【摘 要】
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目的探索利用HCoV-OC43感染性克隆表达外源基因的可行性及插入区域。方法在HCoV-OC43全长感染性克隆pBAC-OC43FL的基础上，利用融合PCR和酶切连接等方法，成功构建了在3个不同位置插入绿色荧光蛋白报告基因(GFP替换NS2基因或NS12.9基因以及插入N基因后)的重组质粒，利用反向遗传学操作技术进行病毒拯救，通过免疫荧光、Western blot和病毒感染等试验对重组病毒进行鉴定
【机 构】
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102206 北京，中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所，应急技术中心,102206 北京，中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所，应急技术中心,102206 北京，中国疾病预防控制中心 病毒病预防
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目的探索利用HCoV-OC43感染性克隆表达外源基因的可行性及插入区域。
方法在HCoV-OC43全长感染性克隆pBAC-OC43FL的基础上，利用融合PCR和酶切连接等方法，成功构建了在3个不同位置插入绿色荧光蛋白报告基因(GFP替换NS2基因或NS12.9基因以及插入N基因后)的重组质粒，利用反向遗传学操作技术进行病毒拯救，通过免疫荧光、Western blot和病毒感染等试验对重组病毒进行鉴定分析。
结果GFP替换NS2或NS12.9基因的感染性克隆可以成功拯救出重组病毒(OC43-GFPΔNS2和OC43-GFPΔNS12.9)，其中OC43-GFPΔNS2在感染BHK-21细胞后能够观察到GFP基因的高效表达，OC43-GFPΔNS12.9在感染细胞后仅有少量GFP基因的表达，而GFP插入N基因后的感染性克隆未能拯救出病毒。
结论NS2基因可以作为HCoV-OC43感染性克隆表达外源基因的插入位点，并且外源基因插入至该位点可获得稳定高效表达，为进一步研究HCoV-OC43的复制规律及研发基于HCoV-OC43的冠状病毒载体提供了参考依据。
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