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摘要 [目的]对玉米南方锈病性状进行遗传分析，筛选南方锈病基因连锁的SSR引物标记，并进行初步定位。[方法]以抗南方锈病玉米自交系K381和感病自交系LX9801为材料，构建6个世代群体（P1、P2、F1、F2、B1CF1、B2CF1），对玉米南方锈病进行遗传分析，利用SSR标记对南方锈病连锁基因进行引物筛选，并利用筛选的分子标记对辅助抗南方锈病材料进行前景选择。[结果] F2代分离群体抗病株与感病株比例符合3∶1分离比例，B2CF1 [（K381×LX9801）×LX9801]群体抗感株接近1∶1分离比例，推测其抗性基因为单一显性基因控制的，与10.02区域内的2对SSR引物phi059和umc2018紧密连锁，初步认为K381的抗南方锈病基因位于第10号染色体短臂上。[结论]引物phi059可以用于玉米抗南方锈病材料辅助选择。
关键词 玉米;南方锈病;SSR分子标记;基因定位
中图分类号 S503.53文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）35-0100-03
2015年玉米南方锈病在河南南阳、驻马店、周口、商丘等15个地（市）暴发流行，覆盖全省主要玉米种植区，全省共计发生188.55万hm2，占玉米种植面积的56.1%[1]。在流行年份，南方锈病能造成玉米大幅减产，严重时超过45%[2-3]。暴发流行时，除造成品质下降外，减产可达80%以上，甚至绝收[4]。南方锈病是一种暴发性、毁灭性病害，防治非常困难，最有效的方法是選择抗病品种。由于该病害并非常年发生，因此常规育种过程中，在缺乏病害选择的情况下，很容易造成抗病基因的丢失。这是目前生产上应用的玉米自交系大多数感染南方玉米锈病的主要原因之一，目前生产上大部分品种不抗南方锈病。分子标记技术的应用不受环境、时间、地点和病害发生与否的影响。该技术对目标基因的转移可在早代进行准确、稳定地选择，从而加速育种进程，提高育种效率。与常规育种相比，该技术可提高育种效率2～3倍。
目前在分子标记辅助玉米抗南方锈病育种方面也做了大量研究。2003年，陈翠霞等[5]以齐319×340的F2和BC1F1群体为材料，通过SSR-BSA分析，将齐319抗病基因RppQ定位在第10号染色体短臂上，与标记phi041和phi118连锁，遗传距离分别为2.45、3.33 cM。2009年，张斌[6]也利用齐319为供体亲本，以南方玉米锈病感病自交系L189、DH4866、502、5003、郑58、昌7-2、9801等为受体亲本，通过回交育种，利用phi041和phi118这2个标记辅助选择，得到了抗南方玉米锈病良好的BC4Fl代材料。李少博等[7]用引物phill8和P2辅助选择，对骨干自交系京24进行抗南方锈病改良。谭华等[8]通过研究发现，利用引物phi048对南方玉米锈病抗病材料进行早代选择是有效的，可淘汰大量感病家系，减轻田间工作量;利用分子标记辅助定向选择结合抗病接种鉴定，能有效改良温带种质的抗锈性。
该研究为了利用分子标记辅助玉米抗南方锈病育种，利用抗南方锈病玉米自交系K381和感病自交系LX9801构建6个世代群体，对玉米南方锈病基因的连锁标记进行进一步筛选。利用筛选的分子标记对辅助抗南方锈病材料进行前景选择，结合田间鉴定验证分子标记辅助选择玉米抗南方锈病基因的选择效果，以期为分子标记辅助玉米抗南方锈病育种工作提供参考。
1 材料与方法
1.1 分离群体的构建
田间试验于2016年冬在河南省新乡市农业科学院海南三亚南滨基地进行，室内分析在新乡市农业科学院实验室进行。
以抗南方锈病玉米自交系K381和感病自交系LX9801构建6个世代群体，30个P1（K381）、30个P2（LX9801）、30个F1（K381×LX9801）、386个F2群体、284个B2CF1 [（K381×LX9801）×LX9801]群体、198个B1CF1[（LX9801×K381）×K381]群体。
1.2 南方锈病接种方法
田间试验于2016年冬在河南省新乡市农业科学院海南三亚南滨基地进行，该地点为南方锈病高发区，在3～5片叶时人工接种1次，接种后3～5 d进行人工喷水，促使病原菌早发。
1.3 分子标记分析
采用2×CTAB法提取并纯化DNA。参照已经发表的玉米分子标记连锁图，根据文献报道抗南方锈病基因位于第10号染色体上，从Maize GDB（http：//www.maizegdb.org）上选取玉米第10号染色体连锁群上的50对标记，利用抗感池进行多态性筛选，对抗感池间有多态性的标记再进行分离群体的连锁分析。
PCR扩增反应在BIOER TC-96/G/H（b）型PCR仪上进行。反应总体积为20 μL，包括0.2 mmol/L dNTPs、0.25 μmol/L引物和20 ng模板DNA，加灭菌纯水补足体积。PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃40 s，60 ℃35 s，72 ℃45 s，30个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色过程在低速转动的水平摇床上进行，方法为①10%乙醇+0.5%冰醋酸固定10～15 min;②0.2%硝酸银渗透10～15 min;③用蒸馏水漂洗2次;④1.5%氢氧化钠+0.4%甲醛显色，直到显出清晰条带，终止显色。结果照相分析。
1.4 抗感池分析
在父母本各取15株高抗、高感的DNA等量混合，组成DNA分析的抗、感基因池（Bulk R，Bulk S）。
2 结果与分析 2.1 分离群体的表现型
抗病指数按玉米南方锈病抗性全国统一记载，标准病级划分见表1，6个世代群体抗性表现见表2，根据抗性表型鉴定结果发现P1（K381）、F1、B2CF1 [（LX9801×K381）×K381]群体均表现高抗;F1代正反交抗性无明显差异，说明该抗性性状受细胞质遗传影响小;F2分离群体386个，扣除临界抗性无法分清等级的12个，其抗感表现明显呈单峰偏态分布（图1），抗、感株比例为283∶91，经χ2检验抗感株比例符合3∶1，B1CF1[（K381×LX9801）×LX9801]群体284个，抗、感株比例（148∶129）接近1∶1，符合孟德尔单一显性基因分离规律，推测在该分离群体中南方锈病的抗性为单一显性基因控制。
2.2 分子标记连锁分析
选取均匀分布在玉米10号染色体短臂上的50对标记，通过抗感反应池进行多态性筛选（图2），其中有5对引物存在多态性差异。
利用抗感池间有差异的5对SSR标记对F2分离群体、B2CF1[（K381×LX9801）×LX9801]群体再进行分离群體的标记连锁检测，结果发现位于第10号染色体的2对SSR标记与抗病基因表现一定的连锁关系（图3、4），其中位于10.02区域内的1对SSR标记phi059与抗病基因紧密连锁，通过检测该标记在F2分离群体分子标记带型（K381型、LX9801型）接近3∶1的分离比例;B1CF1[（K381×LX9801）×LX9801]群体标记带型（K381型、LX9801型）接近1∶1的分离比例。
3 小结
该研究通过对抗性材料K381/LX9801构建的6个世代群体遗传分析，F2代分离群体抗病株与感株比例符合3∶1，B2CF1 [（K381×LX9801）×LX9801]分离群体抗感株比例接近1∶1，推测其抗性基因为单一显性基因控制的，利用F2代分离群体进行SSR分子标记连锁分析，初步认为材料K381的抗南方锈病基因与标记umc2018和phi059紧密连锁，其中phi059标记与刘章雄等[3]以玉米南方型锈病免疫自交系 P25为材料获得的研究结果一致。2个引物均位于第10号染色体的10.02区，所以初步推断材料K381的抗南方锈病基因位于第10号染色体短臂上，这与陈翠霞等[5]2003年研究结果一致。
参考文献
[1] 徐永伟，于思勤，王江蓉，等.2015年河南省玉米南方锈病暴发流行原因分析及防治对策探讨[J].中国农技推广，2016，32（8）：71-73.
[2] RAID R N，PENNYPACKER S P，STEVENSON R E.Characterization of Puccinia polysora epidemics in Pennsylvania and Maryland[J].Phytopathology，1988，78（5）：579-585.
[3] 刘章雄，王守才，戴景瑞，等.玉米P25自交系抗锈病基因的遗传分析及SSR分子标记定位[J].遗传学报，2003，30（8）：706-710.
[4] ZHANG Y，XU L，ZHANG D F，et al.Mapping of southern corn rustresistant genes in the W2D inbred line of maize（Zea may L.）[J].Mol Breeding，2010，25：433-439.
[5] 陈翠霞，邢全华，梁春阳，等.南方玉米锈病抗病基因的定位及不同遗传背景对基因标记的比较分析[J].遗传学报，2003，30（4）：341-344.
[6] 张斌.分子标记辅助选择玉米兼抗粗缩病和南方锈病的育种材料[D].泰安：山东农业大学，2012.
[7] 李少博，宋伟，王凤格，等.分子标记辅助玉米自交系京24抗南方锈病的改良[J].分子植物育种，2012，10（4）：440-445.
[8] 谭华，邹成林，郑德波，等.分子标记辅助选择抗南方玉米锈病材料[J].广东农业科学，2016，43（7）：6-10.
关键词 玉米;南方锈病;SSR分子标记;基因定位
中图分类号 S503.53文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）35-0100-03
2015年玉米南方锈病在河南南阳、驻马店、周口、商丘等15个地（市）暴发流行，覆盖全省主要玉米种植区，全省共计发生188.55万hm2，占玉米种植面积的56.1%[1]。在流行年份，南方锈病能造成玉米大幅减产，严重时超过45%[2-3]。暴发流行时，除造成品质下降外，减产可达80%以上，甚至绝收[4]。南方锈病是一种暴发性、毁灭性病害，防治非常困难，最有效的方法是選择抗病品种。由于该病害并非常年发生，因此常规育种过程中，在缺乏病害选择的情况下，很容易造成抗病基因的丢失。这是目前生产上应用的玉米自交系大多数感染南方玉米锈病的主要原因之一，目前生产上大部分品种不抗南方锈病。分子标记技术的应用不受环境、时间、地点和病害发生与否的影响。该技术对目标基因的转移可在早代进行准确、稳定地选择，从而加速育种进程，提高育种效率。与常规育种相比，该技术可提高育种效率2～3倍。
目前在分子标记辅助玉米抗南方锈病育种方面也做了大量研究。2003年，陈翠霞等[5]以齐319×340的F2和BC1F1群体为材料，通过SSR-BSA分析，将齐319抗病基因RppQ定位在第10号染色体短臂上，与标记phi041和phi118连锁，遗传距离分别为2.45、3.33 cM。2009年，张斌[6]也利用齐319为供体亲本，以南方玉米锈病感病自交系L189、DH4866、502、5003、郑58、昌7-2、9801等为受体亲本，通过回交育种，利用phi041和phi118这2个标记辅助选择，得到了抗南方玉米锈病良好的BC4Fl代材料。李少博等[7]用引物phill8和P2辅助选择，对骨干自交系京24进行抗南方锈病改良。谭华等[8]通过研究发现，利用引物phi048对南方玉米锈病抗病材料进行早代选择是有效的，可淘汰大量感病家系，减轻田间工作量;利用分子标记辅助定向选择结合抗病接种鉴定，能有效改良温带种质的抗锈性。
该研究为了利用分子标记辅助玉米抗南方锈病育种，利用抗南方锈病玉米自交系K381和感病自交系LX9801构建6个世代群体，对玉米南方锈病基因的连锁标记进行进一步筛选。利用筛选的分子标记对辅助抗南方锈病材料进行前景选择，结合田间鉴定验证分子标记辅助选择玉米抗南方锈病基因的选择效果，以期为分子标记辅助玉米抗南方锈病育种工作提供参考。
1 材料与方法
1.1 分离群体的构建
田间试验于2016年冬在河南省新乡市农业科学院海南三亚南滨基地进行，室内分析在新乡市农业科学院实验室进行。
以抗南方锈病玉米自交系K381和感病自交系LX9801构建6个世代群体，30个P1（K381）、30个P2（LX9801）、30个F1（K381×LX9801）、386个F2群体、284个B2CF1 [（K381×LX9801）×LX9801]群体、198个B1CF1[（LX9801×K381）×K381]群体。
1.2 南方锈病接种方法
田间试验于2016年冬在河南省新乡市农业科学院海南三亚南滨基地进行，该地点为南方锈病高发区，在3～5片叶时人工接种1次，接种后3～5 d进行人工喷水，促使病原菌早发。
1.3 分子标记分析
采用2×CTAB法提取并纯化DNA。参照已经发表的玉米分子标记连锁图，根据文献报道抗南方锈病基因位于第10号染色体上，从Maize GDB（http：//www.maizegdb.org）上选取玉米第10号染色体连锁群上的50对标记，利用抗感池进行多态性筛选，对抗感池间有多态性的标记再进行分离群体的连锁分析。
PCR扩增反应在BIOER TC-96/G/H（b）型PCR仪上进行。反应总体积为20 μL，包括0.2 mmol/L dNTPs、0.25 μmol/L引物和20 ng模板DNA，加灭菌纯水补足体积。PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃40 s，60 ℃35 s，72 ℃45 s，30个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色过程在低速转动的水平摇床上进行，方法为①10%乙醇+0.5%冰醋酸固定10～15 min;②0.2%硝酸银渗透10～15 min;③用蒸馏水漂洗2次;④1.5%氢氧化钠+0.4%甲醛显色，直到显出清晰条带，终止显色。结果照相分析。
1.4 抗感池分析
在父母本各取15株高抗、高感的DNA等量混合，组成DNA分析的抗、感基因池（Bulk R，Bulk S）。
2 结果与分析 2.1 分离群体的表现型
抗病指数按玉米南方锈病抗性全国统一记载，标准病级划分见表1，6个世代群体抗性表现见表2，根据抗性表型鉴定结果发现P1（K381）、F1、B2CF1 [（LX9801×K381）×K381]群体均表现高抗;F1代正反交抗性无明显差异，说明该抗性性状受细胞质遗传影响小;F2分离群体386个，扣除临界抗性无法分清等级的12个，其抗感表现明显呈单峰偏态分布（图1），抗、感株比例为283∶91，经χ2检验抗感株比例符合3∶1，B1CF1[（K381×LX9801）×LX9801]群体284个，抗、感株比例（148∶129）接近1∶1，符合孟德尔单一显性基因分离规律，推测在该分离群体中南方锈病的抗性为单一显性基因控制。
2.2 分子标记连锁分析
选取均匀分布在玉米10号染色体短臂上的50对标记，通过抗感反应池进行多态性筛选（图2），其中有5对引物存在多态性差异。
利用抗感池间有差异的5对SSR标记对F2分离群体、B2CF1[（K381×LX9801）×LX9801]群体再进行分离群體的标记连锁检测，结果发现位于第10号染色体的2对SSR标记与抗病基因表现一定的连锁关系（图3、4），其中位于10.02区域内的1对SSR标记phi059与抗病基因紧密连锁，通过检测该标记在F2分离群体分子标记带型（K381型、LX9801型）接近3∶1的分离比例;B1CF1[（K381×LX9801）×LX9801]群体标记带型（K381型、LX9801型）接近1∶1的分离比例。
3 小结
该研究通过对抗性材料K381/LX9801构建的6个世代群体遗传分析，F2代分离群体抗病株与感株比例符合3∶1，B2CF1 [（K381×LX9801）×LX9801]分离群体抗感株比例接近1∶1，推测其抗性基因为单一显性基因控制的，利用F2代分离群体进行SSR分子标记连锁分析，初步认为材料K381的抗南方锈病基因与标记umc2018和phi059紧密连锁，其中phi059标记与刘章雄等[3]以玉米南方型锈病免疫自交系 P25为材料获得的研究结果一致。2个引物均位于第10号染色体的10.02区，所以初步推断材料K381的抗南方锈病基因位于第10号染色体短臂上，这与陈翠霞等[5]2003年研究结果一致。
参考文献
[1] 徐永伟，于思勤，王江蓉，等.2015年河南省玉米南方锈病暴发流行原因分析及防治对策探讨[J].中国农技推广，2016，32（8）：71-73.
[2] RAID R N，PENNYPACKER S P，STEVENSON R E.Characterization of Puccinia polysora epidemics in Pennsylvania and Maryland[J].Phytopathology，1988，78（5）：579-585.
[3] 刘章雄，王守才，戴景瑞，等.玉米P25自交系抗锈病基因的遗传分析及SSR分子标记定位[J].遗传学报，2003，30（8）：706-710.
[4] ZHANG Y，XU L，ZHANG D F，et al.Mapping of southern corn rustresistant genes in the W2D inbred line of maize（Zea may L.）[J].Mol Breeding，2010，25：433-439.
[5] 陈翠霞，邢全华，梁春阳，等.南方玉米锈病抗病基因的定位及不同遗传背景对基因标记的比较分析[J].遗传学报，2003，30（4）：341-344.
[6] 张斌.分子标记辅助选择玉米兼抗粗缩病和南方锈病的育种材料[D].泰安：山东农业大学，2012.
[7] 李少博，宋伟，王凤格，等.分子标记辅助玉米自交系京24抗南方锈病的改良[J].分子植物育种，2012，10（4）：440-445.
[8] 谭华，邹成林，郑德波，等.分子标记辅助选择抗南方玉米锈病材料[J].广东农业科学，2016，43（7）：6-10.