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摘要：为研究1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，简称DNJ）对家蚕中肠BmSuc1基因表达及其酶活性的影响，以5龄第3天家蚕为试验材料，经口添食不同剂量的生物碱DNJ，采用实时荧光定量PCR方法检测中肠BmSuc1的表达情况，同时测定β-呋喃果糖苷酶的活性。结果表明，添食不同剂量的DNJ均能引起BmSuc1基因在添食6、9 h出现上调表达，但相对表达量有一定差异，添食4 μg/头的处理组在添食6、9 h基因的相对表达量分别是对照组的1.9、2.9倍，添食2 μg/头的处理组在添食6、9 h基因的相对表达量分别仅为对照组的1.5、1.8倍。另外，添食4 μg/头的处理组β-呋喃果糖苷酶活性在添食6、9、12 h显著高于对照组，而添食2 μg/头的处理组酶活性仅在添食6、9 h显著高于对照组。由结果可知，酶活性变化与基因的转录表达规律基本一致。
关键词：家蚕；DNJ；BmSuc1；β-呋喃果糖苷酶；实时荧光定量PCR
中图分类号： S881.2；Q786 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）11-0290-03
1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，简称DNJ）属于哌啶类多羟基生物碱，它能够抑制α-葡萄糖苷酶，具有一定的降血糖功能[1]。研究发现，多种植物、微生物中均有DNJ及其类似物存在[2-3]，其中桑树中生物碱DNJ的含量远高于其他植物[4-5]。
蔗糖是包括昆虫在内的动物非常喜好的主要糖营养来源，分解蔗糖的水解酶有2种：一种是催化葡萄糖侧基的α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase），另一种是催化果糖侧基的β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase）[6]。DNJ能够抑制α-葡萄糖苷酶活性，而对β-呋喃果糖苷酶没有抑制作用。DNJ能够通过抑制昆虫肠道α-葡萄糖苷酶活性，阻止其分解和吸收蔗糖营养，使其不能正常生长发育，甚至死亡[7]。已有研究表明，生物碱DNJ对非食桑昆虫卷心菜蛾、蓖麻蚕具有强烈的毒害作用[8-9]。
Daimon等率先在家蚕基因组中发现了β-呋喃果糖苷酶同源基因BmSuc1，其编码的中肠蛋白酶具有蔗糖水解酶功能，且活性不受DNJ的抑制[10]。桑树的叶片、枝条和根茎等部位富含DNJ[11]，寡食性昆虫家蚕一生以桑叶为食物来源[12-13]，它能够克服生物碱毒性，正常吸收桑叶中的糖营养，主要依赖β-呋喃果糖苷酶充分分解吸收桑叶中的蔗糖营养，从而成功地避开桑叶生物碱DNJ对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用[10]。
本研究通过添食外源DNJ，利用实时荧光定量PCR对家蚕中肠BmSuc1基因的表达进行定量检测和分析，同时测定β-呋喃果糖苷酶的变化规律，探讨外源DNJ对BmSuc1基因表达及其酶活性的影响，为深入研究家蚕回避桑叶生物碱DNJ毒害作用的适应机制提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1 材料与主要试剂
供试家蚕品种为菁松×皓月，来自云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所。主要试剂：MiniBEST Universal RNA Extraction Kit和M-MLV反转录试剂盒（TOYOBO公司），FastStart Universal SYBR Green Master（Roche公司），生物碱DNJ（Sigma公司），蛋白定量测试盒和蔗糖水解酶测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），其他试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 添食处理及样品采集 选取发育良好、体质量和大小相当的家蚕5龄第3天幼虫，采用经口喂食的方法进行生物碱DNJ添食，其中A组喂食剂量为2 μg/头，B组喂食剂量为4 μg/头，以添食灭菌水的家蚕为对照，添食后在同等条件下飼喂。
取添食后3、6、9、12、24 h家蚕的中肠组织，对照组同时取材，每次取样均分成2份，1份用于抽提RNA，另外1份用于制备酶液，每次取样均设3次重复，每个重复取5头蚕，样品收集后置于-80 ℃保存备用。
1.2.2 总RNA的提取及反转录 按照MiniBEST Universal RNA Extraction Kit操作说明提取中肠组织RNA。在核酸蛋白分析仪上测定D260 nm、D280 nm、D260 nm/D280 nm值，计算RNA样品浓度，根据M-MLV反转录酶使用说明书将抽提的RNA反转录成cDNA。另外取D260 nm/D280 nm值在1.80～2.00之间的样品，用于实时荧光定量PCR试验。
1.2.3 实时荧光定量PCR检测 利用Primer Premier 5.0软件，按照Real-Time PCR要求对选取的家蚕内参基因Actin3及目标基因BmSuc1进行引物设计。Actin3引物序列为F：5′-CGGGAAATCGTTCGTGAT-3′，R：5′-ACGAGGGTTGGAAGAGGG-3′；BmSuc1引物序列为F：5′-AATCCAGTCCTCTCCTACGTGC-3′，R：5′-TCCGGTCTGATACGTGTTCT-TG-3′。
荧光定量PCR方法参照FastStart Universal SYBR Green Master试剂盒操作说明进行。反应体系20 μL，反应参数：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。用ABI公司StepOne荧光定量PCR扩增仪记录试验结果，每个样品设3次重复。根据公式2-ΔΔCT计算基因的相对表达量[14]，其中ΔΔCT=（CTBmSuc1-CTActin3）处理-（CTBmSuc1-CTActin3）对照。式中：CTBmSuc1、CTActin3分别代表靶标基因BmSuc1、内参基因Actin3在实时荧光定量PCR反应过程中扩增的CT值。 1.2.4 β-呋喃果糖苷酶活性测定 酶液的制备：取家蚕中肠样品，加入4 ℃预冷的1.0 mL磷酸钾缓冲液（0.1 mol/L，pH值7.0），在冰上匀浆，4 ℃、8 000 r/min离心5～8 min，收集上清。
蛋白质含量测定按照蛋白定量试剂盒操作进行。测定原理是蛋白质分子具有—NH3 基团，当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准液或样品中时，考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白—NH3 结合，使溶液变为蓝色，通过测定595 nm处吸光度可计算出蛋白含量。计算公式：待测样品蛋白浓度（g/L）=[（D595 nm试验-D595 nm对照）/（D595 nm标准-D595 nm空白）]×标准品浓度（0.563 g/L）。每个样品重复3次，取其平均值，下同。
酶活测定原理是β-呋喃果糖苷酶能水解相应的底物产生单糖，该单糖在相应氧化酶的作用下产生过氧化氢，过氧化氢同显色剂结合产生红色络合物，用分光光度计在505 nm处测定吸光度，根据以下公式计算酶性：酶活性（U/mg）=[（D505 nm试验-D505 nm对照）/（D505 nm标准-D505 nm空白）]×标准品浓度（5.55 mmol/L）÷反应时间（20 min）÷待测样品蛋白浓度×1 000。具体操作参照蔗糖水解酶活性测定试剂盒说明书。酶活力定义：在37 ℃、pH值为7.0的条件下，1 mg蛋白组织1 min内水解1 nmoL蔗糖定义为1个酶活力单位。
2 结果与分析
2.1 添食DNJ对家蚕中肠BmSuc1基因表达的影响
利用实时荧光定量PCR的方法，对添食不同剂量生物碱DNJ后家蚕中肠BmSuc1基因的表达进行定量检测和分析。试验中采取的是相对定量计算方法，将对照组BmSuc1基因的相对表达量设定为1.0，当添食组BmSuc1基因的相对表达量大于1.0时即为上调表达，若小于1.0时即为下调表达。从图1可以看出，添食不同剂量（2、4 μg/头）的生物碱DNJ均能引起家蚕中肠BmSuc1表达量在6、9 h出现明显上调趋势，其中处理6 h相对表达量最高，而处理3、12、24 h基因相对表达量变化不明显，均接近对照组BmSuc1基因的相对表达量1.0。
对比A、B 2个处理组可知，添食剂量越高基因表达量上调幅度越大，其中添食量4 μg/头的B组，BmSuc1相对表达量在6、9 h分别是对照组的1.84、2.97倍，而添食量2 μg/头的A组，在6、9 h BmSuc1的相对表达量分别是对照组的1.58、2.19 倍（图1）。
2.2 添食DNJ对家蚕中肠β-呋喃果糖苷酶活性的影响
添食不同剂量生物碱DNJ后，由图2可见，不同剂量生物碱DNJ处理家蚕，均能引起β-呋喃果糖苷酶活性出现先增强后减弱的趋势。添食量4 μg/头的处理组（B组），在6、9、12 h时酶活性与对照组相比，差异均达到显著水平，其中在处理6 h时，酶活性最高。而添食量2 μg/头的处理组（A组），在处理9 h时酶活性最高，并且仅在6、9 h时酶活性与对照组的差异达到显著水平。
由图2还可以看出，添食量4 μg/头的处理组（B组），酶活性上升速度较快，而下降速度较慢，在处理6 h就达到最高值，随后在9、12 h继续维持一个相对较高的水平，在24 h酶活性仍高于对照组，但差异未达到显著水平。添食量 2 μg/头的处理组（A组）酶活性上升速度较慢，而下降速度较快，在添食9 h酶活性升至最高值，随后急剧降低，在12 h已低于对照组，虽然在24 h的酶活性高于对照组，但差异并不显著。
3 讨论与结论
桑叶的乳液中含有大量的DNJ、1，4-二脱氧-1，4-亚氨基-D-阿拉伯糖醇（简称D-AB1）等糖类似物生物碱[11]，其中DNJ是一种强效的α-葡萄糖苷酶抑制剂，而动物体内的蔗糖消化吸收主要依賴于α-葡萄糖苷酶的水解作用[15]。研究表明，添食DNJ能导致一些昆虫丧失吸收和利用蔗糖的能力，从而对其产生一定的毒害作用[8-9]。β-呋喃果糖苷酶属于另一类蔗糖水解酶，广泛存在于真菌、细菌、酵母菌和植物中[6]，它也能催化蔗糖水解产生葡萄糖、果糖，并且其活性不受DNJ抑制[11]。家蚕BmSuc1是第1个被分子克隆和功能鉴定的动物β-呋喃果糖苷酶基因[10]。
家蚕主要依赖β-呋喃果糖苷酶充分分解吸收桑叶中的蔗糖营养，所以桑叶中高浓度的DNJ对家蚕没有毒害作用，也不影响家蚕的生长发育[10]。另外家蚕自身具有一定富集DNJ的能力，其富集部位主要集中在血淋巴、消化管和体壁[16-18]。但蚕体DNJ的富集、代谢机制目前还不明确，笔者推测DNJ进入蚕体后，一部分被蚕体吸收利用，另一部分随自身代谢产物排出体外。
家蚕无论是富集吸收DNJ，还是代谢利用DNJ，均需要能量。BmSuc1编码的β-呋喃果糖苷酶主要是水解家蚕体内的蔗糖，为机体提供糖源和能量，因此添食外源DNJ后，BmSuc1基因在一定时间范围内被上调表达，同时β-呋喃果糖苷酶活性显著高于对照组。随着时间的推移，进入蚕体的DNJ逐渐被富集及代谢利用，其含量也相应减少，机体不需要消耗过多能量去应对，BmSuc1基因表达量及β-呋喃果糖苷酶活性恢复至接近对照组水平，维持机体正常的生命活动。
本研究表明，生物碱DNJ能诱导家蚕BmSuc1基因的表达，同时增强β-呋喃果糖苷酶的活性，并且基因的表达规律与酶活性变化趋势一致。本试验中2种添食处理组，基因上调表达的时间点是一致的，都是在添食后6、9 h，但表达量却有所差异，添食DNJ的剂量越大，基因表达量越高。β-呋喃果糖苷酶活性也是在添食6、9 h显著高于对照组；另外，添食量4 μg/头的处理组（B组），12 h的酶活性也显著高于对照组，这表明DNJ剂量越大，对酶活性的影响时间越长。DNJ对家蚕中肠BmSuc1基因表达及其酶活性的影响是否与DNJ剂量有一定的相关性，有待进一步研究。 参考文献：
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[2]Asano N，Nishida M，Miyauchi M，et al. Polyhydroxylated pyrrolidine andpiperidine alkaloids from Adenophora triphylla var.japonica（Campanulaceae）[J]. Phytochemistry，2000，53（3）：379-382.
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关键词：家蚕；DNJ；BmSuc1；β-呋喃果糖苷酶；实时荧光定量PCR
中图分类号： S881.2；Q786 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）11-0290-03
1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，简称DNJ）属于哌啶类多羟基生物碱，它能够抑制α-葡萄糖苷酶，具有一定的降血糖功能[1]。研究发现，多种植物、微生物中均有DNJ及其类似物存在[2-3]，其中桑树中生物碱DNJ的含量远高于其他植物[4-5]。
蔗糖是包括昆虫在内的动物非常喜好的主要糖营养来源，分解蔗糖的水解酶有2种：一种是催化葡萄糖侧基的α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase），另一种是催化果糖侧基的β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase）[6]。DNJ能够抑制α-葡萄糖苷酶活性，而对β-呋喃果糖苷酶没有抑制作用。DNJ能够通过抑制昆虫肠道α-葡萄糖苷酶活性，阻止其分解和吸收蔗糖营养，使其不能正常生长发育，甚至死亡[7]。已有研究表明，生物碱DNJ对非食桑昆虫卷心菜蛾、蓖麻蚕具有强烈的毒害作用[8-9]。
Daimon等率先在家蚕基因组中发现了β-呋喃果糖苷酶同源基因BmSuc1，其编码的中肠蛋白酶具有蔗糖水解酶功能，且活性不受DNJ的抑制[10]。桑树的叶片、枝条和根茎等部位富含DNJ[11]，寡食性昆虫家蚕一生以桑叶为食物来源[12-13]，它能够克服生物碱毒性，正常吸收桑叶中的糖营养，主要依赖β-呋喃果糖苷酶充分分解吸收桑叶中的蔗糖营养，从而成功地避开桑叶生物碱DNJ对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用[10]。
本研究通过添食外源DNJ，利用实时荧光定量PCR对家蚕中肠BmSuc1基因的表达进行定量检测和分析，同时测定β-呋喃果糖苷酶的变化规律，探讨外源DNJ对BmSuc1基因表达及其酶活性的影响，为深入研究家蚕回避桑叶生物碱DNJ毒害作用的适应机制提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1 材料与主要试剂
供试家蚕品种为菁松×皓月，来自云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所。主要试剂：MiniBEST Universal RNA Extraction Kit和M-MLV反转录试剂盒（TOYOBO公司），FastStart Universal SYBR Green Master（Roche公司），生物碱DNJ（Sigma公司），蛋白定量测试盒和蔗糖水解酶测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），其他试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 添食处理及样品采集 选取发育良好、体质量和大小相当的家蚕5龄第3天幼虫，采用经口喂食的方法进行生物碱DNJ添食，其中A组喂食剂量为2 μg/头，B组喂食剂量为4 μg/头，以添食灭菌水的家蚕为对照，添食后在同等条件下飼喂。
取添食后3、6、9、12、24 h家蚕的中肠组织，对照组同时取材，每次取样均分成2份，1份用于抽提RNA，另外1份用于制备酶液，每次取样均设3次重复，每个重复取5头蚕，样品收集后置于-80 ℃保存备用。
1.2.2 总RNA的提取及反转录 按照MiniBEST Universal RNA Extraction Kit操作说明提取中肠组织RNA。在核酸蛋白分析仪上测定D260 nm、D280 nm、D260 nm/D280 nm值，计算RNA样品浓度，根据M-MLV反转录酶使用说明书将抽提的RNA反转录成cDNA。另外取D260 nm/D280 nm值在1.80～2.00之间的样品，用于实时荧光定量PCR试验。
1.2.3 实时荧光定量PCR检测 利用Primer Premier 5.0软件，按照Real-Time PCR要求对选取的家蚕内参基因Actin3及目标基因BmSuc1进行引物设计。Actin3引物序列为F：5′-CGGGAAATCGTTCGTGAT-3′，R：5′-ACGAGGGTTGGAAGAGGG-3′；BmSuc1引物序列为F：5′-AATCCAGTCCTCTCCTACGTGC-3′，R：5′-TCCGGTCTGATACGTGTTCT-TG-3′。
荧光定量PCR方法参照FastStart Universal SYBR Green Master试剂盒操作说明进行。反应体系20 μL，反应参数：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。用ABI公司StepOne荧光定量PCR扩增仪记录试验结果，每个样品设3次重复。根据公式2-ΔΔCT计算基因的相对表达量[14]，其中ΔΔCT=（CTBmSuc1-CTActin3）处理-（CTBmSuc1-CTActin3）对照。式中：CTBmSuc1、CTActin3分别代表靶标基因BmSuc1、内参基因Actin3在实时荧光定量PCR反应过程中扩增的CT值。 1.2.4 β-呋喃果糖苷酶活性测定 酶液的制备：取家蚕中肠样品，加入4 ℃预冷的1.0 mL磷酸钾缓冲液（0.1 mol/L，pH值7.0），在冰上匀浆，4 ℃、8 000 r/min离心5～8 min，收集上清。
蛋白质含量测定按照蛋白定量试剂盒操作进行。测定原理是蛋白质分子具有—NH3 基团，当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准液或样品中时，考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白—NH3 结合，使溶液变为蓝色，通过测定595 nm处吸光度可计算出蛋白含量。计算公式：待测样品蛋白浓度（g/L）=[（D595 nm试验-D595 nm对照）/（D595 nm标准-D595 nm空白）]×标准品浓度（0.563 g/L）。每个样品重复3次，取其平均值，下同。
酶活测定原理是β-呋喃果糖苷酶能水解相应的底物产生单糖，该单糖在相应氧化酶的作用下产生过氧化氢，过氧化氢同显色剂结合产生红色络合物，用分光光度计在505 nm处测定吸光度，根据以下公式计算酶性：酶活性（U/mg）=[（D505 nm试验-D505 nm对照）/（D505 nm标准-D505 nm空白）]×标准品浓度（5.55 mmol/L）÷反应时间（20 min）÷待测样品蛋白浓度×1 000。具体操作参照蔗糖水解酶活性测定试剂盒说明书。酶活力定义：在37 ℃、pH值为7.0的条件下，1 mg蛋白组织1 min内水解1 nmoL蔗糖定义为1个酶活力单位。
2 结果与分析
2.1 添食DNJ对家蚕中肠BmSuc1基因表达的影响
利用实时荧光定量PCR的方法，对添食不同剂量生物碱DNJ后家蚕中肠BmSuc1基因的表达进行定量检测和分析。试验中采取的是相对定量计算方法，将对照组BmSuc1基因的相对表达量设定为1.0，当添食组BmSuc1基因的相对表达量大于1.0时即为上调表达，若小于1.0时即为下调表达。从图1可以看出，添食不同剂量（2、4 μg/头）的生物碱DNJ均能引起家蚕中肠BmSuc1表达量在6、9 h出现明显上调趋势，其中处理6 h相对表达量最高，而处理3、12、24 h基因相对表达量变化不明显，均接近对照组BmSuc1基因的相对表达量1.0。
对比A、B 2个处理组可知，添食剂量越高基因表达量上调幅度越大，其中添食量4 μg/头的B组，BmSuc1相对表达量在6、9 h分别是对照组的1.84、2.97倍，而添食量2 μg/头的A组，在6、9 h BmSuc1的相对表达量分别是对照组的1.58、2.19 倍（图1）。
2.2 添食DNJ对家蚕中肠β-呋喃果糖苷酶活性的影响
添食不同剂量生物碱DNJ后，由图2可见，不同剂量生物碱DNJ处理家蚕，均能引起β-呋喃果糖苷酶活性出现先增强后减弱的趋势。添食量4 μg/头的处理组（B组），在6、9、12 h时酶活性与对照组相比，差异均达到显著水平，其中在处理6 h时，酶活性最高。而添食量2 μg/头的处理组（A组），在处理9 h时酶活性最高，并且仅在6、9 h时酶活性与对照组的差异达到显著水平。
由图2还可以看出，添食量4 μg/头的处理组（B组），酶活性上升速度较快，而下降速度较慢，在处理6 h就达到最高值，随后在9、12 h继续维持一个相对较高的水平，在24 h酶活性仍高于对照组，但差异未达到显著水平。添食量 2 μg/头的处理组（A组）酶活性上升速度较慢，而下降速度较快，在添食9 h酶活性升至最高值，随后急剧降低，在12 h已低于对照组，虽然在24 h的酶活性高于对照组，但差异并不显著。
3 讨论与结论
桑叶的乳液中含有大量的DNJ、1，4-二脱氧-1，4-亚氨基-D-阿拉伯糖醇（简称D-AB1）等糖类似物生物碱[11]，其中DNJ是一种强效的α-葡萄糖苷酶抑制剂，而动物体内的蔗糖消化吸收主要依賴于α-葡萄糖苷酶的水解作用[15]。研究表明，添食DNJ能导致一些昆虫丧失吸收和利用蔗糖的能力，从而对其产生一定的毒害作用[8-9]。β-呋喃果糖苷酶属于另一类蔗糖水解酶，广泛存在于真菌、细菌、酵母菌和植物中[6]，它也能催化蔗糖水解产生葡萄糖、果糖，并且其活性不受DNJ抑制[11]。家蚕BmSuc1是第1个被分子克隆和功能鉴定的动物β-呋喃果糖苷酶基因[10]。
家蚕主要依赖β-呋喃果糖苷酶充分分解吸收桑叶中的蔗糖营养，所以桑叶中高浓度的DNJ对家蚕没有毒害作用，也不影响家蚕的生长发育[10]。另外家蚕自身具有一定富集DNJ的能力，其富集部位主要集中在血淋巴、消化管和体壁[16-18]。但蚕体DNJ的富集、代谢机制目前还不明确，笔者推测DNJ进入蚕体后，一部分被蚕体吸收利用，另一部分随自身代谢产物排出体外。
家蚕无论是富集吸收DNJ，还是代谢利用DNJ，均需要能量。BmSuc1编码的β-呋喃果糖苷酶主要是水解家蚕体内的蔗糖，为机体提供糖源和能量，因此添食外源DNJ后，BmSuc1基因在一定时间范围内被上调表达，同时β-呋喃果糖苷酶活性显著高于对照组。随着时间的推移，进入蚕体的DNJ逐渐被富集及代谢利用，其含量也相应减少，机体不需要消耗过多能量去应对，BmSuc1基因表达量及β-呋喃果糖苷酶活性恢复至接近对照组水平，维持机体正常的生命活动。
本研究表明，生物碱DNJ能诱导家蚕BmSuc1基因的表达，同时增强β-呋喃果糖苷酶的活性，并且基因的表达规律与酶活性变化趋势一致。本试验中2种添食处理组，基因上调表达的时间点是一致的，都是在添食后6、9 h，但表达量却有所差异，添食DNJ的剂量越大，基因表达量越高。β-呋喃果糖苷酶活性也是在添食6、9 h显著高于对照组；另外，添食量4 μg/头的处理组（B组），12 h的酶活性也显著高于对照组，这表明DNJ剂量越大，对酶活性的影响时间越长。DNJ对家蚕中肠BmSuc1基因表达及其酶活性的影响是否与DNJ剂量有一定的相关性，有待进一步研究。 参考文献：
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