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[摘要] 目的 分析老年乙肝（CHB）和乙肝病毒（HBV）相关肝硬化患者外周血辅助性T细胞17（Th17）临床意义，探讨Th17对相关疾病的诊断价值。 方法 将我院收治的老年HBV感染者按病变类型分为CHB组及HBV相关性肝硬化组，另选80例老年健康体检者纳入正常组。比较各组Th17频率、白细胞介素-17（IL-17）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达与分布，探讨Th17、IL-17、α-SMA表达的相关性。 结果 HBV相关肝硬化组Th17频率、IL-17、IL-17 mRNA及α-SMA水平显著高于CHB组，CHB组上述指标显著高于正常组（P<0.05）。CHB组ALT、HBV DNA载量显著高于HBV相关性肝硬化组，而TBIL显著低于后者，两组ALT、TBIL均显著高于正常组（P<0.05）。相关性分析表明，Th17频率与IL-17、α-SMA呈正相关（P<0.05），与ALT、TBIL、HBV DNA载量无明显相关性（P>0.05）。结论 老年肝病患者Th17频率与肝脏炎症程度变化密切关联，检测Th17频率有助于早期明确疾病严重程度，预测病情转归。
[关键词] 乙型肝炎病毒；慢性乙型肝炎；肝硬化；辅助性T细胞17；α-平滑肌肌动蛋白
[中图分类号] R512.62 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2016）26-0037-03
乙型肝炎病毒（HBV）感染导致的慢性乙型肝炎（CHB）是我国常见病、高发病[1]。研究表明，辅助性T细胞17（Th17）可产生大量白细胞介素-17（IL-17），并参与肝脏疾病的发生、发展环节[2]。已有学者证实，Th17细胞频率改变、Th17/调节性T细胞（Treg）比例失衡与多种免疫性疾病的发病密切关联[3]。作为以免疫病理为主要发病机制的疾病，CHB和HBV相关性肝硬化亦可能与Th17细胞频率改变存在一定相关性。老年人群因其肝功能的自然衰减，其肝病转归对其生命健康有着至关重要的影响。基于为老年乙肝及乙肝相关疾病的临床诊治提供高效诊断依据的目的，本文选取我院收治的174例老年HBV感染者及同期80名老年健康体检者，进行了对照研究，现报道如下。
1资料与方法
1.1 一般资料
选择我院2013年10月～2015年10月收治的174例老年HBV感染者，按照其病变类型分为CHB组（n=77）及HBV相关性肝硬化组（n=97），另选同期80健康体检者纳入正常组。CHB组男41例，女36例；年龄65～83岁，平均（69.26±12.37）岁；HBV相关肝硬化组男52例，女45例；年龄67～86岁，平均（68.83±9.26）岁；正常组男42例，女38例；年龄65～85岁，平均（66.94±10.31）岁。各组年龄、性别等比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本临床研究经我院医学伦理委员会批准，受试者均知情同意且自愿参与。
1.2 纳入排除标准
HBV感染者纳入标准：①年龄≥65岁；②参照《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》[4]确诊CHB或HBV相关性肝硬化；③6个月内无抗病毒或免疫调节治疗史；④未合并其他肝炎病毒感染。健康体检者纳入标准：①年龄≥65岁；②无肝炎病史；③HBV血清学标志物检测阴性。排除标准：①年龄<65岁；②合并心、肝、肾等其他重要脏器严重病变；③合并HIV感染、恶性肿瘤患者。
1.3方法
（1）Th17细胞频率：受试者空腹采静脉血3 mL，使用Calibur流式细胞仪（美国BD公司）检测CD4 、IFNγ-、IL17 、IL22-，即为Th17细胞频率[5]。（2）IL-17：取离心血浆以酶免法检测IL-17水平；取肝组织以实时荧光定量PCR检测IL-17 mRNA。（3）α-SMA：取肝组织石蜡包埋标本，以SP法依次切片—脱蜡—水化—修复—一抗、二抗温育—显色—复染—脱水—透明—封片，以PBS代替一抗为空白对照，胞浆呈棕黄色即可判定为阳性细胞[6]，由Image 6.0软件计算平均光密度（AOD）。（4）其他指标：使用C8000生化分析仪（美国雅培公司）检测谷丙转氨酶（ALT）、总胆红素（TBIL）等指标，使用ABI7300型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）检测HBV血清学标志物及HBV DNA载量。
1.4 统计学方法
采用SPSS18.0统计学软件进行统计学分析，计数资料以[n（%）]表示，行χ2检验；计量资料以（x±s）表示，行t检验；采用Pearson法或Spearman法分析Th17细胞频率与ALT、TBIL等其他指标的相关性；P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组Th17细胞频率、IL-17表达水平、α-SMA表达水平比较
HBV相关性肝硬化组Th17细胞频率显著高于CHB组，CHB组Th17细胞频率显著高于正常组（P<0.05）。以正常组肝组织IL-17 mRNA相对表达量为1.00，HBV相关性肝硬化组血浆IL-17、肝组织IL-17 mRNA表达显著高于CHB组，CHB组上述指标显著高于正常组（P<0.05）。HBV相关肝硬化组肝组织α-SMA表达水平显著高于CHB组，CHB组肝组织α-SMA表达水平显著高于正常组（P<0.05）。见表1。
2.2 各组受试者其他指标比较
CHB组ALT、HBV DNA载量显著高于HBV相关肝硬化组，而TBIL显著低于后者，两组患者ALT、TBIL均显著高于正常组（P<0.05）。见表2。
2.3 Th17细胞频率与各项指标的相关性
相关性分析示：Th17细胞频率与IL-17、α-SMA呈正相关（P<0.05），与ALT、TBIL、HBV DNA载量无明显相关性（P>0.05）。见表3。 3 讨论
CHB的主要特征为肝脏慢性炎症与继发性纤维化，过往观点认为，CHB患者机体对HBV清除能力的不足是导致HBV感染慢性化的主要原因，其免疫机制与Th1和Th2免疫应答失调有一定关联[7]。最新研究表明，CHB患者外周血Th1细胞比例与健康人群无明显差别，且与疾病严重程度亦无较大关联，提示HBV感染的慢性化过程并非仅受单一因素影响，可能存在其他免疫机制影响肝脏损伤进程[8]。
作为一种具有促炎作用的CD4 T淋巴细胞亚群，Th17可促进IL-17等炎症介质分泌，近年来大量研究证实了Th17在自身免疫性疾病、肿瘤及感染性疾病发生与转归中扮演的重要角色[9]。本研究结果示：HBV相关性肝硬化组外周血Th17细胞频率显著高于CHB组，CHB组外周血Th17细胞频率显著高于正常组，说明随着HBV感染者肝脏损伤程度的加剧，其Th17细胞频率逐渐上升。与此同时，受试者IL-17、IL-17 mRNA变化呈现相同趋势。IL-17是Th17分泌的最重要效应因子，其受体在体内有广泛表达，IL-17可诱导IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、趋化因子表达增加，促进局部炎症细胞浸润与组织损伤[10]。相关性分析发现，外周血Th17细胞频率与IL-17表达水平呈正相关，表明Th17可通过促进IL-17表达，在肝脏损伤的发生、发展中发挥重要作用。
肝星状细胞（HSC）激活是HBV相关肝硬化的主要病理特征，主要由长期进行性、弥漫性肝损害导致，这一过程的标志为α-SMA高表达[11]。本次研究中随着肝损伤的加重，肝组织α-SMA表达水平逐渐增高，印证了上述结论。同时，本研究提示外周血Th17细胞频率与肝组织α-SMA表达亦呈正相关，与郑超等[12]研究结论一致，表明Th17细胞亦参与了α-SMA高表达改变过程，考虑与Th17细胞可能参与HSC激活有关[13]。
有学者发现，外周血Th17细胞频率与血清ALT呈一定相关性[14]，但本研究结果示，外周血Th17与ALT、TBIL、HBV DNA载量均无明显相关性，与上述研究结论存在一定出入，考虑与本研究CHB患者多处于轻度阶段，Th17细胞频率与ALT等肝功能指标变化的关联性不够明显有关。此外，Hobbs等[15]指出，肝损伤部位Th17细胞聚集增多，且其聚集程度与炎症状态呈正相关，其原因为HBV抗原诱导及细胞坏死后大量细胞因子激活Th17细胞并进一步促进免疫反应。因此，针对Th17细胞的靶向调节有望为CHB及HBV相关性肝硬化的治疗提供新的策略。
综上所述，随着CHB及HBV相关性肝硬化患者肝损伤程度的加剧，其外周血Th17细胞频率显著上升，Th17细胞诱导的IL-17与α-SMA分泌可能是导致肝损伤发生、发展的主要原因，故定期检测Th17细胞频率有望早期判断疾病严重程度，为患者病情的控制提供参考。
[参考文献]
[1] 鲍旭丽，渠亚超，闾军. 慢性乙型肝炎抗病毒及免疫调节治疗研究进展[J]. 中国中西医结合消化杂志，2016， 24（6）：484-487.
[2] 金磊，张纪元，孙红启，等. Th17 细胞在乙肝肝硬化患者中的免疫致病机制研究[J]. 解放军医学杂志，2013，38（1）：62-65.
[3] 耿霄，张蓓，周文超，等. 慢性乙型肝炎患者外周血Th17细胞/调节性T细胞比值变化的意义[J]. 细胞与分子免疫学杂志，2014，30（12）：1304-1306.
[4] 中华医学会肝病学分会. 慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）[J]. 临床肝胆病杂志，2011，16（1）：1-12.
[5] 王爱珍，彭国平. 慢性乙肝患者外周血 Treg/Th17 及相关细胞因子的变化[J]. 中国现代医生，2013，51（4）：108-110.
[6] Talele N，Fradette J，Davies J，et al. Expression of α-smooth muscle actin determines the fate of mesenchymal stromal cells[J]. Stem Cell Reports，2015，4（6）：1016-1030.
[7] 刘艳琼，杨小安，邹勇，等. 慢乙肝患者外周血中 Th17 细胞趋化因子受体的表达水平[J]. 中华实验和临床病毒学杂志，2014，28（3）：161-163.
[8] 黄传钟，李洁羽，陈淑萍，等. IL-2，IL-4，IL-6，IFN-γ，IL-17A 在肝癌组织中表达及其与乙肝病毒感染的关系[J]. 中国免疫学杂志，2015，31（4）：527-530.
[9] 饶少锋，冯霞，游晶，等. Th17/Treg细胞及其失衡在乙型肝炎致病机制中的作用[J]. 现代生物医学进展，2015，15（19）：3773-3376.
[10] 陈和敏，申婷，游晶，等. Th17细胞的分化、调节及其主要细胞因子和功能[J]. 现代生物医学进展，2015，15（1）：191-194.
[11] 林伟研，倪进东，唐豪，等. Th17 细胞因子 IL-17A 与乙肝疫苗无/弱应答关联的研究[J]. 实用预防医学，2014， 21（8）： 904-905.
[12] 郑超，张鑫，周振华，等. Th17 的分化及其相关细胞因子在慢乙肝中变化及意义[J]. 世界最新医学信息文摘（电子版），2015，15（20）：25-26.
[13] 陈梅，郭晓云，姜海行，等. Th17细胞在乙型肝炎病毒相关性肝病中的表达及意义[J]. 重庆医学，2016，45（5）：592-594.
[14] 邓永佳，张房英，赖小丽. Th17细胞与Treg细胞在HBV感染患者中的检测意义[J]. 肝脏，2015，20（11）：858-861.
[15] Hobbs BD，Hersh CP. Integrative genomics of chronic obstructive pulmonary disease[J]. Biochemical
[关键词] 乙型肝炎病毒；慢性乙型肝炎；肝硬化；辅助性T细胞17；α-平滑肌肌动蛋白
[中图分类号] R512.62 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2016）26-0037-03
乙型肝炎病毒（HBV）感染导致的慢性乙型肝炎（CHB）是我国常见病、高发病[1]。研究表明，辅助性T细胞17（Th17）可产生大量白细胞介素-17（IL-17），并参与肝脏疾病的发生、发展环节[2]。已有学者证实，Th17细胞频率改变、Th17/调节性T细胞（Treg）比例失衡与多种免疫性疾病的发病密切关联[3]。作为以免疫病理为主要发病机制的疾病，CHB和HBV相关性肝硬化亦可能与Th17细胞频率改变存在一定相关性。老年人群因其肝功能的自然衰减，其肝病转归对其生命健康有着至关重要的影响。基于为老年乙肝及乙肝相关疾病的临床诊治提供高效诊断依据的目的，本文选取我院收治的174例老年HBV感染者及同期80名老年健康体检者，进行了对照研究，现报道如下。
1资料与方法
1.1 一般资料
选择我院2013年10月～2015年10月收治的174例老年HBV感染者，按照其病变类型分为CHB组（n=77）及HBV相关性肝硬化组（n=97），另选同期80健康体检者纳入正常组。CHB组男41例，女36例；年龄65～83岁，平均（69.26±12.37）岁；HBV相关肝硬化组男52例，女45例；年龄67～86岁，平均（68.83±9.26）岁；正常组男42例，女38例；年龄65～85岁，平均（66.94±10.31）岁。各组年龄、性别等比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本临床研究经我院医学伦理委员会批准，受试者均知情同意且自愿参与。
1.2 纳入排除标准
HBV感染者纳入标准：①年龄≥65岁；②参照《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》[4]确诊CHB或HBV相关性肝硬化；③6个月内无抗病毒或免疫调节治疗史；④未合并其他肝炎病毒感染。健康体检者纳入标准：①年龄≥65岁；②无肝炎病史；③HBV血清学标志物检测阴性。排除标准：①年龄<65岁；②合并心、肝、肾等其他重要脏器严重病变；③合并HIV感染、恶性肿瘤患者。
1.3方法
（1）Th17细胞频率：受试者空腹采静脉血3 mL，使用Calibur流式细胞仪（美国BD公司）检测CD4 、IFNγ-、IL17 、IL22-，即为Th17细胞频率[5]。（2）IL-17：取离心血浆以酶免法检测IL-17水平；取肝组织以实时荧光定量PCR检测IL-17 mRNA。（3）α-SMA：取肝组织石蜡包埋标本，以SP法依次切片—脱蜡—水化—修复—一抗、二抗温育—显色—复染—脱水—透明—封片，以PBS代替一抗为空白对照，胞浆呈棕黄色即可判定为阳性细胞[6]，由Image 6.0软件计算平均光密度（AOD）。（4）其他指标：使用C8000生化分析仪（美国雅培公司）检测谷丙转氨酶（ALT）、总胆红素（TBIL）等指标，使用ABI7300型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）检测HBV血清学标志物及HBV DNA载量。
1.4 统计学方法
采用SPSS18.0统计学软件进行统计学分析，计数资料以[n（%）]表示，行χ2检验；计量资料以（x±s）表示，行t检验；采用Pearson法或Spearman法分析Th17细胞频率与ALT、TBIL等其他指标的相关性；P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组Th17细胞频率、IL-17表达水平、α-SMA表达水平比较
HBV相关性肝硬化组Th17细胞频率显著高于CHB组，CHB组Th17细胞频率显著高于正常组（P<0.05）。以正常组肝组织IL-17 mRNA相对表达量为1.00，HBV相关性肝硬化组血浆IL-17、肝组织IL-17 mRNA表达显著高于CHB组，CHB组上述指标显著高于正常组（P<0.05）。HBV相关肝硬化组肝组织α-SMA表达水平显著高于CHB组，CHB组肝组织α-SMA表达水平显著高于正常组（P<0.05）。见表1。
2.2 各组受试者其他指标比较
CHB组ALT、HBV DNA载量显著高于HBV相关肝硬化组，而TBIL显著低于后者，两组患者ALT、TBIL均显著高于正常组（P<0.05）。见表2。
2.3 Th17细胞频率与各项指标的相关性
相关性分析示：Th17细胞频率与IL-17、α-SMA呈正相关（P<0.05），与ALT、TBIL、HBV DNA载量无明显相关性（P>0.05）。见表3。 3 讨论
CHB的主要特征为肝脏慢性炎症与继发性纤维化，过往观点认为，CHB患者机体对HBV清除能力的不足是导致HBV感染慢性化的主要原因，其免疫机制与Th1和Th2免疫应答失调有一定关联[7]。最新研究表明，CHB患者外周血Th1细胞比例与健康人群无明显差别，且与疾病严重程度亦无较大关联，提示HBV感染的慢性化过程并非仅受单一因素影响，可能存在其他免疫机制影响肝脏损伤进程[8]。
作为一种具有促炎作用的CD4 T淋巴细胞亚群，Th17可促进IL-17等炎症介质分泌，近年来大量研究证实了Th17在自身免疫性疾病、肿瘤及感染性疾病发生与转归中扮演的重要角色[9]。本研究结果示：HBV相关性肝硬化组外周血Th17细胞频率显著高于CHB组，CHB组外周血Th17细胞频率显著高于正常组，说明随着HBV感染者肝脏损伤程度的加剧，其Th17细胞频率逐渐上升。与此同时，受试者IL-17、IL-17 mRNA变化呈现相同趋势。IL-17是Th17分泌的最重要效应因子，其受体在体内有广泛表达，IL-17可诱导IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、趋化因子表达增加，促进局部炎症细胞浸润与组织损伤[10]。相关性分析发现，外周血Th17细胞频率与IL-17表达水平呈正相关，表明Th17可通过促进IL-17表达，在肝脏损伤的发生、发展中发挥重要作用。
肝星状细胞（HSC）激活是HBV相关肝硬化的主要病理特征，主要由长期进行性、弥漫性肝损害导致，这一过程的标志为α-SMA高表达[11]。本次研究中随着肝损伤的加重，肝组织α-SMA表达水平逐渐增高，印证了上述结论。同时，本研究提示外周血Th17细胞频率与肝组织α-SMA表达亦呈正相关，与郑超等[12]研究结论一致，表明Th17细胞亦参与了α-SMA高表达改变过程，考虑与Th17细胞可能参与HSC激活有关[13]。
有学者发现，外周血Th17细胞频率与血清ALT呈一定相关性[14]，但本研究结果示，外周血Th17与ALT、TBIL、HBV DNA载量均无明显相关性，与上述研究结论存在一定出入，考虑与本研究CHB患者多处于轻度阶段，Th17细胞频率与ALT等肝功能指标变化的关联性不够明显有关。此外，Hobbs等[15]指出，肝损伤部位Th17细胞聚集增多，且其聚集程度与炎症状态呈正相关，其原因为HBV抗原诱导及细胞坏死后大量细胞因子激活Th17细胞并进一步促进免疫反应。因此，针对Th17细胞的靶向调节有望为CHB及HBV相关性肝硬化的治疗提供新的策略。
综上所述，随着CHB及HBV相关性肝硬化患者肝损伤程度的加剧，其外周血Th17细胞频率显著上升，Th17细胞诱导的IL-17与α-SMA分泌可能是导致肝损伤发生、发展的主要原因，故定期检测Th17细胞频率有望早期判断疾病严重程度，为患者病情的控制提供参考。
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[1] 鲍旭丽，渠亚超，闾军. 慢性乙型肝炎抗病毒及免疫调节治疗研究进展[J]. 中国中西医结合消化杂志，2016， 24（6）：484-487.
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[4] 中华医学会肝病学分会. 慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）[J]. 临床肝胆病杂志，2011，16（1）：1-12.
[5] 王爱珍，彭国平. 慢性乙肝患者外周血 Treg/Th17 及相关细胞因子的变化[J]. 中国现代医生，2013，51（4）：108-110.
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[7] 刘艳琼，杨小安，邹勇，等. 慢乙肝患者外周血中 Th17 细胞趋化因子受体的表达水平[J]. 中华实验和临床病毒学杂志，2014，28（3）：161-163.
[8] 黄传钟，李洁羽，陈淑萍，等. IL-2，IL-4，IL-6，IFN-γ，IL-17A 在肝癌组织中表达及其与乙肝病毒感染的关系[J]. 中国免疫学杂志，2015，31（4）：527-530.
[9] 饶少锋，冯霞，游晶，等. Th17/Treg细胞及其失衡在乙型肝炎致病机制中的作用[J]. 现代生物医学进展，2015，15（19）：3773-3376.
[10] 陈和敏，申婷，游晶，等. Th17细胞的分化、调节及其主要细胞因子和功能[J]. 现代生物医学进展，2015，15（1）：191-194.
[11] 林伟研，倪进东，唐豪，等. Th17 细胞因子 IL-17A 与乙肝疫苗无/弱应答关联的研究[J]. 实用预防医学，2014， 21（8）： 904-905.
[12] 郑超，张鑫，周振华，等. Th17 的分化及其相关细胞因子在慢乙肝中变化及意义[J]. 世界最新医学信息文摘（电子版），2015，15（20）：25-26.
[13] 陈梅，郭晓云，姜海行，等. Th17细胞在乙型肝炎病毒相关性肝病中的表达及意义[J]. 重庆医学，2016，45（5）：592-594.
[14] 邓永佳，张房英，赖小丽. Th17细胞与Treg细胞在HBV感染患者中的检测意义[J]. 肝脏，2015，20（11）：858-861.
[15] Hobbs BD，Hersh CP. Integrative genomics of chronic obstructive pulmonary disease[J]. Biochemical