反相HPLC法测定参南星口服液中人参皂苷Rg1的含量

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  【摘要】目的:建立以HPLC法测定参南星口服液中人参皂苷Rg1含量的方法。方法:采用Thermo C18(200mm×4.6mm,5μm)柱,以乙腈:0.4%磷酸=20:80为流动相,检测波长:203nm,流速1.0ml•min-1。结果:人参皂苷Rg1在0.4284~2.142μg范围内线性关系良好,r=0.9999,平均加样回收率为99.2%。结论:本方法操作简便、方法可靠,结果准确、灵敏度高,重复性好,适合于参南星口服液中人参皂苷Rg1的含量测定。
  【关键词】高效液相色谱法;参南星口服液;人参皂苷Rg1
  
  Determination of GinsenosideRg1 in Shennanxing Koufuye by RP-HPLC
  Zengke
  (Loudi Institute for Drug Control417000)
  【Abstract】Objective: To establish a HPLC method for the determination of GinsenosideRg1 in Shennanxing Koufuye. Method: A Thermo C18(4.6mm×200mm,5μm)column was used. The mobile phase was acetonitrile: 0.4% phosphoric acid =20:80, the detecting wavelength was at 203nm and the flow rate was 1.0ml•min-1.Result:The linear range of GinsenosideRg1 was within 0.4284~2.142μg. г=0.9999,the average recovery was 99.2%.Conclusion: This method has good repeatability, flexibility and high sensitivity. It can be used for quality control of Shennanxing Koufuye.
  【Key words】HPLC; Shennanxing Koufuye; GinsenosideRg1
  
  參南星口服液是由红参、柴胡、黄芪、郁金、栀子等制成的中成药。具有健脾益气、解郁调神之功效,临床用于慢性疲劳综合症证属肝郁脾虚型、可改善倦怠乏力、思维迟钝、头晕胀痛、烦躁易怒、失眠健忘、咽喉疼痛、耳鸣目眩、食欲不振、肌肉关节酸痛等。国家食品药品监督管理局标准(试行)WS-5536(B-0536)-2002收载了该药品质量标准。原标准中含量测定项目为HPLC法测定方中君药红参的有效成分人参皂苷Rg1的含量,其色谱条件为乙腈:0.05%磷酸=99:100,结果峰形差,出峰时间晚且各色谱峰分离差,难以准确进行定量。为保证其质量稳定可靠,确保疗效,参照有关文献[4] ,笔者优化了原色谱条件改为乙腈:0.4%磷酸=20:80,结果峰形好,出峰时间适当且各色谱峰分离好,可有效、准确地对人参皂苷Rg1进行定量测定。
  1仪器与试药
  1.1仪器
  美国Waters高效液相色谱仪(1525二元泵,717自动进样器,2487双通道检测器, 1500柱温箱,Empower色谱工作站);AG135电子分析天平(Mettler Toledo)。
  1.2试药
  人参皂苷Rg1对照品(批号:110703-200726,含量97.7%,中国药品生物制品检定所),参南星口服液(批号090501、090601、090801,黑龙江天戈药业有限责任公司),甲醇为色谱纯,水为分子超纯化Ⅰ级水,其它试剂均为分析纯。
  2方法与结果
  2.1溶液的制备
  2.1.1对照品溶液的制备
  精密称取人参皂苷Rg1对照品(经五氧化二磷减压干燥16h,含量为97.7%)10.96mg,置于100ml量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,即得(浓度为:107.1μg/ml)。
  2.1.2供试品溶液的制备
  取本品5支的内容物,混匀,精密量取20ml置分液漏斗中,加氯化钠2g,振摇溶解后,加乙醚振摇提取2次,每次20ml,弃去乙醚液,再加水饱和正丁醇振摇提取5次(25ml、25ml、20ml、20ml、15ml),合并正丁醇液,用氨试液洗涤2次,每次25 ml,弃去氨试液,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇溶解,并转移至10 ml量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,用0.45μm微孔滤膜过滤,即得。
  2.2色谱条件及干扰试验
  采用Thermo C18(200mm×4.6mm,5μm)色谱柱,流动相为乙腈—0.4%磷酸(20:80),流速为1.0ml•min-1,柱温为 24℃,检测波长为203nm,进样量为20μl。此条件下,人参皂苷Rg1与邻峰基线达到较好分离,分离度2.6以上,理论板数按人参皂苷Rg1峰计不低于5200。取除红参外的其他几味药,制成缺红参的阴性样品,再按供试品溶液的制备方法,制得阴性样品溶液,依法测定,阴性样品溶液无干扰。结果如图1所示。
  
  A 人参皂苷Rg1B 供试品 C 阴性样品
   1-人参皂苷Rg1
  图1HPLC色谱图
  2.3线性关系的考察
  精密吸取4.0,8.0,10.0,12.0,16.0,20.0μl上述对照品溶液,分别注入液相色谱仪测定。记录峰面积,以进样量C为横坐标,峰面积A为纵坐标,进行线性回归,得回归方程为:A=3.362×105C-2.986×103,(r=0.9999)。结果显示,人参皂苷Rg1的进样量在0.4284~2.142μg范围内,与峰面积呈良好线性关系。
  2.4精密度试验
  精密吸取12μl对照品溶液,在上述色谱条件下,重复进样6次,记录峰面积。结果得,人参皂苷Rg1峰面积的RSD值为0.9%。
  2.5稳定性试验
  取参南星口服液(批号:090601)的供试品溶液。分别于(0,4,8,12,18h)按供试品测定方法进样,记录峰面积。结果得,人参皂苷Rg1峰面积的RSD为1.7%。结果表明,供试品溶液在18h内基本稳定。
  2.6重复性试验
  取参南星口服液(批号:090601)的样品,按上述供试品的制备方法,制备5份供试品溶液。依法测定,记录峰面积。计算含量,得平均含量为0.2816mg•支-1(RSD=1.6%)。结果表明,该法重复性良好。
  2.7回收率试验
  取参南星口服液(含量为0.2816mg•支-1,批号:090601,)10支的内容物,混匀,精密量取10ml置分液漏斗中,共6份,分别精密加入2ml人参皂苷Rg1对照品溶液(0.1406mg•ml-1), 再分别加入20ml乙醚,按上述供试品溶液的制备方法及含量测定项下的方法制备并测定,结果如表1所示。
  
  表1回收率试验结果(n=6)
  取样量(ml) 样品含人参皂苷Rg1量
  (mg) 对照品加入量
  (mg) 测得人参皂苷Rg1量(mg) 回收率
  (%) 平均回收率
  (%) RSD(%)
  10.00
  10.00
  10.00
  10.00
  10.00
  10.00 0.2816
  0.2816
  0.2816
  0.2816
  0.2816
  0.2816 0.2812
  0.2812
  0.2812
  0.2812
  0.2812
  0.2812 0.5621
  0.5576
  0.5668
  0.5602
  0.5567
  0.5596 99.75
  98.15
  101.42
  99.08
  97.83
  98.86
  
  99.2
  
  1.4
  
  2.8样品含量测定
  取供试品溶液分别注入高效液相色谱仪,记录峰面积。代入线性方程中,计算,测定3批样品。结果如表2所示。
  表2 样品含量测定结果 (n=3)
  批号 含量(mg•支-1)
  090501
  090601
  090801 0.3003
  0.2816
  0.3162
  3讨论
  本方中,红参为方中君药,主要含人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1等多种皂苷类成分。其中,人参皂苷Rg1含量较高,故以人参皂苷Rg1为观察指标进行定量测定。
  其次,在流动相的选择上,原标准中色谱条件为乙腈:0.05%磷酸=99:100,结果峰形差,出峰时间晚且各色谱峰分离差,难以准确进行定量,改为乙腈:0.4%磷酸=20:80,改变了流动相的极性,提高了对各组分的选择性,结果峰形好,出峰时间适当且各色谱峰分离好,可有效、準确地对人参皂苷Rg1进行定量。同时采用该色谱条件乙腈:0.4%磷酸=20:80以GeminiC18柱进行实验,亦获得了良好的峰形、分离度和适当的保留时间。
  在供试品溶液的制备过程中,直接采用乙醚萃取,因本品中含有较多的糖分,乳化现象异常严重,不利于萃取,加入氯化钠2g溶解后,再采用乙醚萃取,很好地解决了乳化严重的问题,萃取快速、完全。
  另外,该药品的成份复杂。采用乙醚萃取,弃去乙醚液,目的是去除脂溶性杂质的干扰,再用水饱和正丁醇萃取,可有效地提取指标成分人参皂苷Rg1,以氨试液洗涤正丁醇层,可以有效地去除一些酸性水溶性杂质的干扰,以利于最大限度地提取和纯化样品溶液,有益于HPLC的定量测定。
  
  
  参考文献
  [1] 王隶书,程东岩,李阳.心宁口服液中人参皂苷Rg1的HPLC测定 [J]. 中国药师,2005, 8(1):23-25.
  [2] 姜文红,张清波,HPLC测定乳癖消颗粒中人参皂苷Rg1的含量[J]. 中国药品标准,2006,7(4): 37-38.
  [3] 胡齐堂,周向阳. HPLC测定跌打红药片中人参皂苷Rg1的含量[J].药物分析杂志, 2008,28(11): 1924-1925.
  [4] 李亚荣,付凌燕. HPLC法测定红药片中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的含量 [J]. 中国药师,2007, 10(5):463-464.
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