicity of muskmelon， the cultivar Xinyinhui was selected as the research object， and the seedlings were root-drenched with 10 μmol/L salicylic acid（SA）， and then the relative expression of melon-autotoxicity-related genes was quantitatively analyzed through Real-Time PCR. Results indicated that under the induction of exogenous SA，（1）Among the genes encoding enzymes which catalyzing the three initial steps of phenylpropanoid pathway， both PAL and C4H were up-regulated gradually during the treatment time， and PAL had a faster response to the SA stress than C4H， while 4CL had no significant differences at the level of transcription；（2）Among the genes of enzymes involved in flavonoid biosynthesis， down-regulation were observed both in CHI and F3H， while the expression level of CHI returned to untreated level after slight up-regulation appeared at 1 d；（3）The two transcription factors WD40 and R2R3-MYB were down-regulated significantly；（4）there were high revelance of expression of WD40 to CHI. According to the results aforementioned， it was likely that after induced by SA，（Ⅰ）The expression of CHI might be related to the WD40 protein；（Ⅱ）There were no simple and clear regulation relationship between the two transcription factors and PAL， C4H， 4CL， CHS；（Ⅲ）fewer allelochemicals of muskmelon， such as naringin， epicatechin， rutin， were synthesized.
Key words Cucumis melo； autotoxicity； salicylic acid； phenylpropanoid pathway
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.05.017
植物化感作用（Allelopathy），指一種植物（供体）通过向周围环境释放化学物质从而对另一种植物或微生物（受体）产生的直接、间接，或正面、负面影响[1]。自毒作用（Autotoxicity）是化感作用的一种特殊类型：植物对同种植物的抑制性化感作用[2]。自毒现象在多种植物中均有出现，被认为是农作物生产中连作障碍的主要因素之一[2-3]。
近年来由于设施农业的发展，甜瓜（C. melo L.）是生产上受连作障碍影响严重的农作物之一[4]，对甜瓜自毒作用的研究成为解决问题的突破点。化感物质（Allelochemical）通常是次生代谢物[5]，可存在于各种组织中，通过淋溶、挥发、落叶降解、根系分泌等方式释放至外界环境中[6]，主要包括酚酸类、类黄酮两大类[6]。
苯丙烷类代谢途径（phenylpropanoid pathway）是植物类黄酮生物合成的必要途径[7]，化感作用被认为与其密切相关[8]。类黄酮合成前的苯丙烷类代谢途径反应包括三步：苯丙氨酸氨裂解酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）控制着苯丙烷类代谢的起始：苯丙氨酸形成反式肉桂酸；随后被肉桂酸4-羟化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）催化生成p-香豆酸；再由4-香豆酰辅酶A连接酶（4-Coumarate：CoA ligase，4CL）催化形成4-香豆酰辅酶A。4-香豆酰辅酶A形成后，与3分子丙二酰辅酶A在查尔酮合成酶（Chalcone Synthase，CHS）的作用下形成查尔酮。从查尔酮开始，进入类黄酮合成。在查尔酮异构酶（Chalcone Isomerase，CHI）的催化下，查尔酮转化为柚皮素（naringenin），最终黄烷酮3-羟化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）催化柚皮素形成纷繁的下游产物[9]。 水杨酸（salicylic acid，SA），即邻羟基苯甲酸，是近几十年来引起广泛关注的植物激素，涉及多种植物生理过程，还可诱导植物多种逆境抗性的产生[10]。水杨酸也参与植物化感作用，是涉及甜瓜自毒作用的主要酚酸類化感物质之一[4， 11]。但水杨酸同甜瓜化感自毒作用之间的作用关系尚不明确。
目前相关研究多关注甜瓜自毒作用对生理生化层面的变化和影响[4， 12]，涉及分子生物学层面的研究较少，其机理尚不明确。本研究通过对水杨酸处理后的甜瓜苯丙烷类代谢途径相关基因的表达情况进行分析，拟探究外源水杨酸诱导对甜瓜自毒作用相关基因表达的影响，为甜瓜自毒作用的相关研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验甜瓜品种‘新银辉’种子购自福州农嘉种子科技有限公司。
试剂：RNA提取试剂盒Minibest Plant RNA Extraction Kit、反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、荧光定量PCR试剂SYBRR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）购自大连宝生物工程有限公司，水杨酸购自北京索莱宝科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 甜瓜幼苗的培养 将甜瓜种子置于铺有2层无菌滤纸的培养皿中，加入无菌UP水2 mL，再盖1层无菌滤纸，于恒温培养箱中25 ℃避光浸种至露白；播种于填有基质（草炭∶蛭石∶珍珠岩=3∶1∶1，体积比）花盆内，保持基质湿润。
1.2.2 水杨酸处理和取样 配制10 μmol/L的水杨酸，待幼苗长至2叶1心时，采用灌根法处理植株，每株20 mL；设置0、1、2、3和4 d处理时间梯度，采用时间倒序取样；取幼苗第2叶位真叶，液氮冷冻后保存于-80 ℃冷藏箱中。对照组：0 d处理组为第1天以无菌UP水20 mL处理。
1.2.3 总RNA的提取和质量检测 利用TaKaRaR Minibest Plant RNA Extraction Kit提取甜瓜叶片总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测；Quawell Q5000紫外分光光度计检测RNA质量。
1.2.4 cDNA合成与Real-Time PCR 利用TaKaRaR PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）合成cDNA。利用BioRad CFX96 Real-Time PCR Detection System和TaKaRaR SYBRR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）对样品进行Real-Time PCR。目的基因Real-Time PCR引物参比序列来自本实验室前期研究甜瓜基因表达谱测序结果，以NCBI中甜瓜actin-7（Gene ID： 103485254）作为内参基因引物参比序列，所有引物合成自华大基因科技服务有限公司（表1）；反应程序采用三步法，设40个循环，3次技术重复：（1）初始变性：95.0 ℃ 30 s；（2）变性，退火，延伸：95.0 ℃ 5 s，60.0 ℃（注：CHI为55 ℃） 30 s，72 ℃ 30 s，读板，返回，直至40个循环结束；（3）绘制熔解曲线。
1.3 数据处理和相对表达量计算
利用CFX Manager软件采集实验数据，并计算目的基因相对表达量，计算方法同2-ΔΔCT法[13]。以0 d对照组记为1，对所有样品间各个基因相对表达量进行归一化处理，得到均一化相对表达量（Relative Normalized Expression），并对结果数据进行显著性差异分析，采用t检验法。
2 结果与分析
苯丙烷类代谢途径简化图如图1。
苯丙烷类代谢途径初始反应中3个酶基因中，PAL基因在水杨酸处理后，基因表达量持续增加，且呈上调趋势，并于处理后3 d显著上调（2.52倍，P<0.01），随后4 d仍保持较高上调水平（至2.16倍，0.01 在类黄酮生物合成的3个关键酶的基因中，水杨酸处理后1 d的CHS基因呈现略微上调（至1.33倍，P<0.05），随后同对照组转录水平差异消失。CHI在处理后的表达变化显著：1 d即呈极显著下调（至0.32倍，P<0.01），并随后持续保持低表达水平基本不变。F3H基因表达量在处理时间内总体呈下调，且随处理后时间间隔增加而呈现明显下降趋势，并于处理后3 d达到最低值（0.39倍），呈显著下调（P<0.01）后，4 d开始出现缓慢恢复的趋势（0.55倍）（图3）。
两个转录因子基因WD40、R2R3-MYB随处理时间增加而下调。R2R3-MYB在2 d开始显著下调（至0.70倍，p<0.01），于3 d降至最低（0.44倍，p<0.01）后，4 d回升（至0.81倍）；WD40转录下调更为明显：1 d大幅降至0.26倍，且下调极为显著（p<0.01），并随后持续保持低表达水平基本不变（图4）。
同时结合转录因子和相关酶基因的差异表达进行分析：水杨酸处理后的WD40与CHI，表达均受到显著抑制，呈现出对水杨酸处理的高度敏感性，二者表达间存在高度相关性；F3H与R2R3-MYB转录水平随处理时间增加而逐渐降低，均于3 d降至最低，但F3H在处理后1 d即显著下调，而R2R3-MYB则在2 d才表现出显著差异表达水平。而WD40、R2R3-MYB下调的同时，PAL、C4H、4CL、CHS却不同程度上调或未出现差异表达，可知2种转录因子和该4种结构基因间的表达没有明显的相关性。 3 讨论
在早期研究中已发现，水杨酸在植物对生物胁迫响应的信号转导途径中的具有关键性作用[16]。水杨酸可诱导植物的系统获得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）[17-18]，即通过诱导苯丙烷类代谢途径基因等植物防御相关基因的表达，提高植物对病原体的抵抗力[19]。有研究认为化感是一种可主动诱导的防御机制，水杨酸信号通路可激活化感物质的释放[20]。水杨酸还可通过抑制过氧化氢酶和过氧化物酶的活性来调节植物细胞的活性氧类（reactive oxygen species，ROS）水平[21]。而活性氧类水平过高形成对受体植物的氧化胁迫，引起氧化损伤和细胞凋亡[22]。不仅如此，化感物质合成也通过苯丙烷类代谢途径实现[23]。这些研究表明水杨酸可以多种不同的方式影响甜瓜化感自毒作用。因此水杨酸与苯丙烷类代谢途径的作用关系可能是探究水杨酸如何参与甜瓜自毒作用的关键点。
目前已知水杨酸是PAL众多诱导因素之一[24]，诱导后PAL、C4H转录和相应酶活增强，可能增强酚酸类化感物质的合成和释放[25-26]。CHS酶活性的缺失对黄瓜抵抗白粉病有明显的负面影响[27]。在植物中CHS通常是组成型表达基因，但表达有组织特异性，可受多種因素诱导调节[28]。而且大多数被子植物的CHS由多基因家族编码[28]。综合而言，CHS表达的调控是复杂的多因素共同影响的结果。类黄酮生物合成受R2R3-MYB、bHLH和WD40三大转录因子家族的在不同组合和互作关系下的共同调节[29]。对玉米的研究显示，CHS和CHI的转录需要R2R3-MYB类转录因子Y1的参与[30]。在大豆中，Y1对查尔酮合成酶启动子chs也有调控作用[31]。拟南芥中MYB12可显著激活CHS、F3H基因的启动子，增强相应基因的转录水平，但对CHI基因的调节作用则较弱[32]。在不同植物中F3H可与不同基因协同表达，如拟南芥幼苗中的F3H与CHS、CHI协同表达[33]。
在本实验中，外源水杨酸对甜瓜PAL、C4H基因表达具有促进的诱导效应，可能使酚酸类合成增加，但对主要化感物质类黄酮的合成没有显著促进作用[34]。本研究中，SA处理对CHS仅有促进短暂上调作用，可能由于多因素共同影响CHS调控[28]。WD40、R2R3-MYB下调可能与水杨酸诱导的转录后基因沉默相关[35]，该WD40蛋白的存在对于甜瓜CHI的表达可能密切相关。而F3H是类黄酮合成的枢纽，影响众多类黄酮衍生物的合成，F3H可能受多个转录因子调控[36]。本研究结果显示，由于外源水杨酸诱导后CHI、F3H表达受抑制，CHI、F3H的合成减少，进而可能使包括柚皮苷、表儿茶素、芦丁等甜瓜主要化感物质在内的各种类黄酮产物合成减少[11]。
综上所述，甜瓜幼苗经外源水杨酸诱导后的叶片中，PAL、C4H上调；CHI、F3H、WD40、R2R3-MYB下调；而4CL转录水平没有显著变化；CHS于1 d略微上调后恢复至处理前水平。在下调基因中，WD40与CHI的表达均受到显著抑制，相关性较高；而F3H与MYB转录水平随处理时间增加而逐渐降低，但二者的表达趋势并不完全一致。两个转录因子的下调与PAL、C4H、4CL、CHS表达没有明显的相关性。由此推测，水杨酸诱导后：（1）转录因子WD40蛋白与CHI的表达可能密切相关；（2）WD40、R2R3-MYB与PAL、C4H、4CL、CHS间不存在简单、明确的调控关系；（3）CHI、F3H的表达受抑制，可能导致柚皮苷、表儿茶素、芦丁等甜瓜主要化感物质合成减少。
参考文献
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关键词 甜瓜；自毒作用；水杨酸；苯丙烷类代谢途径
中图分类号 S652；Q78 文献标识码 A
Abstract Aiming at investigating the effect of exogenous salicylic acid on the autotoxicity of muskmelon， the cultivar Xinyinhui was selected as the research object， and the seedlings were root-drenched with 10 μmol/L salicylic acid（SA）， and then the relative expression of melon-autotoxicity-related genes was quantitatively analyzed through Real-Time PCR. Results indicated that under the induction of exogenous SA，（1）Among the genes encoding enzymes which catalyzing the three initial steps of phenylpropanoid pathway， both PAL and C4H were up-regulated gradually during the treatment time， and PAL had a faster response to the SA stress than C4H， while 4CL had no significant differences at the level of transcription；（2）Among the genes of enzymes involved in flavonoid biosynthesis， down-regulation were observed both in CHI and F3H， while the expression level of CHI returned to untreated level after slight up-regulation appeared at 1 d；（3）The two transcription factors WD40 and R2R3-MYB were down-regulated significantly；（4）there were high revelance of expression of WD40 to CHI. According to the results aforementioned， it was likely that after induced by SA，（Ⅰ）The expression of CHI might be related to the WD40 protein；（Ⅱ）There were no simple and clear regulation relationship between the two transcription factors and PAL， C4H， 4CL， CHS；（Ⅲ）fewer allelochemicals of muskmelon， such as naringin， epicatechin， rutin， were synthesized.
Key words Cucumis melo； autotoxicity； salicylic acid； phenylpropanoid pathway
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.05.017
植物化感作用（Allelopathy），指一種植物（供体）通过向周围环境释放化学物质从而对另一种植物或微生物（受体）产生的直接、间接，或正面、负面影响[1]。自毒作用（Autotoxicity）是化感作用的一种特殊类型：植物对同种植物的抑制性化感作用[2]。自毒现象在多种植物中均有出现，被认为是农作物生产中连作障碍的主要因素之一[2-3]。
近年来由于设施农业的发展，甜瓜（C. melo L.）是生产上受连作障碍影响严重的农作物之一[4]，对甜瓜自毒作用的研究成为解决问题的突破点。化感物质（Allelochemical）通常是次生代谢物[5]，可存在于各种组织中，通过淋溶、挥发、落叶降解、根系分泌等方式释放至外界环境中[6]，主要包括酚酸类、类黄酮两大类[6]。
苯丙烷类代谢途径（phenylpropanoid pathway）是植物类黄酮生物合成的必要途径[7]，化感作用被认为与其密切相关[8]。类黄酮合成前的苯丙烷类代谢途径反应包括三步：苯丙氨酸氨裂解酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）控制着苯丙烷类代谢的起始：苯丙氨酸形成反式肉桂酸；随后被肉桂酸4-羟化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）催化生成p-香豆酸；再由4-香豆酰辅酶A连接酶（4-Coumarate：CoA ligase，4CL）催化形成4-香豆酰辅酶A。4-香豆酰辅酶A形成后，与3分子丙二酰辅酶A在查尔酮合成酶（Chalcone Synthase，CHS）的作用下形成查尔酮。从查尔酮开始，进入类黄酮合成。在查尔酮异构酶（Chalcone Isomerase，CHI）的催化下，查尔酮转化为柚皮素（naringenin），最终黄烷酮3-羟化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）催化柚皮素形成纷繁的下游产物[9]。 水杨酸（salicylic acid，SA），即邻羟基苯甲酸，是近几十年来引起广泛关注的植物激素，涉及多种植物生理过程，还可诱导植物多种逆境抗性的产生[10]。水杨酸也参与植物化感作用，是涉及甜瓜自毒作用的主要酚酸類化感物质之一[4， 11]。但水杨酸同甜瓜化感自毒作用之间的作用关系尚不明确。
目前相关研究多关注甜瓜自毒作用对生理生化层面的变化和影响[4， 12]，涉及分子生物学层面的研究较少，其机理尚不明确。本研究通过对水杨酸处理后的甜瓜苯丙烷类代谢途径相关基因的表达情况进行分析，拟探究外源水杨酸诱导对甜瓜自毒作用相关基因表达的影响，为甜瓜自毒作用的相关研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验甜瓜品种‘新银辉’种子购自福州农嘉种子科技有限公司。
试剂：RNA提取试剂盒Minibest Plant RNA Extraction Kit、反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、荧光定量PCR试剂SYBRR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）购自大连宝生物工程有限公司，水杨酸购自北京索莱宝科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 甜瓜幼苗的培养 将甜瓜种子置于铺有2层无菌滤纸的培养皿中，加入无菌UP水2 mL，再盖1层无菌滤纸，于恒温培养箱中25 ℃避光浸种至露白；播种于填有基质（草炭∶蛭石∶珍珠岩=3∶1∶1，体积比）花盆内，保持基质湿润。
1.2.2 水杨酸处理和取样 配制10 μmol/L的水杨酸，待幼苗长至2叶1心时，采用灌根法处理植株，每株20 mL；设置0、1、2、3和4 d处理时间梯度，采用时间倒序取样；取幼苗第2叶位真叶，液氮冷冻后保存于-80 ℃冷藏箱中。对照组：0 d处理组为第1天以无菌UP水20 mL处理。
1.2.3 总RNA的提取和质量检测 利用TaKaRaR Minibest Plant RNA Extraction Kit提取甜瓜叶片总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测；Quawell Q5000紫外分光光度计检测RNA质量。
1.2.4 cDNA合成与Real-Time PCR 利用TaKaRaR PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）合成cDNA。利用BioRad CFX96 Real-Time PCR Detection System和TaKaRaR SYBRR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）对样品进行Real-Time PCR。目的基因Real-Time PCR引物参比序列来自本实验室前期研究甜瓜基因表达谱测序结果，以NCBI中甜瓜actin-7（Gene ID： 103485254）作为内参基因引物参比序列，所有引物合成自华大基因科技服务有限公司（表1）；反应程序采用三步法，设40个循环，3次技术重复：（1）初始变性：95.0 ℃ 30 s；（2）变性，退火，延伸：95.0 ℃ 5 s，60.0 ℃（注：CHI为55 ℃） 30 s，72 ℃ 30 s，读板，返回，直至40个循环结束；（3）绘制熔解曲线。
1.3 数据处理和相对表达量计算
利用CFX Manager软件采集实验数据，并计算目的基因相对表达量，计算方法同2-ΔΔCT法[13]。以0 d对照组记为1，对所有样品间各个基因相对表达量进行归一化处理，得到均一化相对表达量（Relative Normalized Expression），并对结果数据进行显著性差异分析，采用t检验法。
2 结果与分析
苯丙烷类代谢途径简化图如图1。
苯丙烷类代谢途径初始反应中3个酶基因中，PAL基因在水杨酸处理后，基因表达量持续增加，且呈上调趋势，并于处理后3 d显著上调（2.52倍，P<0.01），随后4 d仍保持较高上调水平（至2.16倍，0.01
两个转录因子基因WD40、R2R3-MYB随处理时间增加而下调。R2R3-MYB在2 d开始显著下调（至0.70倍，p<0.01），于3 d降至最低（0.44倍，p<0.01）后，4 d回升（至0.81倍）；WD40转录下调更为明显：1 d大幅降至0.26倍，且下调极为显著（p<0.01），并随后持续保持低表达水平基本不变（图4）。
同时结合转录因子和相关酶基因的差异表达进行分析：水杨酸处理后的WD40与CHI，表达均受到显著抑制，呈现出对水杨酸处理的高度敏感性，二者表达间存在高度相关性；F3H与R2R3-MYB转录水平随处理时间增加而逐渐降低，均于3 d降至最低，但F3H在处理后1 d即显著下调，而R2R3-MYB则在2 d才表现出显著差异表达水平。而WD40、R2R3-MYB下调的同时，PAL、C4H、4CL、CHS却不同程度上调或未出现差异表达，可知2种转录因子和该4种结构基因间的表达没有明显的相关性。 3 讨论
在早期研究中已发现，水杨酸在植物对生物胁迫响应的信号转导途径中的具有关键性作用[16]。水杨酸可诱导植物的系统获得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）[17-18]，即通过诱导苯丙烷类代谢途径基因等植物防御相关基因的表达，提高植物对病原体的抵抗力[19]。有研究认为化感是一种可主动诱导的防御机制，水杨酸信号通路可激活化感物质的释放[20]。水杨酸还可通过抑制过氧化氢酶和过氧化物酶的活性来调节植物细胞的活性氧类（reactive oxygen species，ROS）水平[21]。而活性氧类水平过高形成对受体植物的氧化胁迫，引起氧化损伤和细胞凋亡[22]。不仅如此，化感物质合成也通过苯丙烷类代谢途径实现[23]。这些研究表明水杨酸可以多种不同的方式影响甜瓜化感自毒作用。因此水杨酸与苯丙烷类代谢途径的作用关系可能是探究水杨酸如何参与甜瓜自毒作用的关键点。
目前已知水杨酸是PAL众多诱导因素之一[24]，诱导后PAL、C4H转录和相应酶活增强，可能增强酚酸类化感物质的合成和释放[25-26]。CHS酶活性的缺失对黄瓜抵抗白粉病有明显的负面影响[27]。在植物中CHS通常是组成型表达基因，但表达有组织特异性，可受多種因素诱导调节[28]。而且大多数被子植物的CHS由多基因家族编码[28]。综合而言，CHS表达的调控是复杂的多因素共同影响的结果。类黄酮生物合成受R2R3-MYB、bHLH和WD40三大转录因子家族的在不同组合和互作关系下的共同调节[29]。对玉米的研究显示，CHS和CHI的转录需要R2R3-MYB类转录因子Y1的参与[30]。在大豆中，Y1对查尔酮合成酶启动子chs也有调控作用[31]。拟南芥中MYB12可显著激活CHS、F3H基因的启动子，增强相应基因的转录水平，但对CHI基因的调节作用则较弱[32]。在不同植物中F3H可与不同基因协同表达，如拟南芥幼苗中的F3H与CHS、CHI协同表达[33]。
在本实验中，外源水杨酸对甜瓜PAL、C4H基因表达具有促进的诱导效应，可能使酚酸类合成增加，但对主要化感物质类黄酮的合成没有显著促进作用[34]。本研究中，SA处理对CHS仅有促进短暂上调作用，可能由于多因素共同影响CHS调控[28]。WD40、R2R3-MYB下调可能与水杨酸诱导的转录后基因沉默相关[35]，该WD40蛋白的存在对于甜瓜CHI的表达可能密切相关。而F3H是类黄酮合成的枢纽，影响众多类黄酮衍生物的合成，F3H可能受多个转录因子调控[36]。本研究结果显示，由于外源水杨酸诱导后CHI、F3H表达受抑制，CHI、F3H的合成减少，进而可能使包括柚皮苷、表儿茶素、芦丁等甜瓜主要化感物质在内的各种类黄酮产物合成减少[11]。
综上所述，甜瓜幼苗经外源水杨酸诱导后的叶片中，PAL、C4H上调；CHI、F3H、WD40、R2R3-MYB下调；而4CL转录水平没有显著变化；CHS于1 d略微上调后恢复至处理前水平。在下调基因中，WD40与CHI的表达均受到显著抑制，相关性较高；而F3H与MYB转录水平随处理时间增加而逐渐降低，但二者的表达趋势并不完全一致。两个转录因子的下调与PAL、C4H、4CL、CHS表达没有明显的相关性。由此推测，水杨酸诱导后：（1）转录因子WD40蛋白与CHI的表达可能密切相关；（2）WD40、R2R3-MYB与PAL、C4H、4CL、CHS间不存在简单、明确的调控关系；（3）CHI、F3H的表达受抑制，可能导致柚皮苷、表儿茶素、芦丁等甜瓜主要化感物质合成减少。
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