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[摘要]目的：研究甲基化抑制剂地西他滨对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖、凋亡及侵袭的影响。方法：采用不同浓度的地西他滨对A375细胞进行干预，用MTT实验检测地西他滨对细胞增殖的影响，用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化，划痕愈合实验及Transwell小室实验观察细胞体外迁徙侵袭能力的改变。结果：与对照组相比，地西他滨组A375细胞的增殖活性受到明显抑制，凋亡比例显著增加，体外迁移和侵袭能力减弱，差异有统计学意义（P<0.05），地西他滨对A375细胞周期的影响则无显著差异（P>0.05）。结论：地西他滨能抑制恶性黑色素瘤A375细胞的增殖，其抗肿瘤效应有可能成为恶性黑色素瘤治疗的新途径。
[关键词]黑色素瘤；地西他滨；增殖；凋亡；侵袭
[中图分类号]R739.5 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2016）03-0039-05
皮肤恶性黑色素瘤起源于黑色素细胞，恶性程度高，易发生远处转移，预后较差。早期恶性黑色素瘤以外科治疗为主，但有1/3的患者就诊时已出现局部转移，并且1/5的早期手术患者可发生局部复发或远处转移。常规化疗及放射性治疗的临床获益率也不高。DNA的甲基化是最常见的表观遗传现象，当基因启动子区的CpG岛发生甲基化时，常导致基因转录沉寂，使重要基因如抑癌基因、修复基因等丧失功能，导致正常细胞的生长分化调控失常，以及DNA损伤不能被及时修复，DNA的异常甲基化与多种肿瘤形成密切相关。在恶性黑色素瘤中，DNA的异常甲基化与其发生及进展存在密切关系。值得注意的是，DNA的异常甲基化具有可逆性，异常甲基化引起的基因沉默现象可被甲基化抑制剂逆转，本研究以人皮肤恶性黑色素瘤细胞A375为研究对象，观察甲基化抑制剂地西他滨对其增殖、凋亡、侵袭等生物学行为的影响，为恶性黑色素瘤的治疗提供新的思路和实验依据。
1 研究方法
1.1 实验材料与主要试剂
人皮肤恶性黑色素瘤A375细胞购自中科院上海细胞库；地西他滨购自Sigema公司；DMEM高糖培养基、无支原体胎牛血清、胰酶、噻唑蓝（MTT）及碘化丙啶（PI）够自于Thermo fisher公司；凋亡检测试剂盒够自于Beckman公司；去钙镁离子Hanks平衡盐溶液、PBS磷酸盐平衡液、双抗溶液（青、链霉素）够自于博士德公司；其他试剂为国产分析纯。
1.2 细胞培养
A375细胞常规复苏后，用含10%胎牛血清和1%双抗的高糖DMEM培养基培养。培养箱条件：37℃，5%CO2，饱和湿度，培养箱底层放置硫酸铜溶液。传代时采用Hanks平衡盐溶液漂洗3次，0.25%胰酶消化。
1.3 MTT实验
悬浮指数增长期的A375细胞，调整浓度为1×104个/ml，均匀接种到96孔板。细胞贴壁后更换培养基，加入待测药物。分别加入0μmol/l（对照组）、1μmol/l、5μmol/l、25μmol/l、125μmol/l的地西他滨。各浓度设5个重复孔。分别于加药后24h、48h、72h进行MTT检测，酶标仪测定波长490nm下的吸光值（A）。计算细胞生长抑制率，抑制率IR=（1-实验组A/对照组A）×100%。
1.4 细胞凋亡及周期检测
药物干预24h后，AnnexinV-FITC/PI法检测A375凋亡比例：收集各组的细胞，用冰PBS洗涤2次，1×bindingbuffer调整细胞浓度为104/ml，加入5μl AnnexinV稀释液混匀，再加入2.5μlPI混匀。避光、冰上孵育10min，加入400μl1× bindingbuffer，30min内置于流式细胞仪进行细胞凋亡的检测。细胞周期检测：用冰PBS液洗涤2次，加入预冷的70%乙醇，于4℃冰箱过夜。离心收集细胞，冰PBS液洗涤2次，用1ml PBS悬浮细胞，分别加入10μl PI（50mg/m1）及10g/1的RNaseA 5μl。室温避光30min后上流式细胞仪检测。应用CELLquest系统进行分析，实验重复3次，取平均值。
1.5 Transwell侵袭实验
调整细胞浓度为104/ml接种于Transwell孔板上室，上室培养基含不同浓度的药物，胎牛血清浓度为10%。下室仅加入培养基，胎牛血清浓度20%。置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养。24h后取出上室，去除上室的细胞，甲醛固定，苏木精染色，置于倒置显微镜下观察细胞通过情况，随机计数十个视野（200×）取平均值进行统计分析。重复3次实验，取平均值。
1.6 划痕愈合实验
将A375细胞接种于6孔板中，细胞生长至指数增长期时，用移液器枪尖进行划痕处理，PBS液洗去脱落的细胞，拍照后继续入培养箱培养。24h时对各组细胞再次拍照，图片采用Image Pro Plus软件进行分析。按照如下公式计算划痕愈合率，划痕愈合率（%）=（1各时间点划痕面积/开始的划痕面积）×100%，重复3次实验。
1.7 统计学方法
实验结果采用SPSS16.0软件分析，计量数据以均数±标准差表示，多组比较采用方差分析，两两比较采用t检验，检验水准α=0.05。
2 实验结果
2.1 地西他滨对A375细胞增殖的影响
MTT实验结果显示：与对照组细胞相比，地西他滨对A375细胞的增殖活性受到抑制（P<0.05），从MTT结果绘制的生长曲线可以看出：随着药物浓度的增加以及作用时间的延长，抑制率逐渐增高，即浓度和时间依赖性（见图1）。
2.2 地西他滨对A375细胞凋亡及细胞周期的影响
24h时，自5μmol/l浓度开始，A375细胞的凋亡比例显著增高，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05），说明地西他滨可有效诱导A375细胞凋亡（见表2，图2）；24h时，25μmol/l及125μmol/l浓度组A375细胞G0/G1期比例显著增高，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）（见表2，图3）。 2.3 地西他滨对A375细胞侵袭能力的影响
对照组A375细胞通过微孔的数量为34.7±6.5，不同浓度地西他滨干预后A375细胞通过微孔的数量依次为32.0±8.2、28.8±7.2、20.3±6.1、15.5±3.4。其中：地西他滨25μmol/l及125μmol/l组与对照组的差异有统计学意义（P<0.05）（见图4）。
2.4 地西他滨对A375细胞迁徙能力的影响
对照组及各浓度地西他滨组24h划痕愈合面积依次为（70.7±7.1）%、（66.3±4.8）%、（60.2±8.5）%、（34.1±7.8）%、（12.5±4.8）%。其中：5μmol/l、25μmol/l及125μmol/l组与对照组的差异有统计学意义（P<0.05）（见图5）。
3 讨论
表观遗传学是指基于非核苷酸序列改变所致基因表达水平变化，DNA甲基化是最常见的表观遗传现象，肿瘤抑制基因启动子区的异常甲基化是肿瘤发生过程中的显著特征，在分子水平比较肿瘤组织和其对应的正常组织，DNA甲基化状态的变化可能普遍存在，几乎所有的肿瘤中都能找到异常的DNA甲基化。DNA甲基化可以使癌细胞在肿瘤发生早期，更倾向于通过一些改变了的信号传导途径扩增并获得遗传突变，从而具有选择性，促进肿瘤的发生。在恶性黑色素瘤中亦存在DNA的异常甲基化：抑癌基因P16异常甲基化引起的细胞周期依赖性激酶抑制基因CDKN2A编码失活可能与其发生密切相关。此外，与细胞凋亡，增殖调节相关的基因如：RASSFIA，RUNX3，SOCS1等异常甲基化现象在恶性黑色素瘤中也陆续被发现。总之，DNA异常甲基化引起的抑癌基因或调节基因失活被认为与恶性黑色素瘤的发病密切相关。
地西他滨是一种特异性的甲基化转移酶抑制剂，其与甲基转移酶共价结合形成复合物，不可逆地抑制该酶的甲基转移活性而发挥去甲基化作用。目前，地西他滨已应用于临床，主要治疗骨髓增生异常综合征、慢性粒细胞白血病等血液系统疾病，虽然地西他滨尚未应用于实体瘤的治疗，但体外研究及动物实验结果显示其对实体瘤也具有一定的抗肿瘤效应。本研究观察了地西他滨对恶性黑色素瘤A375细胞增殖、凋亡、细胞周期、侵袭等生物学行为的影响。从MTT结果绘制的生长曲线可以看出，A375细胞的抑制率随着药物浓度的增加及作用时间的延长逐渐增高，说明地西他滨对A375细胞的增殖抑制作用具有一定的浓度和时间依赖性。通过流式细胞检测发现：经地西他滨处理的A375细胞凋亡比例显著增加，同时处于G0/G1期的细胞比例增加，S期比例减少，细胞周期受到阻滞。肿瘤细胞侵袭能力反映其恶性程度，本研究采用transwell小室实验模拟细胞侵袭过程，与对照组细胞相比，经地西他滨处理的A375细胞穿膜数量显著降低，提示地西他滨在一定程度上降低了A375细胞的侵袭能力。同时，同一时间点地西他滨组A375细胞的划痕愈合率明显小于对照组，说明地西他滨减弱了肿瘤细胞的运动迁徙能力。
综上研究结果表明：地西他滨在体外可有效抑制恶性黑色素瘤A375细胞生长、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期，同时削弱A375细胞侵袭、迁徙能力，有望为恶性黑色素瘤的治疗提供新的思路和实验依据，而其作用的分子机制及体内应用的安全性等尚待进一步研究。
编辑/张惠娟
[关键词]黑色素瘤；地西他滨；增殖；凋亡；侵袭
[中图分类号]R739.5 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2016）03-0039-05
皮肤恶性黑色素瘤起源于黑色素细胞，恶性程度高，易发生远处转移，预后较差。早期恶性黑色素瘤以外科治疗为主，但有1/3的患者就诊时已出现局部转移，并且1/5的早期手术患者可发生局部复发或远处转移。常规化疗及放射性治疗的临床获益率也不高。DNA的甲基化是最常见的表观遗传现象，当基因启动子区的CpG岛发生甲基化时，常导致基因转录沉寂，使重要基因如抑癌基因、修复基因等丧失功能，导致正常细胞的生长分化调控失常，以及DNA损伤不能被及时修复，DNA的异常甲基化与多种肿瘤形成密切相关。在恶性黑色素瘤中，DNA的异常甲基化与其发生及进展存在密切关系。值得注意的是，DNA的异常甲基化具有可逆性，异常甲基化引起的基因沉默现象可被甲基化抑制剂逆转，本研究以人皮肤恶性黑色素瘤细胞A375为研究对象，观察甲基化抑制剂地西他滨对其增殖、凋亡、侵袭等生物学行为的影响，为恶性黑色素瘤的治疗提供新的思路和实验依据。
1 研究方法
1.1 实验材料与主要试剂
人皮肤恶性黑色素瘤A375细胞购自中科院上海细胞库；地西他滨购自Sigema公司；DMEM高糖培养基、无支原体胎牛血清、胰酶、噻唑蓝（MTT）及碘化丙啶（PI）够自于Thermo fisher公司；凋亡检测试剂盒够自于Beckman公司；去钙镁离子Hanks平衡盐溶液、PBS磷酸盐平衡液、双抗溶液（青、链霉素）够自于博士德公司；其他试剂为国产分析纯。
1.2 细胞培养
A375细胞常规复苏后，用含10%胎牛血清和1%双抗的高糖DMEM培养基培养。培养箱条件：37℃，5%CO2，饱和湿度，培养箱底层放置硫酸铜溶液。传代时采用Hanks平衡盐溶液漂洗3次，0.25%胰酶消化。
1.3 MTT实验
悬浮指数增长期的A375细胞，调整浓度为1×104个/ml，均匀接种到96孔板。细胞贴壁后更换培养基，加入待测药物。分别加入0μmol/l（对照组）、1μmol/l、5μmol/l、25μmol/l、125μmol/l的地西他滨。各浓度设5个重复孔。分别于加药后24h、48h、72h进行MTT检测，酶标仪测定波长490nm下的吸光值（A）。计算细胞生长抑制率，抑制率IR=（1-实验组A/对照组A）×100%。
1.4 细胞凋亡及周期检测
药物干预24h后，AnnexinV-FITC/PI法检测A375凋亡比例：收集各组的细胞，用冰PBS洗涤2次，1×bindingbuffer调整细胞浓度为104/ml，加入5μl AnnexinV稀释液混匀，再加入2.5μlPI混匀。避光、冰上孵育10min，加入400μl1× bindingbuffer，30min内置于流式细胞仪进行细胞凋亡的检测。细胞周期检测：用冰PBS液洗涤2次，加入预冷的70%乙醇，于4℃冰箱过夜。离心收集细胞，冰PBS液洗涤2次，用1ml PBS悬浮细胞，分别加入10μl PI（50mg/m1）及10g/1的RNaseA 5μl。室温避光30min后上流式细胞仪检测。应用CELLquest系统进行分析，实验重复3次，取平均值。
1.5 Transwell侵袭实验
调整细胞浓度为104/ml接种于Transwell孔板上室，上室培养基含不同浓度的药物，胎牛血清浓度为10%。下室仅加入培养基，胎牛血清浓度20%。置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养。24h后取出上室，去除上室的细胞，甲醛固定，苏木精染色，置于倒置显微镜下观察细胞通过情况，随机计数十个视野（200×）取平均值进行统计分析。重复3次实验，取平均值。
1.6 划痕愈合实验
将A375细胞接种于6孔板中，细胞生长至指数增长期时，用移液器枪尖进行划痕处理，PBS液洗去脱落的细胞，拍照后继续入培养箱培养。24h时对各组细胞再次拍照，图片采用Image Pro Plus软件进行分析。按照如下公式计算划痕愈合率，划痕愈合率（%）=（1各时间点划痕面积/开始的划痕面积）×100%，重复3次实验。
1.7 统计学方法
实验结果采用SPSS16.0软件分析，计量数据以均数±标准差表示，多组比较采用方差分析，两两比较采用t检验，检验水准α=0.05。
2 实验结果
2.1 地西他滨对A375细胞增殖的影响
MTT实验结果显示：与对照组细胞相比，地西他滨对A375细胞的增殖活性受到抑制（P<0.05），从MTT结果绘制的生长曲线可以看出：随着药物浓度的增加以及作用时间的延长，抑制率逐渐增高，即浓度和时间依赖性（见图1）。
2.2 地西他滨对A375细胞凋亡及细胞周期的影响
24h时，自5μmol/l浓度开始，A375细胞的凋亡比例显著增高，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05），说明地西他滨可有效诱导A375细胞凋亡（见表2，图2）；24h时，25μmol/l及125μmol/l浓度组A375细胞G0/G1期比例显著增高，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）（见表2，图3）。 2.3 地西他滨对A375细胞侵袭能力的影响
对照组A375细胞通过微孔的数量为34.7±6.5，不同浓度地西他滨干预后A375细胞通过微孔的数量依次为32.0±8.2、28.8±7.2、20.3±6.1、15.5±3.4。其中：地西他滨25μmol/l及125μmol/l组与对照组的差异有统计学意义（P<0.05）（见图4）。
2.4 地西他滨对A375细胞迁徙能力的影响
对照组及各浓度地西他滨组24h划痕愈合面积依次为（70.7±7.1）%、（66.3±4.8）%、（60.2±8.5）%、（34.1±7.8）%、（12.5±4.8）%。其中：5μmol/l、25μmol/l及125μmol/l组与对照组的差异有统计学意义（P<0.05）（见图5）。
3 讨论
表观遗传学是指基于非核苷酸序列改变所致基因表达水平变化，DNA甲基化是最常见的表观遗传现象，肿瘤抑制基因启动子区的异常甲基化是肿瘤发生过程中的显著特征，在分子水平比较肿瘤组织和其对应的正常组织，DNA甲基化状态的变化可能普遍存在，几乎所有的肿瘤中都能找到异常的DNA甲基化。DNA甲基化可以使癌细胞在肿瘤发生早期，更倾向于通过一些改变了的信号传导途径扩增并获得遗传突变，从而具有选择性，促进肿瘤的发生。在恶性黑色素瘤中亦存在DNA的异常甲基化：抑癌基因P16异常甲基化引起的细胞周期依赖性激酶抑制基因CDKN2A编码失活可能与其发生密切相关。此外，与细胞凋亡，增殖调节相关的基因如：RASSFIA，RUNX3，SOCS1等异常甲基化现象在恶性黑色素瘤中也陆续被发现。总之，DNA异常甲基化引起的抑癌基因或调节基因失活被认为与恶性黑色素瘤的发病密切相关。
地西他滨是一种特异性的甲基化转移酶抑制剂，其与甲基转移酶共价结合形成复合物，不可逆地抑制该酶的甲基转移活性而发挥去甲基化作用。目前，地西他滨已应用于临床，主要治疗骨髓增生异常综合征、慢性粒细胞白血病等血液系统疾病，虽然地西他滨尚未应用于实体瘤的治疗，但体外研究及动物实验结果显示其对实体瘤也具有一定的抗肿瘤效应。本研究观察了地西他滨对恶性黑色素瘤A375细胞增殖、凋亡、细胞周期、侵袭等生物学行为的影响。从MTT结果绘制的生长曲线可以看出，A375细胞的抑制率随着药物浓度的增加及作用时间的延长逐渐增高，说明地西他滨对A375细胞的增殖抑制作用具有一定的浓度和时间依赖性。通过流式细胞检测发现：经地西他滨处理的A375细胞凋亡比例显著增加，同时处于G0/G1期的细胞比例增加，S期比例减少，细胞周期受到阻滞。肿瘤细胞侵袭能力反映其恶性程度，本研究采用transwell小室实验模拟细胞侵袭过程，与对照组细胞相比，经地西他滨处理的A375细胞穿膜数量显著降低，提示地西他滨在一定程度上降低了A375细胞的侵袭能力。同时，同一时间点地西他滨组A375细胞的划痕愈合率明显小于对照组，说明地西他滨减弱了肿瘤细胞的运动迁徙能力。
综上研究结果表明：地西他滨在体外可有效抑制恶性黑色素瘤A375细胞生长、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期，同时削弱A375细胞侵袭、迁徙能力，有望为恶性黑色素瘤的治疗提供新的思路和实验依据，而其作用的分子机制及体内应用的安全性等尚待进一步研究。
编辑/张惠娟