论文部分内容阅读
摘要：综述了贝母甲素含量测定方法的研究进展，包括紫外一可见分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法、超高效液相色谱法、高效液相色谱一差热联用技术等，为贝母甲素的含量测定提供参考。
关键词：贝母甲素；含量测定；研究进展
O引言
贝母甲素来源于百合科植物川贝母和浙贝母的干燥鳞茎。贝母甲素是一种生物碱，白色针状晶体，可溶于有机溶剂，不溶于水、石油乙醚。贝母甲素有清热润肺、止咳化痰功效，用于治疗痰热咳嗽，心肺郁积，咳嗽及气管炎。目前贝母甲素含量测定方法很多，如分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法等。本文对其含量测定方法研究进展进行综述。
1 紫外一一可见分光光度法
紫外——可见分光光度法是根据物质分子对波长为200～760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。操作简单、准确度高、重现性好。邝翠仪等人发现贝母甲素在2368～11.84μg/ml范围内线性关系良好，贝母甲素平均回收率测定为97.7%，RSD=4.2%。尹尚军等采用超声波辅助提取法分离浙贝母生物碱，并用分光光度法测定其含量。结果表明，吸光度值与贝母素甲质量浓度呈良好的线性关系，不同产地对浙贝母生物碱含量的影响较大，而且不同组织部位的含量不尽相同。
2 薄层扫描法（TLC）
薄层扫描法检测的灵敏度、结果的精密度与准确度均良好。与高效液相色谱法相比，具有多通道效应，可同时平行分离分析多个样品；流动相用量少且选择范围宽、更换方便；固定相为一次性使用，对样品的预处理要求不高等优点。在中药制剂检验中，已成为重要的常用分析方法之一。《中国药典》中有33个中成药品种采用该法进行含量测定。
薄层扫描法的薄层板多采用硅胶G，展开剂多采用氯仿一甲醇一水（65：35：10），显色剂一般为10%硫酸乙醇。宋红湘等用薄层扫描仪对妇康消肿丸中贝母素甲进行了含量测定。其中做层析分析时，贝母素甲在502 nm处有最大吸收；扫描结果表明在0.41-2.05μg之间；积分值与点样量间线性关系良好。经加样回收试验和精密度试验表明测定结果可行。同时侯文峰等建议复方制剂成分复杂，可按干燥计算；薄层板展开时尽量在低温下展开，温度控制在60%-70%左右，分离效果较好。
3 高效液相色谱法（HPLC）
高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，具有高压高效高灵敏度，应用范围广等优点，在中药含量测定中应用广泛。
3.1 UV检测器
紫外线检测器（UV）原理是Lamber-Beer定律，即当一束单色光透过流动池时，若流动相不吸收光，则吸收度A与吸光组分浓度C和流动池光径长度成正比。UV检测器优点是选择性高、灵敏性好。广泛适用于有机分子具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力的物质检测。
一般当物质在200-400nm有紫外吸收。吴晓民测不同产地平贝母中贝母甲素含量采用Kro-masil ODS C18（4.6mmx250mm，5μm）色谱柱，流动相为甲醇一水（69：31），体积流量为0.5mL.min-l；柱温为27°C；检测波长为208nm，贝母甲素在0.515 -3.09μg与峰面积线性关系良好（r=0.9997），平均加样回收率为98.54%，RSD为2.12%（n=5）。本方法灵敏度高，而且简便、准确、重现性好内，可用于平贝母的内在质量控制。
3.2 ELSD检测器
蒸发散射检测器（EISD）原理适用于所有待测物的挥发性低于流动相的分离。现在ELSD越来越多的作为通用性检测器。它最大的优点在于检测不含发色团化合物。如碳水化合物、脂类等。并在没有标准品和化合物结构参数未知的情况下检测未知化合物。ELSD广泛应用于皂苷类成分、萜类成分及生物碱成分分析。
贝母甲素通常采用Lichrospher C18，柱温一般不超过40℃，流动相为乙腈一水或甲醇一水，流速一般不超过ImL/min。赵琰玲等人采用高效液相色谱ELSD法测定参贝止咳片中的贝母素甲含量。选用色谱柱（250mmx4.6mm，Spm），柱温30度，流动相为乙腈-0.05%-乙胺溶液（70：30），流速为l.Oml/min，载气（氮气）流速2.5L/min，漂移管温度70度。贝母素甲进样量对数与峰面积对数具有良好的线性关系。该方法可靠准确、重复性好可用于制剂含量测定及质量控制。姜艳等人采用高效液相色谱ELSD法测定浙贝母中贝母素甲含量。采用色谱柱Agilent Hypersil BDS-C18（4.Omm×250mm，5μm），流动相为乙腈一水一二乙胺（70：30：0.03），流速0.8ml/min，漂移管温度85度，载气流速2.2L/min。贝母素甲线性范围47.02～1003mg/L，平均回收率分别102.7%，RSD分别为2.1%（n=6）。此法简便快捷，结果可靠，可用于浙贝母质量评价。
3.3 MS检测器
质谱法（MS）利用电磁学原理，对荷电分子或亚分子裂片依其质量和电荷的比值进行分离和分析的方法。质谱法优点分析速度快、灵敏度高、高分辨率。质谱法广泛应用于各个学科领域中通过制备、分离、检测气相离子来鉴定化合物的一种专门技术。质谱法具有高特异性和高敏感度且得到广泛应用的普适用法。
质谱法多采用C18色谱柱。柱温为室温，流动相为乙腈一水，流速不超过IMUmin。张杰雯等人[7]应用高效液相色谱一质谱联用对贝母生物碱中贝母甲素进行检测。贝母用氨水浸润后，以乙醚一氯仿一乙醇f25：8：2.5）超声提取。将提取物直接进样到电喷雾离子阱质谱检测器进行检测。质谱采用电喷雾正离子模式（ESI+），扫描范围为m/z 210～800，贝母甲素的选择性检测离子分别为m/z 432。采用色谱柱为SphrigelC18（200mm×4.6mm，Sμm），流动相为乙腈-lOmmol.L-1甲酸铵（pH=8.0，0.03%三乙胺），梯度洗脱（0～6min：乙腈300-/0一45%；6- 22min：乙腈45%；22 - 30min：乙腈450%→95%；30～34mni：乙腈30%），流速ImL.min-1，柱温25℃。川贝母与浙贝母总生物碱提取液的一级质谱图显示，其主要分子离子峰基本相同，相对丰度有较大差异。相关系数均大于0.999，方法回收率均大于97%，日内、日间精密度（RsD）分别小于1.3%和2.8%（n=5）。本方法灵敏度高，专属性强，简便快捷，线性关系良好，适用于贝母中无紫外吸收的异街体生物碱的检测与分析。俞滢等人利用HPLC-MS测定癃闭康泰片中贝母甲素含量。癃闭康泰片经碱化，用氯仿一甲醇（4：1）提取生物碱有效部位，提取液浓缩，残渣用甲醇溶解后，进行高效液相色谱一质谱测定。色谱柱为AgilentZorbax extend C18（2.1 mmxl00 mm，Sμm），流动相为乙腈和10 mmol.L-1甲酸铵（pH 8.0），梯度洗脱（0～15 min：乙腈30%～55%；15～25min：乙腈55%），流速0.2mL.min-l，柱温30℃。质谱条件为电喷雾电离源（ESI），以选择性正离子方式检测，贝母素甲的选择性检测离子分别为m/z 432.4。贝母素甲的线性范围均为0.01～10 mg.1-l，相关系数均大于0.999，检测限均为0.45μg- 1-1，方法回收率均大于95%，日内日间精密度（RSD）均小于5%。本方法专属性强，灵敏度高，线性关系良好，操作简便，适用于癃闭康泰中贝母素甲含量测定。
4 其他方法
4.1 高效液相色谱一差热联用技术（HPLC-DTA）
高效液相色谱一差热联用技术，方法简便，快速，结果准确，可用于中药的质量标准研究及质量检验。程存归等用高效液相色谱法和差热分析法，来进行不同品种及不同加工法的浙贝母质量分析。差热分析时，不同的升温速率对差热图谱峰形有影响。
4.2超高效液相色谱法（UPLC）
超高效液相色谱借助HPLC的理论及原理，是分离科学的一个全新类别。超高效液相色谱作为一个新兴领域，目前已经开始投入液相实验中。董林毅采用Water Acquit BEH C18色谱柱（2.lmmlOOxmm，1.7μm），流动相为乙腈一甲酸一水体系梯度洗脱，流速为0.4ml/min，PDA检测190-400nm扫描；进样量为2.Oμl。6种成分在一定范围内均呈现良好线性。γ均大于0.996，精密度、重复性和稳定性良好。该方法简单、准确、快速、重复性好。
5 结论
贝母甲素含量的测定研究很多，液相色谱法重复性好，可用于含贝母甲素的制剂的含量测定及质量控制；随后是高效液相色谱的普及使用，专属性强，线性关系良好，操作简便；其中蒸发光散射器灵敏度高，所受干扰因素少，现在多用此法来评价贝母甲素的质量。随着色谱技术不断创新，在高效液相色谱的基础上涌现出超高效液相色谱和高分离度快速液相色谱，大大提高了分析速率，缩短了分析时间，开始逐渐应用于贝母甲素的含量测定。
关键词：贝母甲素；含量测定；研究进展
O引言
贝母甲素来源于百合科植物川贝母和浙贝母的干燥鳞茎。贝母甲素是一种生物碱，白色针状晶体，可溶于有机溶剂，不溶于水、石油乙醚。贝母甲素有清热润肺、止咳化痰功效，用于治疗痰热咳嗽，心肺郁积，咳嗽及气管炎。目前贝母甲素含量测定方法很多，如分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法等。本文对其含量测定方法研究进展进行综述。
1 紫外一一可见分光光度法
紫外——可见分光光度法是根据物质分子对波长为200～760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。操作简单、准确度高、重现性好。邝翠仪等人发现贝母甲素在2368～11.84μg/ml范围内线性关系良好，贝母甲素平均回收率测定为97.7%，RSD=4.2%。尹尚军等采用超声波辅助提取法分离浙贝母生物碱，并用分光光度法测定其含量。结果表明，吸光度值与贝母素甲质量浓度呈良好的线性关系，不同产地对浙贝母生物碱含量的影响较大，而且不同组织部位的含量不尽相同。
2 薄层扫描法（TLC）
薄层扫描法检测的灵敏度、结果的精密度与准确度均良好。与高效液相色谱法相比，具有多通道效应，可同时平行分离分析多个样品；流动相用量少且选择范围宽、更换方便；固定相为一次性使用，对样品的预处理要求不高等优点。在中药制剂检验中，已成为重要的常用分析方法之一。《中国药典》中有33个中成药品种采用该法进行含量测定。
薄层扫描法的薄层板多采用硅胶G，展开剂多采用氯仿一甲醇一水（65：35：10），显色剂一般为10%硫酸乙醇。宋红湘等用薄层扫描仪对妇康消肿丸中贝母素甲进行了含量测定。其中做层析分析时，贝母素甲在502 nm处有最大吸收；扫描结果表明在0.41-2.05μg之间；积分值与点样量间线性关系良好。经加样回收试验和精密度试验表明测定结果可行。同时侯文峰等建议复方制剂成分复杂，可按干燥计算；薄层板展开时尽量在低温下展开，温度控制在60%-70%左右，分离效果较好。
3 高效液相色谱法（HPLC）
高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，具有高压高效高灵敏度，应用范围广等优点，在中药含量测定中应用广泛。
3.1 UV检测器
紫外线检测器（UV）原理是Lamber-Beer定律，即当一束单色光透过流动池时，若流动相不吸收光，则吸收度A与吸光组分浓度C和流动池光径长度成正比。UV检测器优点是选择性高、灵敏性好。广泛适用于有机分子具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力的物质检测。
一般当物质在200-400nm有紫外吸收。吴晓民测不同产地平贝母中贝母甲素含量采用Kro-masil ODS C18（4.6mmx250mm，5μm）色谱柱，流动相为甲醇一水（69：31），体积流量为0.5mL.min-l；柱温为27°C；检测波长为208nm，贝母甲素在0.515 -3.09μg与峰面积线性关系良好（r=0.9997），平均加样回收率为98.54%，RSD为2.12%（n=5）。本方法灵敏度高，而且简便、准确、重现性好内，可用于平贝母的内在质量控制。
3.2 ELSD检测器
蒸发散射检测器（EISD）原理适用于所有待测物的挥发性低于流动相的分离。现在ELSD越来越多的作为通用性检测器。它最大的优点在于检测不含发色团化合物。如碳水化合物、脂类等。并在没有标准品和化合物结构参数未知的情况下检测未知化合物。ELSD广泛应用于皂苷类成分、萜类成分及生物碱成分分析。
贝母甲素通常采用Lichrospher C18，柱温一般不超过40℃，流动相为乙腈一水或甲醇一水，流速一般不超过ImL/min。赵琰玲等人采用高效液相色谱ELSD法测定参贝止咳片中的贝母素甲含量。选用色谱柱（250mmx4.6mm，Spm），柱温30度，流动相为乙腈-0.05%-乙胺溶液（70：30），流速为l.Oml/min，载气（氮气）流速2.5L/min，漂移管温度70度。贝母素甲进样量对数与峰面积对数具有良好的线性关系。该方法可靠准确、重复性好可用于制剂含量测定及质量控制。姜艳等人采用高效液相色谱ELSD法测定浙贝母中贝母素甲含量。采用色谱柱Agilent Hypersil BDS-C18（4.Omm×250mm，5μm），流动相为乙腈一水一二乙胺（70：30：0.03），流速0.8ml/min，漂移管温度85度，载气流速2.2L/min。贝母素甲线性范围47.02～1003mg/L，平均回收率分别102.7%，RSD分别为2.1%（n=6）。此法简便快捷，结果可靠，可用于浙贝母质量评价。
3.3 MS检测器
质谱法（MS）利用电磁学原理，对荷电分子或亚分子裂片依其质量和电荷的比值进行分离和分析的方法。质谱法优点分析速度快、灵敏度高、高分辨率。质谱法广泛应用于各个学科领域中通过制备、分离、检测气相离子来鉴定化合物的一种专门技术。质谱法具有高特异性和高敏感度且得到广泛应用的普适用法。
质谱法多采用C18色谱柱。柱温为室温，流动相为乙腈一水，流速不超过IMUmin。张杰雯等人[7]应用高效液相色谱一质谱联用对贝母生物碱中贝母甲素进行检测。贝母用氨水浸润后，以乙醚一氯仿一乙醇f25：8：2.5）超声提取。将提取物直接进样到电喷雾离子阱质谱检测器进行检测。质谱采用电喷雾正离子模式（ESI+），扫描范围为m/z 210～800，贝母甲素的选择性检测离子分别为m/z 432。采用色谱柱为SphrigelC18（200mm×4.6mm，Sμm），流动相为乙腈-lOmmol.L-1甲酸铵（pH=8.0，0.03%三乙胺），梯度洗脱（0～6min：乙腈300-/0一45%；6- 22min：乙腈45%；22 - 30min：乙腈450%→95%；30～34mni：乙腈30%），流速ImL.min-1，柱温25℃。川贝母与浙贝母总生物碱提取液的一级质谱图显示，其主要分子离子峰基本相同，相对丰度有较大差异。相关系数均大于0.999，方法回收率均大于97%，日内、日间精密度（RsD）分别小于1.3%和2.8%（n=5）。本方法灵敏度高，专属性强，简便快捷，线性关系良好，适用于贝母中无紫外吸收的异街体生物碱的检测与分析。俞滢等人利用HPLC-MS测定癃闭康泰片中贝母甲素含量。癃闭康泰片经碱化，用氯仿一甲醇（4：1）提取生物碱有效部位，提取液浓缩，残渣用甲醇溶解后，进行高效液相色谱一质谱测定。色谱柱为AgilentZorbax extend C18（2.1 mmxl00 mm，Sμm），流动相为乙腈和10 mmol.L-1甲酸铵（pH 8.0），梯度洗脱（0～15 min：乙腈30%～55%；15～25min：乙腈55%），流速0.2mL.min-l，柱温30℃。质谱条件为电喷雾电离源（ESI），以选择性正离子方式检测，贝母素甲的选择性检测离子分别为m/z 432.4。贝母素甲的线性范围均为0.01～10 mg.1-l，相关系数均大于0.999，检测限均为0.45μg- 1-1，方法回收率均大于95%，日内日间精密度（RSD）均小于5%。本方法专属性强，灵敏度高，线性关系良好，操作简便，适用于癃闭康泰中贝母素甲含量测定。
4 其他方法
4.1 高效液相色谱一差热联用技术（HPLC-DTA）
高效液相色谱一差热联用技术，方法简便，快速，结果准确，可用于中药的质量标准研究及质量检验。程存归等用高效液相色谱法和差热分析法，来进行不同品种及不同加工法的浙贝母质量分析。差热分析时，不同的升温速率对差热图谱峰形有影响。
4.2超高效液相色谱法（UPLC）
超高效液相色谱借助HPLC的理论及原理，是分离科学的一个全新类别。超高效液相色谱作为一个新兴领域，目前已经开始投入液相实验中。董林毅采用Water Acquit BEH C18色谱柱（2.lmmlOOxmm，1.7μm），流动相为乙腈一甲酸一水体系梯度洗脱，流速为0.4ml/min，PDA检测190-400nm扫描；进样量为2.Oμl。6种成分在一定范围内均呈现良好线性。γ均大于0.996，精密度、重复性和稳定性良好。该方法简单、准确、快速、重复性好。
5 结论
贝母甲素含量的测定研究很多，液相色谱法重复性好，可用于含贝母甲素的制剂的含量测定及质量控制；随后是高效液相色谱的普及使用，专属性强，线性关系良好，操作简便；其中蒸发光散射器灵敏度高，所受干扰因素少，现在多用此法来评价贝母甲素的质量。随着色谱技术不断创新，在高效液相色谱的基础上涌现出超高效液相色谱和高分离度快速液相色谱，大大提高了分析速率，缩短了分析时间，开始逐渐应用于贝母甲素的含量测定。