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采用多种化学计量学方法优化并建立细脚拟青霉RCEF4339最优原生质体制备工艺。首先,采用单因素优化策略筛选得到细脚拟青霉原生质体制备的最适酶为溶壁酶、其浓度为2 mg/mL、酶解温度32℃、酶解时间3 h、pH 7.0、渗透压稳定剂0.9 mol/L KCl。其次,应用Plackett-Burman设计试验筛选得到影响原生质体生成量的关键因素（酶解时间、pH值和酶解温度）。最后,通过Box-Behnken设计试验对3个关键因素进一步优化。建立多元二次回归模型拟合Box-Behnken设计试验结果,并采用