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[關键词] 卡介苗多糖核酸;卵蛋白;哮喘;细胞因子
[中图分类号] R186 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2021）25-0043-04
Effects of BCG-polysaccharide nucleic acid and OVA allergen combined with chitosan nano sustained-release vaccine on inflammatory cells and cytokines in bronchoalveolar lavage fluid of asthmatic mice
YANG Wentao XIE Yanping
Department of Respiratory Medicine， Huzhou First People′s Hospital in Zhejiang Province， Huzhou 313000， China
[Abstract] Objective To explore the effects of BCG-polysaccharide nucleic acid （BCG-PSN） and ovalbumin （OVA） allergen combined with chitosan （CS） nano sustained-release vaccine on inflammatory cells and inflammatory factors in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） of asthmatic mice. Methods A total of 80 mice were randomly divided into 8 groups （group A was normal control group， group B was asthma group， group C was blank CS group， group D was CS-BCG-PSN group， group E was CS-OVA group， group F was BCG-PSN group， group G was CS-BCG-PSN-OVA vaccine group， group H was hormone group）. Except for the normal control group and asthma group， asthmatic mice in each group received intraperitoneal injection of corresponding drugs on the 18th and 24th day.The mice in the hormone group were injected with dexamethasone intraperitoneally before atomization-induced asthma.The asthma group and the normal control group were given the corresponding dose of normal saline at each time point. 48 hours after the last induction，the related cytokines （IL-4 and IFN-γ） and the count of leukocytes and eosinophils in BALF were measured. Results The number of leukocytes and eosinophils and IL-4 in group D， group E， group F and group G were lower than those in group B and group C. The decrease of leukocyte，eosinophil count and IL-4 in asthmatic mice treated with CS was more significant than that in BCG-PSN and OVA alone（P<0.05）.Moreover，the levels of IFN-γ in group D， E， F and G was higher than that in asthma group and blank CS group， and the increase of IFN-γ in asthmatic mice treated with BCG-PSN combined with OVA was higher than that in BCG-PSN and OVA separately（P<0.05）. Conclusion CS-BCG-PSN-OVA complex can regulate the number of cells and the level of cytokines， which may be used to correct the imbalance of Th1/Th2 proportion and further alleviate airway inflammation，thereby providing a theoretical basis for the treatment of asthma. [Key words] BCG-polysaccharide nucleic acid; Ovalbumin; Asthma; Cytokines
支气管哮喘是由多种细胞包括气道的炎症细胞和结构细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[1]。目前认为机体吸入过敏原后导致CD4+T细胞过度活化，导致Th1/Th2比例失衡，Th2型细胞增多，IL-4、IL-5、IL-13等Th2型细胞因子明显增多;Th1型细胞相应减少，IFN-γ等细胞因子分泌减少，进一步导致以嗜酸性粒细胞浸润为主的气道变态反应性炎症[2-3]。本实验通过采用包裹卵蛋白（Ovalbumin，OVA）和卡介苗多糖核酸（BCG-polysaccharide nucleic acid，BCG-PSN）免疫调节剂的过敏原复合壳聚糖（Chitosan，CS）纳米缓释疫苗，注入OVA致敏和激发的哮喘小鼠，观察对支气管哮喘相关细胞因子及炎症细胞在支气管肺泡灌洗液中的影响，并与壳聚糖分别单独包封的OVA和BCG-PSN相比较，且进一步探讨其机制，为临床哮喘治疗提供新的思路，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 包封药物的壳聚糖纳米微粒的制备 ①离子凝胶法制备CS-BCG-PSN-OVA疫苗：壳聚糖（南京盈通生物科技有限公司）溶解于1%醋酸溶液制成浓度为1.5 mg/mL的溶液，调节pH值为5.5～5.7。在持续磁力搅拌下，向壳聚糖溶液中加入BCG-PSN（湖南斯奇生物制药有限公司）和OVA溶液（湖州师范学院生命科学学院提供），保持磁力搅拌10 min，再缓慢加入0.1%三聚磷酸钠溶液（美国默克公司），直至形成淡白色的乳光溶液。②制备CS-BCG-PSN和CS-OVA：方法同上。③壳聚糖纳米微粒的检测：采用马尔文纳米粒径和电位分析仪（上海思百吉仪器系统有限公司）检测以上壳聚糖纳米微粒的粒径和zeta电位。透射电镜（赛默飞公司）检测壳聚糖纳米微粒的粒径、分散性和状态。
1.1.2 小鼠的分组 随机选取同一批次80只雌性BALB/c小鼠（SPF级），由湖州师范学院生命科学学院实验动物中心提供，将实验小鼠随机分为八组（A组：正常对照组;B组：哮喘组;C组：空白壳聚糖组;D组：CS-BCG-PSN组;E组：CS-OVA组;F组：BCG-PSN组;G组：CS-BCG-PSN-OVA疫苗组;H组：激素组），每组各10只。
1.2 方法
1.2.1 哮喘模型制备 除正常对照组外，各组在第0、7、14天腹腔注射0.1 mL致敏液[50 μg OVA+1 mg Al（OH）3]，第28、29、30、31天予1% OVA溶液5 mL雾化吸入激发，每天1次，每次雾化时间持续30 min。正常对照组以医用生理盐水代替OVA致敏和激发，具体用药剂量及方法同实验组[4]。
1.2.2 给药 除正常对照组和哮喘组外，各组均于第18天和第24天腹腔注射0.2 mL相应药物干预哮喘小鼠。激素组小鼠于雾化激发支气管哮喘前半小时腹腔内注射地塞米松针2 mg/kg。哮喘组、正常对照组在各个对应时间点给予0.2 mL的医用生理盐水腹腔注射[5]。
1.3 观察指标
末次激发后48 h，高速離心小鼠BALF后取上清液，利用ELISA法测定相关细胞因子（IL-4、IFN-γ，赛默飞公司试剂盒），利用瑞氏染色对取得的细胞进行染色，光学显微镜下进行白细胞和嗜酸性粒细胞的计数。
1.4 统计学方法
利用SPSS 19.0统计学软件对测定的数据进行分析，各组数据用（x±s）表示。采用单因素方差分析法（one-way ANOVA）对组间数据进行分析，方差分析先行方差齐性检验，方差不齐进行平方根转换，用LSD-t法进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组小鼠肺泡灌洗液炎症细胞计数比较
正常对照组的白细胞数及嗜酸性粒细胞数在正常范围内，与哮喘组及空白壳聚糖组相比，D组：CS-BCG-PSN组;E组：CS-OVA组;F组：BCG-PSN组;G组：CS-BCG-PSN-OVA疫苗组白细胞及嗜酸性粒细胞数均有不同程度的降低（P<0.05），壳聚糖同时包埋卡介苗多糖核酸、卵蛋白作用于哮喘小鼠后，白细胞及嗜酸性粒细胞下降的程度，较单独包埋卡介苗多糖核酸及卵蛋白更大，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 各组小鼠肺泡灌洗液细胞因子水平比较
正常对照组的IL-4在正常范围内，与哮喘组及空白壳聚糖组相比，D：CS-BCG-PSN组、E：CS-OVA组、F：BCG-PSN组、G：CS-BCG-PSN-OVA疫苗组IL-4均有不同程度的降低（P<0.05），壳聚糖同时包埋卡介苗多糖核酸、卵蛋白作用于哮喘小鼠后，IL-4的下降程度较单独包埋卡介苗多糖核酸及卵蛋白更大，差异有统计学意义（P<0.05）;正常对照组的IFN-γ在正常范围内，与哮喘组及空白壳聚糖组相比，D：CS-BCG-PSN组、E：CS-OVA组、F：BCG-PSN组、G：CS-BCG-PSN-OVA疫苗组IL-4均有不同程度的升高（P<0.05），壳聚糖同时包埋卡介苗多糖核酸、卵蛋白作用于哮喘小鼠后，IFN-γ的升高程度较单独包埋卡介苗多糖核酸及卵蛋白更大，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
3 讨论
支气管哮喘是一种病因复杂的慢性气道炎症性呼吸系统疾病，近年来，其发病率和病死率在世界范围内明显增加，2015年的《全球疾病负担报告》估计全世界哮喘患者达3.58亿，而世界卫生组织（WHO）预计到2025年全球哮喘患者将达到1亿人。目前认为治疗哮喘最有效的药物是糖皮质激素，糖皮质激素具有强大的抗炎、抗过敏及降低气道高反应的作用，但其带来的诸如骨质疏松、股骨头坏死、继发性机会性感染等临床后果同样严重影响着患者的生命及生存质量[6]。因此，如何更有效及更安全地对支气管哮喘进行临床治疗逐渐成为近年研究热点。 Th1和Th2是Th细胞的两种不同细胞亚型，可分泌不同的细胞因子，相关细胞因子的分泌数量及比率会在支气管哮喘疾病的发生发展中发生相应的变化[7]。当外来过敏原激活T淋巴细胞时，T淋巴细胞可发生相应分化，转为不同的细胞亚群，其中Th1细胞在哮喘发生发展过程中分泌相应细胞因子（IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-β等），而Th2细胞经信号传递激活后可分泌IL-4、IL5、IL-6、IL-10和IL-13。而上述细胞因子水平或比率的变化进一步影响支气管哮喘的气道炎症程度以及临床病情的转归[8-9]。故Th1和Th2细胞及分泌的细胞因子在支气管哮喘的发生发展中扮演着重要的角色。研究如何应用相关药物对Th1和Th2细胞平衡进行相关调节，对相应细胞因子水平变化进行调控成为近些年来哮喘方面研究的新方向。此外，近年来对支气管哮喘相关靶向治疗药物的研究，包括IgE相关性单克隆抗体、相关细胞因子的拮抗剂等可能成为未来治疗重症哮喘、严重激素依赖性哮喘或过敏性哮喘的新选择[10-12]。另外一方面，气道炎症细胞特别是嗜酸性粒细胞的浸润在支气管哮喘的发生发展过程中亦起到至关重要的作用，在Th2细胞分泌的炎症因子（如IL-4、IL-5）的趋化作用下，嗜酸性粒细胞被活化，从外周体液、组织转移至气道内，在气道及气道周围浸润，通过一系列的病理生理过程进一步引发哮喘，所以在支气管哮喘的治疗中，抑制嗜酸性粒细胞的浸润，加速细胞凋亡，有助于哮喘的控制及转归[13]。
卡介苗（BCG）是结核杆菌的减毒菌株，主要成分包括脂类、多糖、蛋白和核酸，其中多糖和核酸组分发挥着重要作用。卡介苗多糖核酸（BCG-PSN）具有较强的免疫调节作用，已经应用于支气管哮喘的临床治疗[14]。国外动物实验表明BCG及BCG-PSN能够抑制抗原特异性IgE产生，显著地减少哮喘动物的气道嗜酸性粒细胞炎症，抑制气道高反应性[15-16]。王苹莉等[17]发现，新生小鼠出生后第1、7、14天给予BCG免疫小鼠后可显著抑制小鼠的嗜酸性气道炎症，上调支气管肺泡灌洗液和脾细胞悬液上清中IFN-γ水平，从而激活Th1型细胞免疫反应，纠正Th1/Th2比例失衡[17]。
过敏原特异性免疫治疗（脱敏治疗）是唯一针对病因的治疗哮喘方法。目前认为脱敏治疗能作用于哮喘发病免疫机制的多个不同环节，包括纠正Th1/Th2失衡、诱导生成封闭性抗体，诱导调节性T细胞产生、诱导机体对过敏原特异性免疫耐受等[18-19]。
壳聚糖是天然存在的唯一碱性阳离子聚合物，无毒、无免疫原性、无致突性，具有良好的生物相容性及可降解性，而且具备海绵状特殊结构，是一种优良的缓释药物载体。纳米颗粒具有体积小、比表面积大及具有生物亲和性，易于在其表面耦联特异性的靶向分子等优点。壳聚糖纳米化后形成壳聚糖纳米微球后，可以包封核酸、蛋白和多糖类药物，可以保护封入的药物不被体内酸、碱或核酸酶破坏[20]。而且，壳聚糖具有缓释药物的作用，体外释放时间可达6 d以上。壳聚糖具有保护包封的过敏原免破坏，而且能缓释药物[21]。如果采用壳聚糖包封小剂量过敏原进行脱敏治疗则可以避免传统脱敏治疗由于不断增加过敏原用量所致的严重副作用。
本实验中，通过壳聚糖包埋卡介苗多糖核酸及卵蛋白形成的复合物作用于哮喘小鼠，提取小鼠肺泡灌洗液测定相关细胞成分及炎症因子发现，CS-BCG-PSN-OVA复合物能明显减少肺泡灌洗液中白细胞总数及嗜酸性粒细胞的数目，细胞因子IL-4浓度较哮喘模型组降低，细胞因子IFN-γ浓度较哮喘组升高，且与壳聚糖包埋单独包埋卡介苗多糖核酸、卵蛋白相比，升高或降低的程度更大，差异有统计学意义，壳聚糖具有缓释药物的作用，BCG-PSN及OVA均具有减少肺泡灌洗液中白细胞总数及嗜酸性粒细胞的数目，降低细胞因子IL-4浓度水平，升高细胞因子IFN-γ浓度水平的作用，用壳聚糖同时包埋二者，缓慢释放二者，药物存在协同作用。进一步提示CS-BCG-PSN-OVA复合物确实有望通过调节细胞数及细胞因子的水平缓解气道炎症，从而进一步为治疗哮喘提供理论依据。
[参考文献]
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（收稿日期：2020-10-29）
[中图分类号] R186 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2021）25-0043-04
Effects of BCG-polysaccharide nucleic acid and OVA allergen combined with chitosan nano sustained-release vaccine on inflammatory cells and cytokines in bronchoalveolar lavage fluid of asthmatic mice
YANG Wentao XIE Yanping
Department of Respiratory Medicine， Huzhou First People′s Hospital in Zhejiang Province， Huzhou 313000， China
[Abstract] Objective To explore the effects of BCG-polysaccharide nucleic acid （BCG-PSN） and ovalbumin （OVA） allergen combined with chitosan （CS） nano sustained-release vaccine on inflammatory cells and inflammatory factors in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） of asthmatic mice. Methods A total of 80 mice were randomly divided into 8 groups （group A was normal control group， group B was asthma group， group C was blank CS group， group D was CS-BCG-PSN group， group E was CS-OVA group， group F was BCG-PSN group， group G was CS-BCG-PSN-OVA vaccine group， group H was hormone group）. Except for the normal control group and asthma group， asthmatic mice in each group received intraperitoneal injection of corresponding drugs on the 18th and 24th day.The mice in the hormone group were injected with dexamethasone intraperitoneally before atomization-induced asthma.The asthma group and the normal control group were given the corresponding dose of normal saline at each time point. 48 hours after the last induction，the related cytokines （IL-4 and IFN-γ） and the count of leukocytes and eosinophils in BALF were measured. Results The number of leukocytes and eosinophils and IL-4 in group D， group E， group F and group G were lower than those in group B and group C. The decrease of leukocyte，eosinophil count and IL-4 in asthmatic mice treated with CS was more significant than that in BCG-PSN and OVA alone（P<0.05）.Moreover，the levels of IFN-γ in group D， E， F and G was higher than that in asthma group and blank CS group， and the increase of IFN-γ in asthmatic mice treated with BCG-PSN combined with OVA was higher than that in BCG-PSN and OVA separately（P<0.05）. Conclusion CS-BCG-PSN-OVA complex can regulate the number of cells and the level of cytokines， which may be used to correct the imbalance of Th1/Th2 proportion and further alleviate airway inflammation，thereby providing a theoretical basis for the treatment of asthma. [Key words] BCG-polysaccharide nucleic acid; Ovalbumin; Asthma; Cytokines
支气管哮喘是由多种细胞包括气道的炎症细胞和结构细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[1]。目前认为机体吸入过敏原后导致CD4+T细胞过度活化，导致Th1/Th2比例失衡，Th2型细胞增多，IL-4、IL-5、IL-13等Th2型细胞因子明显增多;Th1型细胞相应减少，IFN-γ等细胞因子分泌减少，进一步导致以嗜酸性粒细胞浸润为主的气道变态反应性炎症[2-3]。本实验通过采用包裹卵蛋白（Ovalbumin，OVA）和卡介苗多糖核酸（BCG-polysaccharide nucleic acid，BCG-PSN）免疫调节剂的过敏原复合壳聚糖（Chitosan，CS）纳米缓释疫苗，注入OVA致敏和激发的哮喘小鼠，观察对支气管哮喘相关细胞因子及炎症细胞在支气管肺泡灌洗液中的影响，并与壳聚糖分别单独包封的OVA和BCG-PSN相比较，且进一步探讨其机制，为临床哮喘治疗提供新的思路，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 包封药物的壳聚糖纳米微粒的制备 ①离子凝胶法制备CS-BCG-PSN-OVA疫苗：壳聚糖（南京盈通生物科技有限公司）溶解于1%醋酸溶液制成浓度为1.5 mg/mL的溶液，调节pH值为5.5～5.7。在持续磁力搅拌下，向壳聚糖溶液中加入BCG-PSN（湖南斯奇生物制药有限公司）和OVA溶液（湖州师范学院生命科学学院提供），保持磁力搅拌10 min，再缓慢加入0.1%三聚磷酸钠溶液（美国默克公司），直至形成淡白色的乳光溶液。②制备CS-BCG-PSN和CS-OVA：方法同上。③壳聚糖纳米微粒的检测：采用马尔文纳米粒径和电位分析仪（上海思百吉仪器系统有限公司）检测以上壳聚糖纳米微粒的粒径和zeta电位。透射电镜（赛默飞公司）检测壳聚糖纳米微粒的粒径、分散性和状态。
1.1.2 小鼠的分组 随机选取同一批次80只雌性BALB/c小鼠（SPF级），由湖州师范学院生命科学学院实验动物中心提供，将实验小鼠随机分为八组（A组：正常对照组;B组：哮喘组;C组：空白壳聚糖组;D组：CS-BCG-PSN组;E组：CS-OVA组;F组：BCG-PSN组;G组：CS-BCG-PSN-OVA疫苗组;H组：激素组），每组各10只。
1.2 方法
1.2.1 哮喘模型制备 除正常对照组外，各组在第0、7、14天腹腔注射0.1 mL致敏液[50 μg OVA+1 mg Al（OH）3]，第28、29、30、31天予1% OVA溶液5 mL雾化吸入激发，每天1次，每次雾化时间持续30 min。正常对照组以医用生理盐水代替OVA致敏和激发，具体用药剂量及方法同实验组[4]。
1.2.2 给药 除正常对照组和哮喘组外，各组均于第18天和第24天腹腔注射0.2 mL相应药物干预哮喘小鼠。激素组小鼠于雾化激发支气管哮喘前半小时腹腔内注射地塞米松针2 mg/kg。哮喘组、正常对照组在各个对应时间点给予0.2 mL的医用生理盐水腹腔注射[5]。
1.3 观察指标
末次激发后48 h，高速離心小鼠BALF后取上清液，利用ELISA法测定相关细胞因子（IL-4、IFN-γ，赛默飞公司试剂盒），利用瑞氏染色对取得的细胞进行染色，光学显微镜下进行白细胞和嗜酸性粒细胞的计数。
1.4 统计学方法
利用SPSS 19.0统计学软件对测定的数据进行分析，各组数据用（x±s）表示。采用单因素方差分析法（one-way ANOVA）对组间数据进行分析，方差分析先行方差齐性检验，方差不齐进行平方根转换，用LSD-t法进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组小鼠肺泡灌洗液炎症细胞计数比较
正常对照组的白细胞数及嗜酸性粒细胞数在正常范围内，与哮喘组及空白壳聚糖组相比，D组：CS-BCG-PSN组;E组：CS-OVA组;F组：BCG-PSN组;G组：CS-BCG-PSN-OVA疫苗组白细胞及嗜酸性粒细胞数均有不同程度的降低（P<0.05），壳聚糖同时包埋卡介苗多糖核酸、卵蛋白作用于哮喘小鼠后，白细胞及嗜酸性粒细胞下降的程度，较单独包埋卡介苗多糖核酸及卵蛋白更大，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 各组小鼠肺泡灌洗液细胞因子水平比较
正常对照组的IL-4在正常范围内，与哮喘组及空白壳聚糖组相比，D：CS-BCG-PSN组、E：CS-OVA组、F：BCG-PSN组、G：CS-BCG-PSN-OVA疫苗组IL-4均有不同程度的降低（P<0.05），壳聚糖同时包埋卡介苗多糖核酸、卵蛋白作用于哮喘小鼠后，IL-4的下降程度较单独包埋卡介苗多糖核酸及卵蛋白更大，差异有统计学意义（P<0.05）;正常对照组的IFN-γ在正常范围内，与哮喘组及空白壳聚糖组相比，D：CS-BCG-PSN组、E：CS-OVA组、F：BCG-PSN组、G：CS-BCG-PSN-OVA疫苗组IL-4均有不同程度的升高（P<0.05），壳聚糖同时包埋卡介苗多糖核酸、卵蛋白作用于哮喘小鼠后，IFN-γ的升高程度较单独包埋卡介苗多糖核酸及卵蛋白更大，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
3 讨论
支气管哮喘是一种病因复杂的慢性气道炎症性呼吸系统疾病，近年来，其发病率和病死率在世界范围内明显增加，2015年的《全球疾病负担报告》估计全世界哮喘患者达3.58亿，而世界卫生组织（WHO）预计到2025年全球哮喘患者将达到1亿人。目前认为治疗哮喘最有效的药物是糖皮质激素，糖皮质激素具有强大的抗炎、抗过敏及降低气道高反应的作用，但其带来的诸如骨质疏松、股骨头坏死、继发性机会性感染等临床后果同样严重影响着患者的生命及生存质量[6]。因此，如何更有效及更安全地对支气管哮喘进行临床治疗逐渐成为近年研究热点。 Th1和Th2是Th细胞的两种不同细胞亚型，可分泌不同的细胞因子，相关细胞因子的分泌数量及比率会在支气管哮喘疾病的发生发展中发生相应的变化[7]。当外来过敏原激活T淋巴细胞时，T淋巴细胞可发生相应分化，转为不同的细胞亚群，其中Th1细胞在哮喘发生发展过程中分泌相应细胞因子（IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-β等），而Th2细胞经信号传递激活后可分泌IL-4、IL5、IL-6、IL-10和IL-13。而上述细胞因子水平或比率的变化进一步影响支气管哮喘的气道炎症程度以及临床病情的转归[8-9]。故Th1和Th2细胞及分泌的细胞因子在支气管哮喘的发生发展中扮演着重要的角色。研究如何应用相关药物对Th1和Th2细胞平衡进行相关调节，对相应细胞因子水平变化进行调控成为近些年来哮喘方面研究的新方向。此外，近年来对支气管哮喘相关靶向治疗药物的研究，包括IgE相关性单克隆抗体、相关细胞因子的拮抗剂等可能成为未来治疗重症哮喘、严重激素依赖性哮喘或过敏性哮喘的新选择[10-12]。另外一方面，气道炎症细胞特别是嗜酸性粒细胞的浸润在支气管哮喘的发生发展过程中亦起到至关重要的作用，在Th2细胞分泌的炎症因子（如IL-4、IL-5）的趋化作用下，嗜酸性粒细胞被活化，从外周体液、组织转移至气道内，在气道及气道周围浸润，通过一系列的病理生理过程进一步引发哮喘，所以在支气管哮喘的治疗中，抑制嗜酸性粒细胞的浸润，加速细胞凋亡，有助于哮喘的控制及转归[13]。
卡介苗（BCG）是结核杆菌的减毒菌株，主要成分包括脂类、多糖、蛋白和核酸，其中多糖和核酸组分发挥着重要作用。卡介苗多糖核酸（BCG-PSN）具有较强的免疫调节作用，已经应用于支气管哮喘的临床治疗[14]。国外动物实验表明BCG及BCG-PSN能够抑制抗原特异性IgE产生，显著地减少哮喘动物的气道嗜酸性粒细胞炎症，抑制气道高反应性[15-16]。王苹莉等[17]发现，新生小鼠出生后第1、7、14天给予BCG免疫小鼠后可显著抑制小鼠的嗜酸性气道炎症，上调支气管肺泡灌洗液和脾细胞悬液上清中IFN-γ水平，从而激活Th1型细胞免疫反应，纠正Th1/Th2比例失衡[17]。
过敏原特异性免疫治疗（脱敏治疗）是唯一针对病因的治疗哮喘方法。目前认为脱敏治疗能作用于哮喘发病免疫机制的多个不同环节，包括纠正Th1/Th2失衡、诱导生成封闭性抗体，诱导调节性T细胞产生、诱导机体对过敏原特异性免疫耐受等[18-19]。
壳聚糖是天然存在的唯一碱性阳离子聚合物，无毒、无免疫原性、无致突性，具有良好的生物相容性及可降解性，而且具备海绵状特殊结构，是一种优良的缓释药物载体。纳米颗粒具有体积小、比表面积大及具有生物亲和性，易于在其表面耦联特异性的靶向分子等优点。壳聚糖纳米化后形成壳聚糖纳米微球后，可以包封核酸、蛋白和多糖类药物，可以保护封入的药物不被体内酸、碱或核酸酶破坏[20]。而且，壳聚糖具有缓释药物的作用，体外释放时间可达6 d以上。壳聚糖具有保护包封的过敏原免破坏，而且能缓释药物[21]。如果采用壳聚糖包封小剂量过敏原进行脱敏治疗则可以避免传统脱敏治疗由于不断增加过敏原用量所致的严重副作用。
本实验中，通过壳聚糖包埋卡介苗多糖核酸及卵蛋白形成的复合物作用于哮喘小鼠，提取小鼠肺泡灌洗液测定相关细胞成分及炎症因子发现，CS-BCG-PSN-OVA复合物能明显减少肺泡灌洗液中白细胞总数及嗜酸性粒细胞的数目，细胞因子IL-4浓度较哮喘模型组降低，细胞因子IFN-γ浓度较哮喘组升高，且与壳聚糖包埋单独包埋卡介苗多糖核酸、卵蛋白相比，升高或降低的程度更大，差异有统计学意义，壳聚糖具有缓释药物的作用，BCG-PSN及OVA均具有减少肺泡灌洗液中白细胞总数及嗜酸性粒细胞的数目，降低细胞因子IL-4浓度水平，升高细胞因子IFN-γ浓度水平的作用，用壳聚糖同时包埋二者，缓慢释放二者，药物存在协同作用。进一步提示CS-BCG-PSN-OVA复合物确实有望通过调节细胞数及细胞因子的水平缓解气道炎症，从而进一步为治疗哮喘提供理论依据。
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（收稿日期：2020-10-29）