【摘 要】
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DNA错配修复蛋白MutL和其它的修复蛋白相互作用来共同完成大肠杆菌甲基介导的错配修复过程.为研究修复蛋白MutL的体外生物功能构建了融合蛋白Trx-His6-Linker peptide-MutL(T
【机 构】
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中国科学院武汉病毒所,中国科学院沈阳应用生态研究所,Department of Biochemistry
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DNA错配修复蛋白MutL和其它的修复蛋白相互作用来共同完成大肠杆菌甲基介导的错配修复过程.为研究修复蛋白MutL的体外生物功能构建了融合蛋白Trx-His6-Linker peptide-MutL(THLL)的表达载体并使其高效表达及易于纯化.mutL基因片段是以E.coli K-12基因组为模板经PCR扩增获得,并通过基因的体外拼接成功构建了融合蛋白THLL表达载体pET32a-linker peptidemutL.重组菌株 E.coti AD494(DE3)/pET32a-linkr peptide-mutL经过IPTG的诱导表达了融合蛋白THLLL.收集菌体细胞、超声波破碎后离心取上清进行SDS-PAGE分析,结果表明有一与预期分子量(84 kD)相应的诱导表达条带出现,其表达量约占全细胞蛋白的30%且以可溶形式存在.利用固定化金属离子(Ni2+)配体亲和层析柱纯化融合蛋白THLL,其纯度达到90%.通过非变性凝胶电泳分析,对融合蛋白THLL在DNA错配修复过程中的分子伴侣生物功能进行了系统研究.结果表明,THLL能增加融合蛋白Trx-His6-Linker peptide-MutS(THLS)与含有错配碱基DNA双链的结合,但受ATP的浓度变化影响很大.
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