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摘要 ：研究煙粉虱传播番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus （ToCV）的发生规律，建立其预测预报模型，能够指导田间早期有效防治。本研究于2014年-2018年每年采集山东寿光蔬菜基地大棚番茄和杂草的植株叶片，并收集植株上携带的所有烟粉虱，以健康番茄、杂草叶片和室内饲养的健康烟粉虱为阴性对照;实验室ToCV侵染性克隆接种的感病叶片以及从感病叶片上获毒的烟粉虱为阳性对照，将采集的样品带回实验室进行检测和鉴定等试验。根据病情发生规律，建立了番茄褪绿病毒病的预测预报模型，模拟所得方程为：Y=2.570 0.089X4-7.548X7，其中Y为11月份番茄褪绿病毒病发生率，X4为采集的样品上平均每株所携带的烟粉虱数量，X7为采集的田间杂草的带毒率。预测模拟结果显示，烟粉虱数量以及杂草的带毒率与番茄褪绿病毒病的发生率极显著正相关，回归检测结果历史符合率为96.8%以上。明确了影响番茄褪绿病毒病发生的影响因子，基于烟粉虱数量以及杂草的带毒率，构建了病害预测预报模型。研究结果有助于及时发现番茄褪绿病毒病并采取相应预防措施。
关键词 ：番茄褪绿病毒; 烟粉虱; 发展规律; 预测预报模型
中图分类号：
S 436.412.11
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2020029
Establishment of the prediction model for tomato chlorosis virus disease
LU Dingyihui1，2， ZHANG Zhanhong3， ZHANG Zhuo2， ZHANG Deyong2， TAN Xinqiu2， ZHENG Limin2， GAO Yang2， SHI Xiaobin1，2*， LIU Yong2*
（1. Longping Branch， Graduate School of Hunan University， Changsha 410125， China; 2. Institute of Plant Protection， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， China; 3. Vegetable Research Institute， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， China）
Abstract
The occurrence and development of Tomato chlorosis virus （ToCV） transmitted by Bemisia tabaci were investigated by establishing disease prediction models to provide a reference for effective control of ToCV causing disease in the field. The plant leaves of greenhouse tomatoes and weeds were collected in the Shouguang Vegetable Base in Shandong province every year from 2014 to 2018， and all B.tabaci individuals feeding on the plants were collected. Healthy tomatoes， weed leaves and healthy B.tabaci raised indoors were used as negative controls. Leaves inoculated with ToCV in the laboratory and viruliferous B.tabaci on infected leaves were used as positive controls. The collected samples were taken back to the laboratory for ToCV testing and identification. According to the development of ToCV disease， we established the disease prediction model： Y=2.570 0.089X4-7.548X7， in which Y is the incidence of tomato chlorosis virus disease in November; X4is the average number of B.tabaci carried by each sample， and X7is the viruliferous rate of weeds collected in the field. The results revealed that the incidence of the disease showed significantly positive correlation with the population of B.tabaci and the infection rate of weeds. The compliance rate of this prediction model was above 96.8%， suggesting that it can provide an important basis for predicting diseases in time and take preventive measures. Key words
Tomato chlorosis virus; Bemisia tabaci; occurrence and development trend; prediction model
番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus （ToCV）属于长线性病毒科Closteroviridae，毛形病毒属Crinivirus，是我国新报道的对番茄、辣椒等茄科蔬菜造成毁灭性危害的RNA病毒[1]。植株感染ToCV后下部老叶首先出现症状，叶脉保持绿色，但叶片脉间褪绿黄化，叶片变厚卷曲容易折断;随后植株病变部位由下向上蔓延，叶片由叶缘向内逐渐干枯坏死;最终整个植株变黄，迅速衰老，果实生长发育也受到限制，从而使果实的销售价值受到严重影响[2]。为了预防番茄褪绿病毒的传播，减少病毒病造成的损失，找到影响发病的关键因素，构建其预测预报模型迫在眉睫。
番茄褪绿病毒不能通过汁液摩擦传播[3]，只能依靠介体昆虫传播，主要媒介昆虫是烟粉虱Bemisia tabaci、温室白粉虱Trialeurodes vaporariorum和纹翅粉虱T.abutilonea[4]，我国ToCV的介体昆虫主要是烟粉虱。番茄褪绿病毒病最早在我国台湾报道后，相继在山东、山西、江苏和北京等多地发现[4]。Wintermantel等报道了番茄褪绿病毒的发生特点及其危害[1];郑慧新等调查发现番茄褪绿病毒病已在我国很多地区快速扩散[4];代惠洁等研究了山东寿光地区Q型烟粉虱传播番茄褪绿病毒的特点，发现二者的发生存在紧密联系[5];Shi等比较了Q型与B型烟粉虱获取、保留和传播ToCV的能力，发现在我国ToCV的发生与Q型烟粉虱较强的传毒能力密切相关[6];魏可可等报道了番茄褪绿病毒常用的鉴别方法[7]。目前研究多集中在发生规律以及流行原因的调查，缺乏田间预测该病毒病发生的预测预报模型。
2014年我们在山东寿光调查发现，蔬菜基地的许多大棚番茄以及田间杂草表现出叶脉间褪绿、叶片黄化等症状，同时众多叶片背面聚集了大量烟粉虱，因而开展了烟粉虱传播番茄褪绿病毒病的发生规律的研究。通过总结2014年-2018年山东寿光地区番茄褪绿病毒病的发生情况，并结合当地气象资料、烟粉虱的种类和带毒情况以及杂草种类和带毒情况，对烟粉虱传播番茄褪绿病毒病的发生发展规律进行了分析并建立了预测预报模型。根据建立的预测模型，可以明确影响番茄褪绿病毒病发生的
主要因素，从而采取有效措施及时进行预防和控制，有效降低番茄褪绿病毒病的发生。
1 材料与方法
1.1 样品采集
2014年-2018年，每年的11月份在寿光的大棚中调查番茄褪绿病毒病的发生率，并且用小型气象记录仪自动记录11月份每天的光照时间、温度和湿度。在调查的大棚中随机选取20行，每行采集1株番茄，共采集20株，采集时先用吸虫管吸取番茄上所有的烟粉虱，将每株番茄上收集的烟粉虱装到一个离心管中，同时统计所有杂草种类数，并从每行番茄附近的杂草中随机选择1株，共20株，采集其地上部分叶片，将采集的样品置于液氮中速冻后单株保存于-80℃冰箱保存备用，用于后续提取其基因组（DNA或RNA）等试验，以健康番茄和田边地间杂草叶片为阴性对照;实验室ToCV侵染性克隆接种的感病叶片为阳性对照[8]。
1.2 植物总RNA的提取
采用北京华越洋生物公司多酚多糖植物RNA提取试剂盒提取大棚番茄和杂草样品的总RNA[910]，具体步骤按照RNA提取试剂盒说明书。
1.3 烟粉虱总RNA的提取
采用TRIzol法来提取烟粉虱样品总RNA[1113]。
1.4 cDNA的合成
以提取的总RNA为模板进行反转录。反转录反应的体系及步骤参照Vazyme生物公司Hiscript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit产品说明书。
1.5 RT-PCR和电泳检测
采用ToCV特异性引物ToCV-3F/ToCV-3R（表1）对样品进行PCR扩增[1415]。PCR扩增体系为： RNase-free ddH2O 7 μL、2×Taq Master Mix 10 μL、10 μmol/L ToCV-3F/ToCV-3R 各1 μL、cDNA模板1 μL。PCR程序为：95℃ 5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环;72℃延伸10 min，4℃保存。电泳检测后，产物纯化回收送生工生物工程（上海）股份有限公司测序分析。
1.6 烟粉虱数量及带毒率检测
以株为单位统计1.1采集的20株番茄植株上所有烟粉虱数量，并计算平均每株番茄上烟粉虱数量。从每株番茄植株上采集到的烟粉虱中随机选取20头，番茄植株上不足20头的按照实际数量进行统计和计算。采用ToCV特异性引物ToCV-3F/ToCV-3R对每头烟粉虱进行ToCV检测，其中每株上采集20头烟粉虱的带毒率作为1个重复，共进行20次重复，统计20株番茄上所携带的烟粉虱的带毒率，取平均值得到最终烟粉虱带毒率。
每株番茄上的烟粉虱带毒率=携带ToCV的烟粉虱数/检测烟粉虱数×100%。
1.7 烟粉虱种群的鉴定
从每株番茄植株上采集的烟粉虱样品中随机取1头，20株番茄植株共取20头对其mt COⅠ基因进行检测，重复3次[18]。取3 μL蛋白酶K于封口膜上，每头烟粉虱置于膜上研磨成匀浆后移至PCR管，加入10 mg/mL的树脂溶液20 μL混匀，然后置于37℃孵育1 h，96℃ 10 min。PCR体系为20 μL，即RNase-free ddH2O 7 μL、2×Taq Master Mix 10 μL、10 μmol/L上、下游引物WT-F/WT-R（表1）各1 μL，cDNA模板1 μL。PCR程序：95℃ 5 min;95℃ 15 s，53℃ 45 s，72℃ 1 min，35個循环;72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物取5 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。 随后取PCR产物进行酶切。酶切体系：10 μL扩增产物，0.5 μL AseⅠ、2 μL 3.1×Buffer、7.5 μL RNase-free ddH2O，混匀后置于37℃ 3～4 h。取5 μL酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。mt COⅠ PCR产物经酶切后， Q型烟粉虱电泳显示约500 bp和100 bp两条带， 而B型烟粉虱在500～750 bp间仅有1条带[17]。
1.8 田间杂草种类及其带毒率
首先统计番茄附近所有杂草的种类，然后利用ToCV特异性引物ToCV-3F/ToCV-3R对随机选取的20株杂草进行鉴定。每株杂草取上、中、下部位的3片叶分别进行检测，共检测大约60片叶，若上、中、下部位中有1处被检测出带毒，即为该杂草带毒，最后统计杂草的带毒率。计算公式：杂草带毒率=携带ToCV的杂草数/检测杂草数×100%。
1.9 回归方程的建立
相关性分析：利用2014年-2018年山东寿光11月份番茄褪绿病毒病发生率与各自变量因子在SPSS 21.0中进行相关显著性分析[19]。
逐步回归分析：利用相关性分析结果在SPSS 21.0中进行回归分析[1921]。
1.10 方程的拟合性分析
利用SPSS 21.0分析软件输出的回归方程对2014年-2018年与番茄褪绿病毒病发病率相关的因素：11月份平均每日光照时间，11月份平均温度，11月份平均相对湿度，每株采集的样品上所携带的平均烟粉虱数量，采集的样品上所携带的烟粉虱的带毒率，采集的田间杂草的种类，采集的田间杂草的带毒率进行拟合性检验，并对历史符合率进行分析[2223]。
2 结果与分析
2.1 大棚番茄ToCV的发病率
通过观察发现，大多数大棚番茄在苗期、花期、结果期均可被ToCV感染（图1）。不同年份番茄均存在较高的发病率（表2）。对田间采摘的大棚番茄样品进行RT-PCR检测，验证了ToCV的侵染。
2.2 烟粉虱数量及带毒率检测
统计发现，2014年-2018年大棚番茄所携带的烟粉虱平均每株数量在18～59头（表3）。每年从采集的样品中随机选取20头进行RT-PCR检测，发现烟粉虱均存在较高的带毒率（65%～95%）（表3）。可以看出，随着烟粉虱数量的增加，烟粉虱带毒率也随之升高。
2.3 烟粉虱种类鉴定
对大棚番茄上采集的烟粉虱进行种类鉴定，提取单头烟粉虱总DNA进行PCR扩增，PCR产物经AseⅠ酶切后，进行电泳检测，得到500 bp和100 bp的两条带，结果表明该地区的烟粉虱均为Q型烟粉虱（图2）。
2.4 田间杂草种类及其带毒率
2014年-2018年每年采集的杂草种类及其带毒率各有不同。可以看出，随着杂草种类的增加，杂草带毒率呈上升趋势（表4）。
2.5 番茄褪绿病毒病预测预报模型的建立
通过总结番茄褪绿病毒病发病率相关资料发现，2014年-2018年，与番茄褪绿病毒病发病率相关的因素可能有：11月份平均每日光照时间、11月份平均温度、11月份平均相对湿度、每株番茄平均烟粉虱数量及其带毒率、田间杂草种类以及带毒率（表5）。
利用2014年-2018年山东寿光11月份番茄褪绿病毒病发生率与各自变量因子在SPSS 21.0中进行相关显著性分析，获得了2个与11月份番茄褪绿病毒病发生率在0.01水平上极显著因子，X4：平均每株烟粉虱数量（头）;X7：田间杂草的带毒率（%）。获取了2个与11月份番茄褪绿病毒病发生率在0.05水平上显著因子，X5：烟粉虱的带毒率;X6：田间杂草的种类数。
利用相关性分析结果进行回归分析，将Y（ToCV发生率）添加到因变量列表，将X4（平均每株烟粉虱数量）、X5（烟粉虱带毒率）、X6（杂草种类数）和X7（杂草带毒率）添加到自变量列表，输出模型汇总表、方差分析表和回归系数表。
由回归系数表可得到回归方程：Y=2.570 0.089X4-7.548X7（R2=0.998）。
2.6 番茄褪绿病毒病预测预报模型的准确度
对相关数据进行拟合性检验，发现回归检测结果历史符合率均在96.8%以上，因而可以作为番茄褪绿病毒病发生程度的预测预报模型（表6）。
1） Y： 11月份番茄褪绿病毒病发生率; X1： 11月份平均每日光照时间; X2： 11月份平均温度; X3： 11月份平均相对湿度; X4： 平均每株番茄上携带的烟粉虱数量; X5： 采集樣品上烟粉虱的带毒率; X6： 采集的田间杂草的种类数; X7： 采集的田间杂草的带毒率。
Y： The incidence of tomato chlorosis virus disease in November; X1： The average daily light time in November; X2： Mean temperature in November; X3： The average relative humidity in November; X4： The average number of Bemisia tabaci carried by each sample; X5： The virus-carrying rate of B.tabaci on the collected samples; X6： The species of weeds collected in the field; X7： The viruliferous rates of weeds collected in the field.
3 讨论 3.1 田间发病规律
关于番茄褪绿病毒病的田间发病规律已有较多的研究[2428]。李娇娇等发现Q型烟粉虱及ToCV的多发季节在秋季，并指出11月上旬之后，日光温室平均温度一般低于20℃，已不利于烟粉虱的繁育与传播，因而病害发生相对较轻[26]。本研究调查发现试验基地的大棚番茄于7月底或者8月初种植，这段时间温度高，空气相对湿度低，有利于番茄幼苗的生长，但同时容易滋生烟粉虱。而在温室中极易存在携带ToCV的烟粉虱，温室外存在携带ToCV的杂草，进而造成了番茄褪绿病毒的传播。ToCV的侵染存在潜伏期，病毒侵染初期植株并没有表现症状，而到11月份，大棚番茄进入发病的高峰期。
3.2 番茄褪绿病毒病发生率与烟粉虱数量的关系
运用SPSS 21.0对各因素进行相关性分析发现，ToCV的发生率与烟粉虱数量呈极显著正相关。此外，调查发现，大棚中的煙粉虱均为Q型，且每株番茄上的烟粉虱均携带病毒。预测预报模型也表明番茄褪绿病毒病的发生率与采集的每株植株上所携带的平均烟粉虱数量在0.01的水平上极显著相关。此结论与李娇娇等[28]的结论有出入，而与代惠洁等[25]报道的结论相似，这可能与地域等自然环境引起的差异有关。因此应在种植早期重视对烟粉虱的防治，从而减轻ToCV的发生。
3.3 番茄褪绿病毒病发生率与杂草带毒率的关系
相关性分析发现，ToCV的发生率除了与烟粉虱数量极显著正相关外，还与田间杂草的带毒率在0.01的水平上极显著正相关。代惠洁等指出番茄定植前需彻底清除棚内及周边杂草，切断可能的毒源有利于番茄褪绿病毒的防控[27]。这与本研究所得结论一致，同时也验证了预测预报模型的准确性。结合预测结果可以发现，田间杂草能够携带并保存ToCV，在温室大棚中，在上一季番茄收获之后，病毒都在杂草中保存，随着烟粉虱的发生，再次侵染新一季的番茄，从而造成病害的循环发生。我们还发现杂草种类越多，ToCV的发生率越高，因此今后有必要调查清楚ToCV的杂草寄主，从而更有针对性地清除杂草，以降低ToCV的发生。
3.4 构建模型的意义
利用SPSS 21.0建立预测预报模型，模拟所得方程为：Y=2.570 0.089X4-7.548X7，其中Y为11月份番茄褪绿病毒病发生率，X4为采集的
番茄上平均每株携带的烟粉虱数量，X7为采集的田间杂草的带毒率，回归检测结果历史符合率为96.8%以上。通过构建烟粉虱传播番茄褪绿病毒病的预测预报模型，明确了番茄褪绿病毒发生过程中的重要影响因子，为预防番茄褪绿病毒病的发生提供了重要依据，有助于及时发现番茄褪绿病毒病并采取相应的预防措施，从而减少其造成的经济损失，实现番茄的高产提质优化。
烟粉虱传播的番茄褪绿病毒病的预测预报模型是在特定的时间、空间条件下采用一定的资料构建出来的模型，可能不具有普遍适用性。不同地区，不同气象因素和不同的生长条件也可能会影响ToCV的发生，还需要进行不断地探索。
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（责任编辑：杨明丽）
关键词 ：番茄褪绿病毒; 烟粉虱; 发展规律; 预测预报模型
中图分类号：
S 436.412.11
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2020029
Establishment of the prediction model for tomato chlorosis virus disease
LU Dingyihui1，2， ZHANG Zhanhong3， ZHANG Zhuo2， ZHANG Deyong2， TAN Xinqiu2， ZHENG Limin2， GAO Yang2， SHI Xiaobin1，2*， LIU Yong2*
（1. Longping Branch， Graduate School of Hunan University， Changsha 410125， China; 2. Institute of Plant Protection， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， China; 3. Vegetable Research Institute， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， China）
Abstract
The occurrence and development of Tomato chlorosis virus （ToCV） transmitted by Bemisia tabaci were investigated by establishing disease prediction models to provide a reference for effective control of ToCV causing disease in the field. The plant leaves of greenhouse tomatoes and weeds were collected in the Shouguang Vegetable Base in Shandong province every year from 2014 to 2018， and all B.tabaci individuals feeding on the plants were collected. Healthy tomatoes， weed leaves and healthy B.tabaci raised indoors were used as negative controls. Leaves inoculated with ToCV in the laboratory and viruliferous B.tabaci on infected leaves were used as positive controls. The collected samples were taken back to the laboratory for ToCV testing and identification. According to the development of ToCV disease， we established the disease prediction model： Y=2.570 0.089X4-7.548X7， in which Y is the incidence of tomato chlorosis virus disease in November; X4is the average number of B.tabaci carried by each sample， and X7is the viruliferous rate of weeds collected in the field. The results revealed that the incidence of the disease showed significantly positive correlation with the population of B.tabaci and the infection rate of weeds. The compliance rate of this prediction model was above 96.8%， suggesting that it can provide an important basis for predicting diseases in time and take preventive measures. Key words
Tomato chlorosis virus; Bemisia tabaci; occurrence and development trend; prediction model
番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus （ToCV）属于长线性病毒科Closteroviridae，毛形病毒属Crinivirus，是我国新报道的对番茄、辣椒等茄科蔬菜造成毁灭性危害的RNA病毒[1]。植株感染ToCV后下部老叶首先出现症状，叶脉保持绿色，但叶片脉间褪绿黄化，叶片变厚卷曲容易折断;随后植株病变部位由下向上蔓延，叶片由叶缘向内逐渐干枯坏死;最终整个植株变黄，迅速衰老，果实生长发育也受到限制，从而使果实的销售价值受到严重影响[2]。为了预防番茄褪绿病毒的传播，减少病毒病造成的损失，找到影响发病的关键因素，构建其预测预报模型迫在眉睫。
番茄褪绿病毒不能通过汁液摩擦传播[3]，只能依靠介体昆虫传播，主要媒介昆虫是烟粉虱Bemisia tabaci、温室白粉虱Trialeurodes vaporariorum和纹翅粉虱T.abutilonea[4]，我国ToCV的介体昆虫主要是烟粉虱。番茄褪绿病毒病最早在我国台湾报道后，相继在山东、山西、江苏和北京等多地发现[4]。Wintermantel等报道了番茄褪绿病毒的发生特点及其危害[1];郑慧新等调查发现番茄褪绿病毒病已在我国很多地区快速扩散[4];代惠洁等研究了山东寿光地区Q型烟粉虱传播番茄褪绿病毒的特点，发现二者的发生存在紧密联系[5];Shi等比较了Q型与B型烟粉虱获取、保留和传播ToCV的能力，发现在我国ToCV的发生与Q型烟粉虱较强的传毒能力密切相关[6];魏可可等报道了番茄褪绿病毒常用的鉴别方法[7]。目前研究多集中在发生规律以及流行原因的调查，缺乏田间预测该病毒病发生的预测预报模型。
2014年我们在山东寿光调查发现，蔬菜基地的许多大棚番茄以及田间杂草表现出叶脉间褪绿、叶片黄化等症状，同时众多叶片背面聚集了大量烟粉虱，因而开展了烟粉虱传播番茄褪绿病毒病的发生规律的研究。通过总结2014年-2018年山东寿光地区番茄褪绿病毒病的发生情况，并结合当地气象资料、烟粉虱的种类和带毒情况以及杂草种类和带毒情况，对烟粉虱传播番茄褪绿病毒病的发生发展规律进行了分析并建立了预测预报模型。根据建立的预测模型，可以明确影响番茄褪绿病毒病发生的
主要因素，从而采取有效措施及时进行预防和控制，有效降低番茄褪绿病毒病的发生。
1 材料与方法
1.1 样品采集
2014年-2018年，每年的11月份在寿光的大棚中调查番茄褪绿病毒病的发生率，并且用小型气象记录仪自动记录11月份每天的光照时间、温度和湿度。在调查的大棚中随机选取20行，每行采集1株番茄，共采集20株，采集时先用吸虫管吸取番茄上所有的烟粉虱，将每株番茄上收集的烟粉虱装到一个离心管中，同时统计所有杂草种类数，并从每行番茄附近的杂草中随机选择1株，共20株，采集其地上部分叶片，将采集的样品置于液氮中速冻后单株保存于-80℃冰箱保存备用，用于后续提取其基因组（DNA或RNA）等试验，以健康番茄和田边地间杂草叶片为阴性对照;实验室ToCV侵染性克隆接种的感病叶片为阳性对照[8]。
1.2 植物总RNA的提取
采用北京华越洋生物公司多酚多糖植物RNA提取试剂盒提取大棚番茄和杂草样品的总RNA[910]，具体步骤按照RNA提取试剂盒说明书。
1.3 烟粉虱总RNA的提取
采用TRIzol法来提取烟粉虱样品总RNA[1113]。
1.4 cDNA的合成
以提取的总RNA为模板进行反转录。反转录反应的体系及步骤参照Vazyme生物公司Hiscript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit产品说明书。
1.5 RT-PCR和电泳检测
采用ToCV特异性引物ToCV-3F/ToCV-3R（表1）对样品进行PCR扩增[1415]。PCR扩增体系为： RNase-free ddH2O 7 μL、2×Taq Master Mix 10 μL、10 μmol/L ToCV-3F/ToCV-3R 各1 μL、cDNA模板1 μL。PCR程序为：95℃ 5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环;72℃延伸10 min，4℃保存。电泳检测后，产物纯化回收送生工生物工程（上海）股份有限公司测序分析。
1.6 烟粉虱数量及带毒率检测
以株为单位统计1.1采集的20株番茄植株上所有烟粉虱数量，并计算平均每株番茄上烟粉虱数量。从每株番茄植株上采集到的烟粉虱中随机选取20头，番茄植株上不足20头的按照实际数量进行统计和计算。采用ToCV特异性引物ToCV-3F/ToCV-3R对每头烟粉虱进行ToCV检测，其中每株上采集20头烟粉虱的带毒率作为1个重复，共进行20次重复，统计20株番茄上所携带的烟粉虱的带毒率，取平均值得到最终烟粉虱带毒率。
每株番茄上的烟粉虱带毒率=携带ToCV的烟粉虱数/检测烟粉虱数×100%。
1.7 烟粉虱种群的鉴定
从每株番茄植株上采集的烟粉虱样品中随机取1头，20株番茄植株共取20头对其mt COⅠ基因进行检测，重复3次[18]。取3 μL蛋白酶K于封口膜上，每头烟粉虱置于膜上研磨成匀浆后移至PCR管，加入10 mg/mL的树脂溶液20 μL混匀，然后置于37℃孵育1 h，96℃ 10 min。PCR体系为20 μL，即RNase-free ddH2O 7 μL、2×Taq Master Mix 10 μL、10 μmol/L上、下游引物WT-F/WT-R（表1）各1 μL，cDNA模板1 μL。PCR程序：95℃ 5 min;95℃ 15 s，53℃ 45 s，72℃ 1 min，35個循环;72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物取5 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。 随后取PCR产物进行酶切。酶切体系：10 μL扩增产物，0.5 μL AseⅠ、2 μL 3.1×Buffer、7.5 μL RNase-free ddH2O，混匀后置于37℃ 3～4 h。取5 μL酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。mt COⅠ PCR产物经酶切后， Q型烟粉虱电泳显示约500 bp和100 bp两条带， 而B型烟粉虱在500～750 bp间仅有1条带[17]。
1.8 田间杂草种类及其带毒率
首先统计番茄附近所有杂草的种类，然后利用ToCV特异性引物ToCV-3F/ToCV-3R对随机选取的20株杂草进行鉴定。每株杂草取上、中、下部位的3片叶分别进行检测，共检测大约60片叶，若上、中、下部位中有1处被检测出带毒，即为该杂草带毒，最后统计杂草的带毒率。计算公式：杂草带毒率=携带ToCV的杂草数/检测杂草数×100%。
1.9 回归方程的建立
相关性分析：利用2014年-2018年山东寿光11月份番茄褪绿病毒病发生率与各自变量因子在SPSS 21.0中进行相关显著性分析[19]。
逐步回归分析：利用相关性分析结果在SPSS 21.0中进行回归分析[1921]。
1.10 方程的拟合性分析
利用SPSS 21.0分析软件输出的回归方程对2014年-2018年与番茄褪绿病毒病发病率相关的因素：11月份平均每日光照时间，11月份平均温度，11月份平均相对湿度，每株采集的样品上所携带的平均烟粉虱数量，采集的样品上所携带的烟粉虱的带毒率，采集的田间杂草的种类，采集的田间杂草的带毒率进行拟合性检验，并对历史符合率进行分析[2223]。
2 结果与分析
2.1 大棚番茄ToCV的发病率
通过观察发现，大多数大棚番茄在苗期、花期、结果期均可被ToCV感染（图1）。不同年份番茄均存在较高的发病率（表2）。对田间采摘的大棚番茄样品进行RT-PCR检测，验证了ToCV的侵染。
2.2 烟粉虱数量及带毒率检测
统计发现，2014年-2018年大棚番茄所携带的烟粉虱平均每株数量在18～59头（表3）。每年从采集的样品中随机选取20头进行RT-PCR检测，发现烟粉虱均存在较高的带毒率（65%～95%）（表3）。可以看出，随着烟粉虱数量的增加，烟粉虱带毒率也随之升高。
2.3 烟粉虱种类鉴定
对大棚番茄上采集的烟粉虱进行种类鉴定，提取单头烟粉虱总DNA进行PCR扩增，PCR产物经AseⅠ酶切后，进行电泳检测，得到500 bp和100 bp的两条带，结果表明该地区的烟粉虱均为Q型烟粉虱（图2）。
2.4 田间杂草种类及其带毒率
2014年-2018年每年采集的杂草种类及其带毒率各有不同。可以看出，随着杂草种类的增加，杂草带毒率呈上升趋势（表4）。
2.5 番茄褪绿病毒病预测预报模型的建立
通过总结番茄褪绿病毒病发病率相关资料发现，2014年-2018年，与番茄褪绿病毒病发病率相关的因素可能有：11月份平均每日光照时间、11月份平均温度、11月份平均相对湿度、每株番茄平均烟粉虱数量及其带毒率、田间杂草种类以及带毒率（表5）。
利用2014年-2018年山东寿光11月份番茄褪绿病毒病发生率与各自变量因子在SPSS 21.0中进行相关显著性分析，获得了2个与11月份番茄褪绿病毒病发生率在0.01水平上极显著因子，X4：平均每株烟粉虱数量（头）;X7：田间杂草的带毒率（%）。获取了2个与11月份番茄褪绿病毒病发生率在0.05水平上显著因子，X5：烟粉虱的带毒率;X6：田间杂草的种类数。
利用相关性分析结果进行回归分析，将Y（ToCV发生率）添加到因变量列表，将X4（平均每株烟粉虱数量）、X5（烟粉虱带毒率）、X6（杂草种类数）和X7（杂草带毒率）添加到自变量列表，输出模型汇总表、方差分析表和回归系数表。
由回归系数表可得到回归方程：Y=2.570 0.089X4-7.548X7（R2=0.998）。
2.6 番茄褪绿病毒病预测预报模型的准确度
对相关数据进行拟合性检验，发现回归检测结果历史符合率均在96.8%以上，因而可以作为番茄褪绿病毒病发生程度的预测预报模型（表6）。
1） Y： 11月份番茄褪绿病毒病发生率; X1： 11月份平均每日光照时间; X2： 11月份平均温度; X3： 11月份平均相对湿度; X4： 平均每株番茄上携带的烟粉虱数量; X5： 采集樣品上烟粉虱的带毒率; X6： 采集的田间杂草的种类数; X7： 采集的田间杂草的带毒率。
Y： The incidence of tomato chlorosis virus disease in November; X1： The average daily light time in November; X2： Mean temperature in November; X3： The average relative humidity in November; X4： The average number of Bemisia tabaci carried by each sample; X5： The virus-carrying rate of B.tabaci on the collected samples; X6： The species of weeds collected in the field; X7： The viruliferous rates of weeds collected in the field.
3 讨论 3.1 田间发病规律
关于番茄褪绿病毒病的田间发病规律已有较多的研究[2428]。李娇娇等发现Q型烟粉虱及ToCV的多发季节在秋季，并指出11月上旬之后，日光温室平均温度一般低于20℃，已不利于烟粉虱的繁育与传播，因而病害发生相对较轻[26]。本研究调查发现试验基地的大棚番茄于7月底或者8月初种植，这段时间温度高，空气相对湿度低，有利于番茄幼苗的生长，但同时容易滋生烟粉虱。而在温室中极易存在携带ToCV的烟粉虱，温室外存在携带ToCV的杂草，进而造成了番茄褪绿病毒的传播。ToCV的侵染存在潜伏期，病毒侵染初期植株并没有表现症状，而到11月份，大棚番茄进入发病的高峰期。
3.2 番茄褪绿病毒病发生率与烟粉虱数量的关系
运用SPSS 21.0对各因素进行相关性分析发现，ToCV的发生率与烟粉虱数量呈极显著正相关。此外，调查发现，大棚中的煙粉虱均为Q型，且每株番茄上的烟粉虱均携带病毒。预测预报模型也表明番茄褪绿病毒病的发生率与采集的每株植株上所携带的平均烟粉虱数量在0.01的水平上极显著相关。此结论与李娇娇等[28]的结论有出入，而与代惠洁等[25]报道的结论相似，这可能与地域等自然环境引起的差异有关。因此应在种植早期重视对烟粉虱的防治，从而减轻ToCV的发生。
3.3 番茄褪绿病毒病发生率与杂草带毒率的关系
相关性分析发现，ToCV的发生率除了与烟粉虱数量极显著正相关外，还与田间杂草的带毒率在0.01的水平上极显著正相关。代惠洁等指出番茄定植前需彻底清除棚内及周边杂草，切断可能的毒源有利于番茄褪绿病毒的防控[27]。这与本研究所得结论一致，同时也验证了预测预报模型的准确性。结合预测结果可以发现，田间杂草能够携带并保存ToCV，在温室大棚中，在上一季番茄收获之后，病毒都在杂草中保存，随着烟粉虱的发生，再次侵染新一季的番茄，从而造成病害的循环发生。我们还发现杂草种类越多，ToCV的发生率越高，因此今后有必要调查清楚ToCV的杂草寄主，从而更有针对性地清除杂草，以降低ToCV的发生。
3.4 构建模型的意义
利用SPSS 21.0建立预测预报模型，模拟所得方程为：Y=2.570 0.089X4-7.548X7，其中Y为11月份番茄褪绿病毒病发生率，X4为采集的
番茄上平均每株携带的烟粉虱数量，X7为采集的田间杂草的带毒率，回归检测结果历史符合率为96.8%以上。通过构建烟粉虱传播番茄褪绿病毒病的预测预报模型，明确了番茄褪绿病毒发生过程中的重要影响因子，为预防番茄褪绿病毒病的发生提供了重要依据，有助于及时发现番茄褪绿病毒病并采取相应的预防措施，从而减少其造成的经济损失，实现番茄的高产提质优化。
烟粉虱传播的番茄褪绿病毒病的预测预报模型是在特定的时间、空间条件下采用一定的资料构建出来的模型，可能不具有普遍适用性。不同地区，不同气象因素和不同的生长条件也可能会影响ToCV的发生，还需要进行不断地探索。
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（责任编辑：杨明丽）