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摘要：目的：研究重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）肾损伤中Toll样受体(Toll—like receptor，TLR2/4mRNA)表达的变化及意义。方法：采用逆行胰胆管牛磺胆酸钠(Sodium taurocholate，STC)注射建立SAP肾损伤动物模型，假手术组采用同剂量的生理盐水逆行胰胆管注射。40只雄性SD大鼠随机分为假手术组(n=10，S组)和重症急性胰腺炎肾损伤组(n=30，P组)。S组在术后6小时剖杀动物；P组分别在术后3小时、6小时和12小时三个时间点分批剖杀10只SD大鼠，两组对象分别检测SD大鼠血清淀粉酶、尿素氮、肌酐水平的变化以及肾组织TLR2和TLR4mRNA表达的变化。结果：P组血清淀粉酶、尿素氮和肌酐水平均高于S组(P＜0.05)，且P组分别在术后不同时间点测得的值随时间推移逐渐升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，肾损伤更严重。肾组织TLR2和TLR4mRNA在S组仅有低表达，在P组3点表达开始增高，术后12点该两指标表达达到峰值(P＜0.05）。结论：重症急性胰腺炎时，肾组织内TLR2和TLR4的基因的表达上调；肾组织内该两种基因表达增高可能在SAP肾损伤的发生、发展中起作用。
关键词：胰腺炎 肾损伤 TOLL样受体
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1008-1879(2012)03-0045-02
重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是一种病死率较高的常见的腹部外科急腹症，可引起肺、肾、肝等重要多脏器功能障碍，甚至死亡。据研究报道，SAP的发生与Toll样受体2/4 (Toll—like receptor 2/4，TLR2/4)密切相关［1-2］，TLR2/4mRNA与SAP所致肝、肺损伤均进行了初步研究并证实有一定的关联性，TLR2/4mRNA是否与SAP所致肾损伤也有关联尚未阐明，本实验就此进行初步研究。
1 材料与方法
1.1 材料。动物模型制备。雄性健康SD大鼠40只随机分为胰腺炎组和假手术组，实验前大鼠禁食不禁水12h。胰腺炎组（n=30只）采用5％牛磺胆酸钠(TAC)逆行胰胆管注射制造动物模型；假手术组（n=10只）麻醉后用同剂量生理盐水逆行胰胆管注射，其余步骤同手术组。
1.2 研究方法。
1.2.1 标本采集。以上各组均于术后3，6，12时三个时间杀动物，留取静脉血（储存于4℃）和肾组织标本（储存于-70℃）待测。血清标本采用生化自动分析仪测血清淀粉酶、尿素氮和肌酐；肾组织标本采用RT-PCR检测肾组织TLR2和TLR4mRNA。
1.2.2 主要仪器和试剂。全自动生化分析仪（北京奥普森公司），牛磺胆酸钠(TAC)（上海佳和生物科技有限公司），PCR仪（美国ABI公司）,血清淀粉酶试剂盒，RT-PCR检测试剂盒（上海劲马生物科技有限公司），TLR2/4引物（上海生工有限公司提供）
1.2.3 TLR2和TLR4mRNA的检测。无菌留取肾组织约50mg，以Trizol一步法提取细胞总RNA,采用荧光实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术对逆转录一扩增产物进行定量分析。
TLR2引物序列：
Forward primer：5′-CGCTTCCTGAACTGTCC-3′
Reverse primer：5′-GGTTGTCACCTGCTCCA-3 ′
扩增片段约为200bp；荧光探针序列为5′-ACTAAGAGGCGGAGCGGA-3′。TLR2扩增循环条件：95℃,3min；（95℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 30s）40个循环；72℃ 8min。
TLR4引物序列：
Forward primer：5′-ATCATGGCATTGTTCCTCCT-3′
Reverse primer：5′-CTGAGATTCTGATCCATGCATIG-3′
扩增片段约为100 bp；荧光探针的序列为5’-TCGGTAACGACGGTGTAG-3’。TLR4扩增循环条件：95℃,5min；（95℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 30s）40个循环；72℃ 8min。
1.3 统计学分析。实验数据均以均值±标准差（X±S）表示；多组数据之间组间比较采用LSD-t检验或方差分析，组内比较采用SNK-q检验，采用SPSS12.0软件进行统计学分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组对象血清淀粉酶、尿素氮和肌酐比较 P组与S组比较，以及P组中3h，6h，12h三个时间组内比较，血清淀粉酶(tsp3h=16.6，tsp6h=116,tsp12h=4.2，qp3，6h=4.1，qp3，12h=6.8，qp6，12h=5.3，P＜0.05）尿素氮(tsp3h=10.9，tsp6h=28.4,tsp12h=40.2，qp3，6h=5.6，qp3，12h=7.8，qp6，12h=5.9，P＜0.05）和肌苷(tsp3h=12.4，tsp6h=20.2,tsp12h=24.5，qp3，6h=7.0，qp3，12h=6.5，qp6，12h=4.8，P＜0.05）均显著升高。（表1）
2.2 肾组织中TLR2和TLR4mRNA表达的变化。肾组织TLR2和TLR4mRNA在S组仅有低表达，在P组3点表达开始增高，术后12点该两指标表达达到峰值(TLR2：tsp3h=6.9，tsp6h=7.6,tsp12h=8.4，qp3，6h=4.6，qp3，12h=5.1，qp6，12h=5.9，P＜0.05；TLR4：tsp3h=5.5，tsp6h=6.3,tsp12h=10.2，qp3，6h=7.5，qp3，12h=8.8，qp6，12h=6.2，P＜0.05）。
3 讨论
采用逆行胰胆管牛磺胆酸钠注射成功建立SAP肾损伤动物模型已得到国内外学者公认［3，4］，Anders HJ［5］和Schroppel B［6］研究发现Toll-like受体在肾损伤中扮演重要的角色。
本实验结果显示，P组与S组比较，以及P组中3h，6h，12h三个时间组内比较，血清淀粉酶，尿素氮和肌苷均显著升高（P＜0.05），以上说明SAP出现肾损伤，且随着时间推移不断加重。S组大鼠肾组织中均有少量的TLR2和TLR4mRNA表达；P组大鼠术后3h时间点肾组织中TLR2和TLR4mRNA表达开始出现增高，12h时间点达到高峰，同时肾损伤加重。由此说明，重症急性胰腺炎时，肾组织内TLR2和TLR4的基因表达明显上调。可能的机制是上调的TLR2/4作为新的受体介导更多的细胞活化和炎症介质的生成，促炎症细胞因子的释放还可以导致中性粒细胞的粘附、聚集和激活。而中性粒细胞在急性重症胰腺炎肾损。
关键词：胰腺炎 肾损伤 TOLL样受体
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1008-1879(2012)03-0045-02
重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是一种病死率较高的常见的腹部外科急腹症，可引起肺、肾、肝等重要多脏器功能障碍，甚至死亡。据研究报道，SAP的发生与Toll样受体2/4 (Toll—like receptor 2/4，TLR2/4)密切相关［1-2］，TLR2/4mRNA与SAP所致肝、肺损伤均进行了初步研究并证实有一定的关联性，TLR2/4mRNA是否与SAP所致肾损伤也有关联尚未阐明，本实验就此进行初步研究。
1 材料与方法
1.1 材料。动物模型制备。雄性健康SD大鼠40只随机分为胰腺炎组和假手术组，实验前大鼠禁食不禁水12h。胰腺炎组（n=30只）采用5％牛磺胆酸钠(TAC)逆行胰胆管注射制造动物模型；假手术组（n=10只）麻醉后用同剂量生理盐水逆行胰胆管注射，其余步骤同手术组。
1.2 研究方法。
1.2.1 标本采集。以上各组均于术后3，6，12时三个时间杀动物，留取静脉血（储存于4℃）和肾组织标本（储存于-70℃）待测。血清标本采用生化自动分析仪测血清淀粉酶、尿素氮和肌酐；肾组织标本采用RT-PCR检测肾组织TLR2和TLR4mRNA。
1.2.2 主要仪器和试剂。全自动生化分析仪（北京奥普森公司），牛磺胆酸钠(TAC)（上海佳和生物科技有限公司），PCR仪（美国ABI公司）,血清淀粉酶试剂盒，RT-PCR检测试剂盒（上海劲马生物科技有限公司），TLR2/4引物（上海生工有限公司提供）
1.2.3 TLR2和TLR4mRNA的检测。无菌留取肾组织约50mg，以Trizol一步法提取细胞总RNA,采用荧光实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术对逆转录一扩增产物进行定量分析。
TLR2引物序列：
Forward primer：5′-CGCTTCCTGAACTGTCC-3′
Reverse primer：5′-GGTTGTCACCTGCTCCA-3 ′
扩增片段约为200bp；荧光探针序列为5′-ACTAAGAGGCGGAGCGGA-3′。TLR2扩增循环条件：95℃,3min；（95℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 30s）40个循环；72℃ 8min。
TLR4引物序列：
Forward primer：5′-ATCATGGCATTGTTCCTCCT-3′
Reverse primer：5′-CTGAGATTCTGATCCATGCATIG-3′
扩增片段约为100 bp；荧光探针的序列为5’-TCGGTAACGACGGTGTAG-3’。TLR4扩增循环条件：95℃,5min；（95℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 30s）40个循环；72℃ 8min。
1.3 统计学分析。实验数据均以均值±标准差（X±S）表示；多组数据之间组间比较采用LSD-t检验或方差分析，组内比较采用SNK-q检验，采用SPSS12.0软件进行统计学分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组对象血清淀粉酶、尿素氮和肌酐比较 P组与S组比较，以及P组中3h，6h，12h三个时间组内比较，血清淀粉酶(tsp3h=16.6，tsp6h=116,tsp12h=4.2，qp3，6h=4.1，qp3，12h=6.8，qp6，12h=5.3，P＜0.05）尿素氮(tsp3h=10.9，tsp6h=28.4,tsp12h=40.2，qp3，6h=5.6，qp3，12h=7.8，qp6，12h=5.9，P＜0.05）和肌苷(tsp3h=12.4，tsp6h=20.2,tsp12h=24.5，qp3，6h=7.0，qp3，12h=6.5，qp6，12h=4.8，P＜0.05）均显著升高。（表1）
2.2 肾组织中TLR2和TLR4mRNA表达的变化。肾组织TLR2和TLR4mRNA在S组仅有低表达，在P组3点表达开始增高，术后12点该两指标表达达到峰值(TLR2：tsp3h=6.9，tsp6h=7.6,tsp12h=8.4，qp3，6h=4.6，qp3，12h=5.1，qp6，12h=5.9，P＜0.05；TLR4：tsp3h=5.5，tsp6h=6.3,tsp12h=10.2，qp3，6h=7.5，qp3，12h=8.8，qp6，12h=6.2，P＜0.05）。
3 讨论
采用逆行胰胆管牛磺胆酸钠注射成功建立SAP肾损伤动物模型已得到国内外学者公认［3，4］，Anders HJ［5］和Schroppel B［6］研究发现Toll-like受体在肾损伤中扮演重要的角色。
本实验结果显示，P组与S组比较，以及P组中3h，6h，12h三个时间组内比较，血清淀粉酶，尿素氮和肌苷均显著升高（P＜0.05），以上说明SAP出现肾损伤，且随着时间推移不断加重。S组大鼠肾组织中均有少量的TLR2和TLR4mRNA表达；P组大鼠术后3h时间点肾组织中TLR2和TLR4mRNA表达开始出现增高，12h时间点达到高峰，同时肾损伤加重。由此说明，重症急性胰腺炎时，肾组织内TLR2和TLR4的基因表达明显上调。可能的机制是上调的TLR2/4作为新的受体介导更多的细胞活化和炎症介质的生成，促炎症细胞因子的释放还可以导致中性粒细胞的粘附、聚集和激活。而中性粒细胞在急性重症胰腺炎肾损。