论文部分内容阅读
【摘要】 目的 比较古代煎法、日本标准汤剂煎法、医疗机构煎法、古今结合煎法4种方法制备的银翘散汤剂，选择最优方法，为中药解表剂煎煮工艺的标准化提供依据。方法 采用高效液相色谱法，以主要药效成分的含量及4种煎法所测干膏率的综合评分作为评价指标。结果 古代煎法所制的银翘散综合评分最高，且重复验证试验结果稳定。结论 可将古代煎法作为银翘散汤剂制备工艺的参考标准，进一步规范解表剂标准汤剂的制备工艺。
【关键词】 银翘散；标准汤剂；评价指标
Abstract：Objective To compare the four kinds of Yinqiao Powder prepared by archaic decoction， Japan standard decoction， medical institution decoction and decoction combined archaic with modern technology， select the best method and provide the important theory basis for standardization of decoction technics of diaphoretic recipes. Methods The major contents of traditional Chinese medicine were determined by HPLC and used as the eva luating indicator as well as the ratio of dry extraction. Results The method of archaic decoction got the highest synthetic scores， and the validating experimental result was stable. Conclusion The preparation method of archaic decoction could be used as the reference standard for preparation technology of Yinqiao Powder， in order to further standardize the preparation of the standard decoction of diaphoretic recipes.
Key words：Yinqiao Powder；standard decoction；eva luating indicator
银翘散出自清朝吴瑭《温病条辨》，由连翘20 g，金银花20 g，薄荷12 g，荆芥8 g，牛蒡子12 g，淡竹叶8 g，桔梗12 g，淡豆豉10 g，甘草10 g组成，临床多用于风热感冒的治疗。该处方药味组成较多，部分药物有效成分含量测定方法不成熟。本试验通过测定5味主药的有效成分，即君药金银花之绿原酸、连翘之连翘苷，臣药牛蒡子中的牛蒡苷，荆芥、薄荷共有的挥发性成分胡薄荷酮的含量，并结合干膏率对4种煎煮方法（古代方剂煎煮法，日本标准汤剂煎煮法，医疗机构煎煮法，古今结合煎煮法）制备的银翘散汤剂进行综合评价，规范解表剂的煎煮操作，为汤剂煎煮流程的标准化提供示范性研究。
1 仪器与试药
HP1100高效液相色谱仪（美国惠普公司），HP8453紫外-可见分光光度计（美国惠普公司），双波长薄层扫描仪CS-930（日本岛津），Sartorius BP211D电子分析天平（德国赛多利斯）， AK-400A摇摆式中药粉碎机。
乙腈、甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，水为重蒸馏水。绿原酸对照品（批号110753-200413）、连翘苷对照品（批号110821-200610）、胡薄荷酮对照品（批号11706-200602）、牛蒡苷对照品（批号110819-200606）均购自中国药品生物制品检定所。处方所用中药材均购自成都新荷花饮片公司，经成都中医药大学附属医院药剂科张家明老师鉴定，符合2005年版《中华人民共和国药典》（一部）各药项下要求。
2 方法与结果
2.1 标准汤剂的制备
2.1.1 古代方剂煎煮法 《温病条辨》中对银翘散用法的记载“上杵为散……香气大出，即取服，勿过煎。肺药取其轻清，过煎则味厚入中焦矣”[1]可知，药材入药前需粉碎，且煎煮时间不宜过长。现代研究中，刘氏等[2]对银翘散的煎煮时间进行了研究，药理实验表明，银翘散降低发热大鼠下丘脑组织中环磷酸腺苷的含量、增强免疫抑制小鼠网状内皮系统的吞噬功能及延长其游泳耐力时间的效应，以沸后3 min和6 min为优，实际煎煮过程中亦发现银翘散在煮沸3 min后即香气大出。因此，把沸后3 min作为银翘散古代方剂煎煮法的煎煮时限。本试验按处方比例称取药材，粉碎成最粗粉，置砂锅中，加10倍水，以大火烧开后保持沸腾3 min，过滤，滤液备用。
2.1.2 日本标准汤剂煎煮法 在日本，称取相当于日剂量中药制剂的标准药材，粉碎，加20倍量水，煎煮30 min以上，浓缩至原体积的一半，趁热过滤，即可制得标准煎剂[3]。本试验按处方比例称取药材，粉碎成最粗粉，置烧杯中，加20倍量水，煎煮，保持微沸30 min以上，药液至原体积的一半，停止加热。过滤，滤液备用。
2.1.3 医疗机构煎煮法 参考医院煎药操作规程[4]，按处方比例称取药材，置砂锅中，浸泡30 min，煎煮2次，第1次加7倍量水，煎煮，保持微沸15 min，第2次加3倍量水，煎煮，保持微沸10 min，过滤，合并滤液备用。
2.1.4 古今结合煎煮方法 按处方比例称取药材，置砂锅中，浸泡30 min，煎煮2次，分别加7、3倍量水，2次煎煮均保持微沸3 min，过滤，合并滤液备用。 2.2 色谱条件
2.2.1 金银花 色谱柱：依利特ODS柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（9∶91）；检测波长：327 nm；柱温：25 ℃；流速：1 mL/min；进样量：对照品10 μL，样品5 μL。色谱图见图1。注：A.对照品；B.样品（下同）图1 绿原酸HPLC图谱
2.2.2 连翘 色谱柱：依利特ODS柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（18∶82）；检测波长：277 nm；柱温：25 ℃；流速：1 mL/min；进样量：对照品、样品均为5 μL。色谱图见图2。图2连翘苷HPLC图谱
2.2.3 荆芥、薄荷 色谱柱：依利特ODS柱（150 mm×4.6 mm， 5 μm）；流动相：乙腈-水（38∶62）；检测波长：256 nm，柱温：25 ℃；流速：0.8 mL/min；进样量：对照品5 μL，样品20 μL。色谱图见图3。图3胡薄荷酮HPLC图谱
2.2.4 牛蒡子 色谱柱：依利特ODS柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（1∶1.1）；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；进样量：对照品5 μL，样品10 μL。色谱图见图4。图4牛蒡苷HPLC图谱
2.3 对照品溶液的制备
精密称取绿原酸对照品6.78 mg，加50%甲醇制成每1 mL含0.271 2 mg的溶液；精密称取连翘苷对照品4.89 mg，加甲醇制成每1 mL含0.195 6 mg的溶液；精密称取胡薄荷酮对照品2.53 mg，加甲醇制成每1 mL含0.101 2 mg的溶液；精密称取牛蒡苷对照品11.95 g，加甲醇制成每1 mL含0.478 mg的溶液。上述各溶液分别作为绿原酸、连翘苷、胡薄荷酮、牛蒡苷对照品溶液。
2.4 样品溶液的制备
精密吸取上述古代方剂煎煮法、日本标准汤剂煎煮法、医疗机构煎煮法、古今结合煎煮方法的各标准汤剂煎出液10 mL，置25 mL容量瓶中，绿原酸待测样品用50%甲醇定容至刻度，连翘苷、牛蒡苷、胡薄荷酮待测样品用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得古代方剂煎煮法、日本标准汤剂煎煮法、医疗机构煎煮法、古今结合煎煮法样品溶液。2.5 标准曲线及线性范围
分别吸取上述4种对照品溶液，注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，记录峰面积和进样浓度。以对照品峰面积为纵坐标、进样量（μg）为横坐标绘制标准曲线。绿原酸进样量在0.271 2～4.068 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y=410.89X-2.84，r=0.999 9；连翘苷进样量在0.097 8～2.934 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y=1 820.8X+9.08，r=1.000 0；胡薄荷酮进样量在0.010 1～0.101 2 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y=865.14X-0.19，r=0.999 7；牛蒡苷进样量在0.478～3.346 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y=522.48X+0.18，r=0.999 9。
2.6 干膏率测定与综合评分
参照2005年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅩA浸出物测定法项下规定，测定，并以绿原酸、连翘苷、胡薄荷酮、牛蒡苷、干膏率5个指标进行综合评分，结果见表1 表1干膏率测定与综合评分结果 注：A.所测绿原酸含量与处方中所投金银花药材量之比；B.所测连翘苷含量与处方中所投连翘药材量之比；C.所测胡薄荷酮含量与处方中所投。综合加权评分公式：W=（A/Amax+B/Bmax+C/Cmax+D/Dmax）×22.5+E/Emax×10。4种制备方法所取处方药量一致。
从表1可以看出，4种银翘散标准汤剂，从连翘苷、牛蒡苷、干膏率3个指标看，日本标准汤剂煎煮法优于其他3种煎煮法，但是方中挥发性成分胡薄荷酮的含量检测不出。古代煎煮法在绿原酸和胡薄荷酮2个指标上优势明显。综合评分为古代煎煮法得分最高。
荆芥、薄荷药材总量之比；D.所测牛蒡苷含量与处方中所投牛蒡子药材量之比
2.7 验证试验
为进一步验证所得工艺的可行性和稳定性，以古代煎煮工艺为标准，制备3批样品，进行验证试验，结果见表2 表2 验证试验结果。表明工艺稳定可靠，说明可定义古代煎煮工艺为银翘散标准汤剂制备工艺。
3 讨论
《温病条辨》中未明确记载银翘散的煎煮时间，只提示“香气大出，即取服，勿过煎”，这与现代中药研究中对煎煮时间的要求一致，“解表药及其他芳香性药物，一般用武火迅速煮沸，改用文火维持10～15 min即可”[5]。汤剂的煎煮时间一般根据所加溶媒量和煎取量来控制，多数汤剂皆以煎煮至所加溶媒量的1/2～1/3左右为度，部分方剂还根据方中某些药物的煎煮程度来掌握煎药时间[6]。根据此传统经验操作难以实现中药煎煮的规范化。参考刘氏等[2]实验，并结合实际煎煮体验，认为银翘散煎煮时间不宜过长。
日本标准汤剂煎法在连翘苷、牛蒡苷、干膏率3个指标上优势明显，但是方中挥发性成分胡薄荷酮的含量检测不出，说明该方法提取过程中将挥发性成分损失殆尽，荆芥、薄荷两味臣药的作用被大大减弱。古代方剂煎煮方法在保证君药金银花、连翘有效成分的同时，最大程度地保留了挥发性成分胡薄荷酮，更符合中医“君臣佐使”的用药原则。
张氏等[7]采用HPLC法测定保和口服液中连翘苷的含量，样品的前处理较烦琐，需过氧化铝柱。本研究的样品处理简单，不影响连翘苷分离效果的同时，也避免了前处理过程所带来的操作误差。金银花、连翘、荆芥、薄荷的含量测定方法最初均采用2005年版《中华人民共和国药典》中的色谱条件，但所测峰和杂质峰重合严重，分离效果差。经过试验摸索，确定为当前的测定方法，所测峰与其他峰有良好的分离，保留时间适当。经方法学考察，均达到要求。
古代煎煮方法成分煎出率较高，重复性、稳定性好，更重要的是其减少了浸泡环节且煎煮时间短，符合现代人快节奏的生活方式，可为银翘散标准汤剂的制备提供依据。通过药理实验进一步验证银翘散不同标准汤剂的药效将是下一步的工作重点。
【参考文献】 1 李济群.方剂学[M].上海：上海科学技术出版社，1986.30-43. 2 刘亚娴，霍炳杰，张 莉，等.银翘散在不同煎煮时间下对致热大鼠体温及下丘脑cAMP含量的影响[J].中华中医药学刊，2008，26（2）：247. 3 魏 刚.标准汤剂论[J].中国中医药信息杂志，1998，5（4）：6-8. 4 李景开.医院中药管理学[M].北京：中国医药科技出版社，1997.206. 5 雷载权.中药学[M].上海：上海科学技术出版社，2003.25. 6 于桂兰.汤剂煎煮时间与疗效[J].中国实验方剂学杂志，2006，12（10）：20，65. 7 张雪原，林晓辉.高效液相色谱法测定保和口服液中连翘苷的含量[J].今日药学，2009，19（1）：36.
【关键词】 银翘散；标准汤剂；评价指标
Abstract：Objective To compare the four kinds of Yinqiao Powder prepared by archaic decoction， Japan standard decoction， medical institution decoction and decoction combined archaic with modern technology， select the best method and provide the important theory basis for standardization of decoction technics of diaphoretic recipes. Methods The major contents of traditional Chinese medicine were determined by HPLC and used as the eva luating indicator as well as the ratio of dry extraction. Results The method of archaic decoction got the highest synthetic scores， and the validating experimental result was stable. Conclusion The preparation method of archaic decoction could be used as the reference standard for preparation technology of Yinqiao Powder， in order to further standardize the preparation of the standard decoction of diaphoretic recipes.
Key words：Yinqiao Powder；standard decoction；eva luating indicator
银翘散出自清朝吴瑭《温病条辨》，由连翘20 g，金银花20 g，薄荷12 g，荆芥8 g，牛蒡子12 g，淡竹叶8 g，桔梗12 g，淡豆豉10 g，甘草10 g组成，临床多用于风热感冒的治疗。该处方药味组成较多，部分药物有效成分含量测定方法不成熟。本试验通过测定5味主药的有效成分，即君药金银花之绿原酸、连翘之连翘苷，臣药牛蒡子中的牛蒡苷，荆芥、薄荷共有的挥发性成分胡薄荷酮的含量，并结合干膏率对4种煎煮方法（古代方剂煎煮法，日本标准汤剂煎煮法，医疗机构煎煮法，古今结合煎煮法）制备的银翘散汤剂进行综合评价，规范解表剂的煎煮操作，为汤剂煎煮流程的标准化提供示范性研究。
1 仪器与试药
HP1100高效液相色谱仪（美国惠普公司），HP8453紫外-可见分光光度计（美国惠普公司），双波长薄层扫描仪CS-930（日本岛津），Sartorius BP211D电子分析天平（德国赛多利斯）， AK-400A摇摆式中药粉碎机。
乙腈、甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，水为重蒸馏水。绿原酸对照品（批号110753-200413）、连翘苷对照品（批号110821-200610）、胡薄荷酮对照品（批号11706-200602）、牛蒡苷对照品（批号110819-200606）均购自中国药品生物制品检定所。处方所用中药材均购自成都新荷花饮片公司，经成都中医药大学附属医院药剂科张家明老师鉴定，符合2005年版《中华人民共和国药典》（一部）各药项下要求。
2 方法与结果
2.1 标准汤剂的制备
2.1.1 古代方剂煎煮法 《温病条辨》中对银翘散用法的记载“上杵为散……香气大出，即取服，勿过煎。肺药取其轻清，过煎则味厚入中焦矣”[1]可知，药材入药前需粉碎，且煎煮时间不宜过长。现代研究中，刘氏等[2]对银翘散的煎煮时间进行了研究，药理实验表明，银翘散降低发热大鼠下丘脑组织中环磷酸腺苷的含量、增强免疫抑制小鼠网状内皮系统的吞噬功能及延长其游泳耐力时间的效应，以沸后3 min和6 min为优，实际煎煮过程中亦发现银翘散在煮沸3 min后即香气大出。因此，把沸后3 min作为银翘散古代方剂煎煮法的煎煮时限。本试验按处方比例称取药材，粉碎成最粗粉，置砂锅中，加10倍水，以大火烧开后保持沸腾3 min，过滤，滤液备用。
2.1.2 日本标准汤剂煎煮法 在日本，称取相当于日剂量中药制剂的标准药材，粉碎，加20倍量水，煎煮30 min以上，浓缩至原体积的一半，趁热过滤，即可制得标准煎剂[3]。本试验按处方比例称取药材，粉碎成最粗粉，置烧杯中，加20倍量水，煎煮，保持微沸30 min以上，药液至原体积的一半，停止加热。过滤，滤液备用。
2.1.3 医疗机构煎煮法 参考医院煎药操作规程[4]，按处方比例称取药材，置砂锅中，浸泡30 min，煎煮2次，第1次加7倍量水，煎煮，保持微沸15 min，第2次加3倍量水，煎煮，保持微沸10 min，过滤，合并滤液备用。
2.1.4 古今结合煎煮方法 按处方比例称取药材，置砂锅中，浸泡30 min，煎煮2次，分别加7、3倍量水，2次煎煮均保持微沸3 min，过滤，合并滤液备用。 2.2 色谱条件
2.2.1 金银花 色谱柱：依利特ODS柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（9∶91）；检测波长：327 nm；柱温：25 ℃；流速：1 mL/min；进样量：对照品10 μL，样品5 μL。色谱图见图1。注：A.对照品；B.样品（下同）图1 绿原酸HPLC图谱
2.2.2 连翘 色谱柱：依利特ODS柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（18∶82）；检测波长：277 nm；柱温：25 ℃；流速：1 mL/min；进样量：对照品、样品均为5 μL。色谱图见图2。图2连翘苷HPLC图谱
2.2.3 荆芥、薄荷 色谱柱：依利特ODS柱（150 mm×4.6 mm， 5 μm）；流动相：乙腈-水（38∶62）；检测波长：256 nm，柱温：25 ℃；流速：0.8 mL/min；进样量：对照品5 μL，样品20 μL。色谱图见图3。图3胡薄荷酮HPLC图谱
2.2.4 牛蒡子 色谱柱：依利特ODS柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（1∶1.1）；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；进样量：对照品5 μL，样品10 μL。色谱图见图4。图4牛蒡苷HPLC图谱
2.3 对照品溶液的制备
精密称取绿原酸对照品6.78 mg，加50%甲醇制成每1 mL含0.271 2 mg的溶液；精密称取连翘苷对照品4.89 mg，加甲醇制成每1 mL含0.195 6 mg的溶液；精密称取胡薄荷酮对照品2.53 mg，加甲醇制成每1 mL含0.101 2 mg的溶液；精密称取牛蒡苷对照品11.95 g，加甲醇制成每1 mL含0.478 mg的溶液。上述各溶液分别作为绿原酸、连翘苷、胡薄荷酮、牛蒡苷对照品溶液。
2.4 样品溶液的制备
精密吸取上述古代方剂煎煮法、日本标准汤剂煎煮法、医疗机构煎煮法、古今结合煎煮方法的各标准汤剂煎出液10 mL，置25 mL容量瓶中，绿原酸待测样品用50%甲醇定容至刻度，连翘苷、牛蒡苷、胡薄荷酮待测样品用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得古代方剂煎煮法、日本标准汤剂煎煮法、医疗机构煎煮法、古今结合煎煮法样品溶液。2.5 标准曲线及线性范围
分别吸取上述4种对照品溶液，注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，记录峰面积和进样浓度。以对照品峰面积为纵坐标、进样量（μg）为横坐标绘制标准曲线。绿原酸进样量在0.271 2～4.068 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y=410.89X-2.84，r=0.999 9；连翘苷进样量在0.097 8～2.934 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y=1 820.8X+9.08，r=1.000 0；胡薄荷酮进样量在0.010 1～0.101 2 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y=865.14X-0.19，r=0.999 7；牛蒡苷进样量在0.478～3.346 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y=522.48X+0.18，r=0.999 9。
2.6 干膏率测定与综合评分
参照2005年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅩA浸出物测定法项下规定，测定，并以绿原酸、连翘苷、胡薄荷酮、牛蒡苷、干膏率5个指标进行综合评分，结果见表1 表1干膏率测定与综合评分结果 注：A.所测绿原酸含量与处方中所投金银花药材量之比；B.所测连翘苷含量与处方中所投连翘药材量之比；C.所测胡薄荷酮含量与处方中所投。综合加权评分公式：W=（A/Amax+B/Bmax+C/Cmax+D/Dmax）×22.5+E/Emax×10。4种制备方法所取处方药量一致。
从表1可以看出，4种银翘散标准汤剂，从连翘苷、牛蒡苷、干膏率3个指标看，日本标准汤剂煎煮法优于其他3种煎煮法，但是方中挥发性成分胡薄荷酮的含量检测不出。古代煎煮法在绿原酸和胡薄荷酮2个指标上优势明显。综合评分为古代煎煮法得分最高。
荆芥、薄荷药材总量之比；D.所测牛蒡苷含量与处方中所投牛蒡子药材量之比
2.7 验证试验
为进一步验证所得工艺的可行性和稳定性，以古代煎煮工艺为标准，制备3批样品，进行验证试验，结果见表2 表2 验证试验结果。表明工艺稳定可靠，说明可定义古代煎煮工艺为银翘散标准汤剂制备工艺。
3 讨论
《温病条辨》中未明确记载银翘散的煎煮时间，只提示“香气大出，即取服，勿过煎”，这与现代中药研究中对煎煮时间的要求一致，“解表药及其他芳香性药物，一般用武火迅速煮沸，改用文火维持10～15 min即可”[5]。汤剂的煎煮时间一般根据所加溶媒量和煎取量来控制，多数汤剂皆以煎煮至所加溶媒量的1/2～1/3左右为度，部分方剂还根据方中某些药物的煎煮程度来掌握煎药时间[6]。根据此传统经验操作难以实现中药煎煮的规范化。参考刘氏等[2]实验，并结合实际煎煮体验，认为银翘散煎煮时间不宜过长。
日本标准汤剂煎法在连翘苷、牛蒡苷、干膏率3个指标上优势明显，但是方中挥发性成分胡薄荷酮的含量检测不出，说明该方法提取过程中将挥发性成分损失殆尽，荆芥、薄荷两味臣药的作用被大大减弱。古代方剂煎煮方法在保证君药金银花、连翘有效成分的同时，最大程度地保留了挥发性成分胡薄荷酮，更符合中医“君臣佐使”的用药原则。
张氏等[7]采用HPLC法测定保和口服液中连翘苷的含量，样品的前处理较烦琐，需过氧化铝柱。本研究的样品处理简单，不影响连翘苷分离效果的同时，也避免了前处理过程所带来的操作误差。金银花、连翘、荆芥、薄荷的含量测定方法最初均采用2005年版《中华人民共和国药典》中的色谱条件，但所测峰和杂质峰重合严重，分离效果差。经过试验摸索，确定为当前的测定方法，所测峰与其他峰有良好的分离，保留时间适当。经方法学考察，均达到要求。
古代煎煮方法成分煎出率较高，重复性、稳定性好，更重要的是其减少了浸泡环节且煎煮时间短，符合现代人快节奏的生活方式，可为银翘散标准汤剂的制备提供依据。通过药理实验进一步验证银翘散不同标准汤剂的药效将是下一步的工作重点。
【参考文献】 1 李济群.方剂学[M].上海：上海科学技术出版社，1986.30-43. 2 刘亚娴，霍炳杰，张 莉，等.银翘散在不同煎煮时间下对致热大鼠体温及下丘脑cAMP含量的影响[J].中华中医药学刊，2008，26（2）：247. 3 魏 刚.标准汤剂论[J].中国中医药信息杂志，1998，5（4）：6-8. 4 李景开.医院中药管理学[M].北京：中国医药科技出版社，1997.206. 5 雷载权.中药学[M].上海：上海科学技术出版社，2003.25. 6 于桂兰.汤剂煎煮时间与疗效[J].中国实验方剂学杂志，2006，12（10）：20，65. 7 张雪原，林晓辉.高效液相色谱法测定保和口服液中连翘苷的含量[J].今日药学，2009，19（1）：36.